Summary
نشاط الخلايا العصبية واحد من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين الكبار يمكن دراستها عن طريق الفصل بين الخلايا العصبية من مناطق محددة في الدماغ واستخدام الغشاء الفلورسنت التصوير صبغ المحتملة. من خلال ردود اختبار للتغيرات في الجلوكوز، وهذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة حساسية الجلوكوز من الخلايا العصبية الكبار طائي بطني إنسي.
Abstract
وغالبا ما يتم إجراء دراسات من نشاط الخلايا العصبية باستخدام الخلايا العصبية من القوارض أقل من 2 شهرا من العمر بسبب الصعوبات التقنية المرتبطة بزيادة النسيج الضام، وانخفضت قابلية الخلايا العصبية التي تحدث مع التقدم في العمر. هنا، نحن تصف منهجية لتفكك الخلايا العصبية طائي صحية من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين الكبار. القدرة على دراسة الخلايا العصبية من الفئران البالغات من العمر يسمح باستخدام نماذج المرض التي تظهر في سن متأخرة، وربما يكون أكثر دقة تنمويا للدراسات معينة. التصوير مضان من الخلايا العصبية فصلها يمكن استخدامها لدراسة النشاط من السكان من الخلايا العصبية، بدلا من استخدام الكهربية لدراسة الخلايا العصبية واحدة. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند دراسة السكان غير متجانسة في الخلايا العصبية التي نوع الخلايا العصبية المرجوة أمر نادر الحدوث مثل الجلوكوز الاستشعار عن الخلايا العصبية طائي. نحن استخدام غشاء المحتملة التصوير صبغ الخلايا العصبية الكبار طائي بطني إنسي لدراسة ردودهم على تشاnges في الجلوكوز خارج الخلية. ويعتقد أن الخلايا العصبية الجلوكوز الاستشعار للعب دور في التنظيم المركزي لتوازن الطاقة. القدرة على دراسة استشعار الجلوكوز في القوارض الكبار مفيد بشكل خاص منذ هيمنة الأمراض المتصلة توازن الطاقة المختلة وظيفيا (على سبيل المثال. السمنة) تزيد مع تقدم العمر.
Introduction
الدماغ وينظم توازن الطاقة من خلال الغدد الصم العصبية والجهاز العصبي اللاإرادي. ما تحت المهاد بطني إنسي (VMH)، التي تتألف من نواة بطني إنسي (VMN) والنواة المقوسة (ARC)، المهم لتنظيم المركزي للتوازن الطاقة. الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز المتخصصة، ضمن VMH، ربط نشاط الخلايا العصبية الطرفية والجلوكوز التوازن 1. هناك نوعان من السكر في الخلايا العصبية الاستشعار؛ الجلوكوز متحمس (GE) زيادة الخلايا العصبية في حين الجلوكوز مستعمل (GI) الخلايا العصبية تقليل نشاطهم مع زيادة الجلوكوز خارج الخلية. يتم دراسة الخلايا العصبية VMH الجلوكوز الاستشعار عن بعد باستخدام عموما الكهربية أو الكالسيوم / غشاء المحتملة التصوير صبغة حساسة.
تعتبر تقنية المشبك التصحيح الكهربية ليكون المعيار الذهبي في دراسة خارج الحي نشاط الخلايا العصبية. في هذه التقنية، يتم إرفاق micropipette الزجاج الكهربائي لغشاء الخلية عن طريق مقاومة عالية(GΩ) الختم. أقطاب التصحيح المشبك السماح تسجيل الوقت الحقيقي من عمل محتمل تردد (الشبك الحالية) أو تصرف أيون (المشبك الجهد) التغييرات داخل الخلايا العصبية واحدة. بينما توفر تقنية المشبك التصحيح معلومات مفصلة بشأن التغييرات في المواصلة محددة القناة الايونية، والعيب الرئيسي هو أن الخلايا العصبية واحد فقط قد لوحظ في وقت واحد. يستغرق حوالي 30-45 دقيقة من تسجيل واحد للتحقق من أن يتم تسجيل من الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز حتى قبل البدء في العلاج التجريبي محددة. علاوة على ذلك، GI وGE الخلايا العصبية تتكون <20٪ من مجموع السكان العصبية VMH. مما يضاعف هذه المسألة هو عدم وجود، في العديد من الحالات، من علامة الخلوية لتحديد هذه الخلايا العصبية. وبالتالي، فمن الواضح أنه على الرغم من توفير المعلومات الكهربائية القيمة التي تقنيات أخرى لا يمكن، تحليل المشبك التصحيح شاقة، تستغرق وقتا طويلا والعائد المنخفض.
استخدام التصوير مضان من الخلايا العصبية VMH فصلها يسمح لدراسة جين تاوndreds من الخلايا العصبية في وقت واحد. الأصباغ الحساسة الكالسيوم يمكن استخدامها لقياس التغيرات الكالسيوم داخل الخلايا، والتي ترتبط بشكل غير مباشر للتغيرات في نشاط الخلايا العصبية. وتستخدم الأصباغ الحساسة غشاء المحتملة لرصد التغيرات المحتملة الغشاء. قياس إمكانات الغشاء الخلوي هو مؤشر أكثر مباشرة من نشاط الخلايا العصبية مقارنة للتغيرات في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. علاوة على ذلك، غشاء المحتملة صبغة (MPD) التصوير يحتمل بالكشف عن التغيرات الصغيرة في غشاء المحتملة حيث لا يتم تبديل عمل اطلاق النار المحتملة، وربما لا تغيير مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. كل من هذه تقنيات التصوير مضان وقد استخدمت لدراسة الخلايا العصبية VMH الاستشعار الجلوكوز من الفئران الأحداث 2-7. بينما النتائج هي أقل تفصيلا من تلك التي حصلنا عليها مع المشبك التصحيح الكهربية، وقوة من تجارب التصوير هو أنها تقيم في الوقت نفسه عدد كبير من الخلايا التي تشمل حتما عدد كبير من الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز. MPD ط التصويرق مفيدة بشكل خاص لدراسة الخلايا العصبية التي هي GI المترجمة في جميع أنحاء VMH بأكمله أكثر توحيدا، وبالتالي توفير السكان الكافية للدراسة في VMH فصلها (~ 15٪ GI). في المقابل، حين تكون مترجمة الخلايا العصبية GE المكتظة إلى بطناني-VMN وخلية المنطقة الفقيرة بين مركز البحوث الزراعية وVMN، فإنها لا تمثل عددا كبيرا من الخلايا العصبية داخل VMH (<1٪ GE). علاوة على ذلك، من خلال دراسة الخلايا العصبية معزولة، يتم استبعاد نجمي والآثار قبل المشبكي. هذا يمكن أن يكون ميزة في دراسة الآثار الأولى أجل الخلايا العصبية، فضلا عن وضع غير مؤات حيث يتم فقدان اتصالات والعمليات الفيزيولوجية.
وهناك عامل يحد في كل الكهربية المشبك التصحيح وMPD / التصوير الكالسيوم صبغ هو الحاجة إلى استخدام الحيوانات الأصغر سنا (على سبيل المثال. الفئران أو الجرذان <8 أسابيع من العمر). هذا هو في الغالب بسبب زيادة النسيج الضام في تركيبة مع انخفاض قابلية الخلايا العصبية الذي يحدث مع تقدم العمر. في الدماغ شريحة الكهربية عشيقالمنشأ، وزيادة الأنسجة الضامة يجعل الأمر أكثر صعوبة لتصور الخلايا العصبية. زيادة النسيج الضام أيضا يجعل من الصعب فصل عدد كبير من الخلايا العصبية السليمة للدراسات التصوير. علاوة على ذلك، الخلايا العصبية من الحيوانات الأصغر يعيش لفترة أطول خلال إما تسجيل المشبك التصحيح أو التصوير. ومع ذلك، فإن استخدام الفئران الشابة يمكن أن يكون وجود قيود كبيرة. نشاط الخلايا العصبية و / أو الردود على الناقلات العصبية أو المواد الغذائية المتداولة تغيير مع تقدم العمر. على سبيل المثال، منذ يرتبط ارتباطا وثيقا توازن الطاقة الحالة الإنجابية، وتنظيم الخلايا العصبية طائي توازن الطاقة قد تستجيب بشكل مختلف في مرحلة ما قبل مباراة الحيوانات تال للبلوغ. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأمراض تتطلب المعالجة على المدى الطويل أو لا تظهر حتى مرحلة البلوغ. الأمثلة على هذه الأمراض هي السمنة الغذائية أو السكري من النوع 2 السكري. ويعتقد أن الخلايا العصبية منذ الاستشعار الجلوكوز لتلعب دورا في هذه الأمراض وضعنا منهجية لزراعة الخلايا العصبية بنجاح صحية الكبار VMH لاستخدامها في التصوير إكسب MPDeriments.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جماعة من الحيوان
- تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام في جامعة الطب وطب الأسنان في نيوجيرسي.
- البيت مجموعة الذكور C57BL / 6 الفئران على 12 ساعة الجدول الزمني الظلام ساعة light/12 والسماح بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية الوصول إلى الماء والغذاء. التضحية في 4-5 أشهر من العمر. تم تنفيذ القتل الرحيم من الفئران باستخدام الطائرة الجراحية التخدير وشكل الثانوية من القتل الرحيم (أي اختراق شق في تجويف الصدر من خلال الحجاب الحاجز). وهذا يتفق مع المبادئ التوجيهية اخر احصاء حول القتل الرحيم.
2. إعداد الإرواء الحل، Coverslips، الماصات الزجاج، وسائل الإعلام
- جعل الحل نضح 1L تتكون من 2.5 ملي بوكل، 7 ملم MgCl 2، 1.25 ملي ناه 2 ص 4، 28 مم 3 NaHCO، 0.5 مم CaCl 2 و 7 ملي الجلوكوز، 1 ملم أسكوربات، و 3 ملي البيروفات في المقطر درهم 2 O. ضبط الأسمولية إلى ~ 300 الميلي أسمول باستخدام ما يقرب من 80 جرام / لتر السكروز. الأوكسجين من قبل محتدما مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. وسوف تتطلب كل تجربة ما يقرب من 200 مل من محلول الارواء. ويمكن تخزين aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
- جعل 250 مل تحتوي على وسائل الإعلام Neurobasal الأسهم Neurobasal دون الجلوكوز، 2.5 ملي الجلوكوز، و 100 U / مل البنسلين الستربتوميسين. ضبط الأسمولية من الأسهم Neurobasal إلى 280 الميلي أسمول باستخدام السكروز. جعل 500 مل تحتوي على إسبات الأسهم إسبات-A وسائل الاعلام دون الجلوكوز، 2.5 ملي الجلوكوز، و 100 U / مل البنسلين الستربتوميسين.
- يحرك كل من الأسهم وكذلك فلتر تعقيم باستخدام Stericup حدات تصفية فراغ. يجب الحرص على عدم إدخال الجلوكوز أو غيرها من الملوثات من خلال الأواني الزجاجية أو ضجة القضبان. التفاف زجاجات في احباط لحماية وسائل الإعلام من الضوء وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
- لهب نصائح من 4 الماصات الزجاج تعقيمها (9 في) بحيث نصائح توجد الصغرىبأقطار حادة nger وفتح كبيرة (~ 0.9 ملم)، متوسطة كبيرة (~ 0.7 مم) ومتوسطة (~ 0.5 ملم)، والصغيرة (~ 0.3 ملم). أكبر ينبغي بالكاد مصقول وأصغر يجب أن يكون نحو ثلث هذا القطر.
- في اليوم قبل الخلايا العصبية الحصاد، نظيفة أربعة coverslips الزجاج 25 ملم باستخدام الايثانول 70٪ ويمر أكثر من لهب الموقد بنسن. وضع كل ساترة في العقيمة 35 ملم صحن الثقافة وإضافة 2 مل العقيمة 1٪ بولي-D-يسين في DH 2 O. وضع الأطباق في الحاضنة (37 درجة مئوية) بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وغسل العقيمة مع DH 2 O 3x وتسمح coverslips لتجف تماما.
- جعل مأخوذة 75 ميكرولتر من 1 حمض اللبنيك M و 200 ميكرولتر مأخوذة من GlutaMAX؛ تخزينها في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد تماما مأخوذة من حمض اللاكتيك وGlutaMAX قبل استخدامها لضمان التجانس.
- في اليوم من الخلايا العصبية الحصاد، وجعل 30 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة تتكون من السبات-A الأسهم التي تحتوي على حمض اللبنيك 1MM، 0.5MM GlutaMAX، و 2٪ B27 دون الانسولين. فوrtex وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
- وضع 10 مل من وسائل الإعلام والثقافة في طبق بتري 60 مم الزجاج على الجليد، ووضع 2 مل في أنبوب 15 مل المخروطية على الجليد والحفاظ على وسائل الإعلام تبقى في درجة حرارة الغرفة.
- في اليوم من الخلايا العصبية الحصاد، وجعل 25 مل من وسائط النمو الطازجة التي تتكون من الأسهم Neurobasal تحتوي على 1 ملم حمض اللبنيك، 0.5 ملي GlutaMAX، و 2٪ B27 دون الانسولين. دوامة وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم. السماح لوسائل الإعلام نمو جديدة للتوازن في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة على الأقل.
3. الإرواء القلب
- ذوبان الجليد بشكل كامل 200 مل من محلول الارواء والأوكسجين مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- غسل شفرة vibratome مع الأسيتون، 70٪ من الإيثانول، وDH 2 O. وضع شفرة في vibratome.
- شطف vibratome تبريد الغرفة ونضح أنابيب مع DH 2 O. ملء غرفة التبريد (4 ° C) مع الحل نضح والاستمرار في الأوكسجين.
- تخدير الفأر مع بنتوباربيتال الصوديوم 50 ملغ / مل، مخففة 1:01 مع الماء المعقم، حقن الغشاء البريتونى. تحقق الفأر هو تخدير كامل من معسر الذيل ومراقبة أي رد.
- صب محلول الارواء البارد إلى الخزان والأنابيب نضح فقط قبل تشريح. انقاذ 20-30 مل لتشريح الدماغ والاستمرار في الأوكسجين على الجليد. تدفق خطورة من ارتفاع حقنة 60 مل من خلال أنابيب و20 G إبرة يوفر تدفق كافية. يسمح الحل لتشغيل حتى يتم غسلها فقاعات الهواء خارج. تواصل الأوكسجين.
- تقليص الجلد فوق القفص الصدري من الفأرة. رفع القفص الصدري وجعل بعناية خفض الأفقي من خلال الحجاب الحاجز. جعل اثنين من التخفيضات الوحشي من خلال القفص الصدري حتى تجاه الأسلحة لفضح القلب. استخدام ملقط لابعاد القفص الصدري.
- جعل الصغيرة خفض 2 مم في الأذين الأيمن لتوفير نقطة خروج للدم لتغسلها من vascuنظام لار.
- ثقب البطين الأيسر مع إبرة نضح، ما يكفي لإدراج افتتاح الإبرة. عقد الإبرة في مكان مع يد واحدة وبدء تدفق الحل نضح مع جهة أخرى. بعد 10-15 مل من محلول الارواء، وينبغي غسل الدم من النفايات السائلة وسوف مسح.
4. الدماغ التقطيع وتشريح
- بعد نضح القلب، ونقل الاوكسيجين حل التروية الباردة إلى طبق بتري على الجليد فقط قبل استخدامها.
- قطع رأس بسرعة، وإزالة الدماغ من الجمجمة والدماغ في وضع حل الارواء. لإزالة الدماغ: سحب الجلد إلى الأمام، وجعل قطع خط الوسط في الجمجمة نحو تجويف العين، وجعل التخفيضات 2 الوحشي تجاه كل عين، واستخدام الملقط لسحب كل جانب من الجمجمة، وجعل قطع الاكليلية بين تجويف العين، و استخدام ملعقة لاقناع بلطف الدماغ للخروج الى حل الارواء. استخدام مقص لقطع مساحات البصرية إذا لزم الأمر. لا للمس مهادمنطقة ج ولا سحب مساحات البصرية لأن هذا يضع الكثير من الضغط على سماحة وسيطة والأنسجة الكامنة تحت المهاد البصري.
- استخدام شفرة حلاقة وإبرة لخفض أفقيا أنسجة المخ حوالي 3 ملم الخلفي والأمامي لمنطقة ما تحت المهاد في حين غمرت الأنسجة (bregma -3.52 مم). من المهم بصفة خاصة لخفض الجانب الأمامي ليكون مستوى بحيث الدماغ سيجلس على التوالي على تشوك vibratome.
- إزالة أنسجة المخ المتبقية من الحل واستخدام ورق الترشيح لالفتيل بعيدا حل من قسم المخ التي شنت.
- وضع لمسة من الغراء عظمى على تشوك vibratome ونشر الغراء لحجم الدماغ. وضع أنسجة المخ على الجزء العلوي من الغراء مع الجانب الأمامي لأسفل وتحت المهاد التي تواجه النصل. الفتيل الغراء الزائد بعيدا ووضع تشوك في غرفة التبريد vibratome. توخي الحذر بعدم ترك الكثير من الغراء لأنها سوف فقاعة في كل أنحاء الدماغ عند وضعها في الحل.
- مع vibratomه تعيين إلى سرعة بطيئة (مستوى 2) والسعة العالية (مستوى 9)، وجعل 300-500 ميكرون شرائح حتى تصل إلى منطقة تحت المهاد البصري. الآن جعل رقيقة 100 ميكرون شرائح قطع من الخلفية إلى الأمامية. العظة البصرية هي كما يلي. الخلفي لمنطقة ما تحت المهاد والبطين الثالث تكون صغيرة جدا (bregma -2.70 -2.30 إلى مم). في bregma -2.30 مم، يتم فصل البطين الثالث في ظهري وبطني المقاطع على شريحة الاكليلية.
- مرة واحدة أقسام فتيل البطين الثالث، وجعل اثنين من شرائح 500 ميكرون والتي سوف تحتوي المنطقة الصحيح للVMH (bregma -2.18 -1.22 إلى مم). الأمامي إلى VMH، البطين الثالث لم يعد يمتد إلى الطابق بطني من الدماغ (bregma -1.06 -0.82 إلى) 8.
- نقل هذه الشرائح إلى طبق بتري تحتوي على الجليد سائل الإعلام والثقافة. تشريح VMH (VMN + ARC) كما هو مبين في الشكل 1. استخدام ماصة لنقل بلطف القطع VMH في 2 مل من وسائل الإعلام والثقافة على الجليد.
5. التفكك والثقافة
- إزالة VMH من الجليد ووضع في درجة حرارة الغرفة. إضافة 20 U / مل غراء إلى 4 مل من وسائل الإعلام الثقافة. عكس لخلط ومكان في 34 ° C حمام الماء. فحص وتخلط بواسطة قلب كل دقيقة حتى وسائل الاعلام لم يعد الهضم غائم. تصفية (0.22 ميكرون) في قارورة معقمة ونقل الأنسجة إلى وسائل الإعلام الهضم.
- هضم الأنسجة التي تهز عند 100 دورة في الدقيقة في 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إعداد 1 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على 8٪ ألبومين المصل البقري (BSA) أثناء عملية الهضم. حل 80 ملغ BSA في 1 مل من وسائل الإعلام والثقافة، ومرشح (0.22 ميكرون) في أنبوب مخروطي.
- غسل الأنسجة عن طريق نقل إلى 5 مل من وسائل الإعلام والثقافة في أنبوب مخروطي الشكل وببطء قلب مرة واحدة.
- إضافة 30 ميكرولتر انزيم الدناز إلى 6 مل من وسائل الإعلام والثقافة، وخلط لجعل وسائل الإعلام سحن. نضح وسائل الإعلام غسل وإضافة 3 مل من وسائل الإعلام سحن.
- استخدام ماصات زجاجية ليسحن في ترتيب لargest إلى أصغر. يسحن بلطف 10X ثم انتظر 4 دقائق عن أكبر قطعة لتسوية. استخدام ماصة الثانية لنقل كبار 2 مل تحتوي على تعليق خلية نأت إلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام سحن، يسحن 10X وانتظر 3 دقائق. استخدام ماصة الثالثة لنقل كبار 2 مل لتعليق الخلية. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام سحن، 5X يسحن والانتظار 2 دقيقة. استخدام ماصة الرابع لنقل 2ML أعلى إلى تعليق الخلية.
- طبقة تعليق الخلية فصلها على رأس BSA 8٪، والحرص على عدم خلط. أجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- وضع تعقيمها 6 ملم × 8 ملم استنساخ الاسطوانات في مركز كل ساترة. يجب أن تكون جافة تماما Coverslips. نضح و resuspend بيليه في 440 ميكرولتر وسائط النمو الدافئة. ملء استنساخ اسطوانات مع تعليق العصبية ووضعه في الحاضنة لمدة 20 دقيقة.
- إزالة اسطوانات الاستنساخ وبلطف شديد يغسل الحطام. ملء كل طبق وايال 2 مل من وسائط النمو. تسمح للخلايا للتعافي لا يقل عن 1 ساعة قبل أن يتم تنفيذ أي فحوصات.
6. استعدادا لMPD التصوير
- جعل الحل تسجيل تتكون من 121 ملي مول كلوريد الصوديوم، 4.7 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 0.1 ملم MgCl 2، 1.2 ملي MgSO 4، 0.97 ملي K 2 هبو 4، 0.23 ملي KH 2 PO 4، 5 مم 3 NaHCO، و 25 ملي HEPES. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
- إضافة الجلوكوز لجعل الحل المنخفضة اختبار الجلوكوز المطلوب (0،1-2،0 ملي الجلوكوز). مزيج دقيق وحجز 400 مل المنخفضة الحل تسجيل الجلوكوز. إضافة الجلوكوز إلى 600 مل المتبقية لجعل الحل تسجيل 2.5 ملي الجلوكوز وتخلط جيدا.
- حماية صبغة من الضوء قدر الإمكان. إضافة 4 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة إلى قارورة الأزرق MPD. تخلط جيدا وإضافة 5 ميكرولتر صبغة في حل تسجيل مل. تبقي الحل متجانسة عن طريق خلط مع ماصة بين الحلول. يحتوي على صبغة الفلورسنت مolecules، التي تدخل الخلايا مع الاستقطاب، والجزيئات فاكهه تقضي، التي لا يمكن عبور غشاء الخلية. قد يتم تخزين aliquots في -20 درجة مئوية وتستخدم في غضون 4 أيام. لا تجميد ذوبان الجليد أكثر من مرة.
- احتضان الخلايا في 2 مل من 2.5 ملي حل تسجيل الجلوكوز بالإضافة إلى صبغة في 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ويمكن استخدام كتلة التدفئة الجافة. حماية من الضوء.
- تحضير حقنة مضخات ونظام الارواء مع 2.5 ملم و 0.1 ملم حلول تسجيل بالإضافة إلى صباغة. يجب أن تكون متصلا أنابيب من 60 مل إلى المحاقن متعددة.
- بعد التوقف عن أي مضخة، انتظر ~ 10 ثانية قبل التحول الحلول في مشعب لمنع تراكم الضغط في المحقنة. تغيرات الضغط يغير تسليم السائل إلى غرفة مغلقة تحتوي على الخلايا العصبية، مما تسبب تغيرات في التركيز المجهر خلال التجربة وتشويه الصور.
- يجب أن تكون متصلا إخراج أنابيب متعددة لسخان في خط أنابيب البولي ايثيلين ومن ثم، الذي يربط إلى غرفة مغلقة. يجب أن يتم مسح فقاعات ويجب تعيين معدل نضح إلى 0.5 مل / دقيقة. حماية من الضوء.
- نقل 25 ملم ساترة مع الخلايا العصبية ملتصقة إلى غرفة مغلقة، والحرص على عدم السماح ساترة لتجف وعدم إدخال فقاعات الهواء. يتم محاذاة الانزلاق في الأخاديد من قطعة السفلي، يتم وضع بضع قطرات من محلول تسجيل على طول الجانبين، وقطعة يتم تركيبها أعلى بلطف لعقد ساترة في مكانها.
- استخدام القطارة لملء الغرفة مع الحل تسجيل ثم وضع 18 مم ساترة على القمة. بلطف تناسب حلقة بيضاء في غرفة لعقد ساترة أصغر في المكان. اضغط لأسفل ببطء شديد وبخفة لمنع فقاعات الهواء من يجري إدخالها إلى غرفة مغلقة.
- بدء ضخ حقنة ل2.5 ملي حل الجلوكوز تسجيل، اضغط لأسفل على عصابة بيضاء، والاتصال إلى غرفة مغلقة. الافراج عن ببطء ضغط من عصابة بيضاء والاتصال أنابيب مما يؤدي إلى حاوية النفايات.
- توسيط الخلايا العصبية باستخدام منخفضة الضوء الساطع المجال. محاولة لتقليل كمية من الوقت يتعرض الخلايا للضوء.
- السماح للنظام نضح لتشغيل لمدة 10 دقيقة للسماح للاستقرار درجة الحرارة، والتركيز، وصبغ التوازن.
- في حين فتيلة، افتح برنامج MetaMorph وتأخذ صورة حقل مشرق (10X) من الخلايا العصبية. استخدام وظيفة التركيز التلقائي لاتخاذ رزمة من الصور 3 الفلورسنت (150 ميللي ثانية، ضيق مرشح CY3، 10X)، وتحديد التركيز خلال 5 ميكرون. في نهاية الفترة فتيلة 10 دقيقة، والتحقق من التركيز مرة أخرى.
- البدء في تسجيل الصور الفلورسنت كل 30 ثانية لمدة 40 دقيقة. إنشاء خط الأساس عند 2.5 ملي الجلوكوز لمدة 10 دقيقة، ثم ينخفض الجلوكوز لمدة 15 دقيقة، والعودة أخيرا إلى 2.5 ملي الجلوكوز لمدة 15 دقيقة. يتم تغيير الحلول من خلال إيقاف ضخ حقنة، والانتظار 10 ثانية، وتحول منفذ على مشعب، وبدء ضخ حقنة أخرى. التغييرات يجب أن تحدث قبل الوقت المطلوب نقاط باالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على التأخر بين مشعب والخلايا.
- بعد تسجيل كافة الصور الفلورسنت، تأخذ صورة حقل مشرق من الخلايا العصبية.
8. تحليل MPD التصوير
- استخدام MetaMorph لإنشاء مناطق بيضاوية حول كل خلية في صورة حقل مشرق اتخذت في نهاية التجربة. يجب أن يكون أكبر قليلا من المناطق كل الخلايا العصبية ويمكن أن تكون 1 بكسل خارج حافة الخلية الظلام. لا اختيار الخلايا التي هي غير صحية، تداخل، أو على مقربة من الحطام. غالبا ما تظهر الخلايا غير صحية الظلام. أخيرا، إنشاء 5 مناطق بيضاوية كبيرة في المناطق التي لا توجد خلايا أو الحطام لقياس الخلفية.
- نقل مناطق لجميع الصور الفلورسنت وتفتيش للتحقق من أن أي حركة / التحول قد حدث. استخدام وظيفة قياس لتسجيل كثافة مضان من كل منطقة لكافة الصور في ملف إكسل. وينصح استخدام المجلات في Metamorph.
- في Excel، قم بإنشاء المتوسط من المناطق الخلفية 5 لكل fluorescوالأنف والحنجرة الصورة. هذا يمثل متوسط قيمة الخلفية في كل نقطة زمنية. لكل نقطة صورة / الساعة، طرح الخلفية من جميع القياسات المنطقة. وسوف تحال كثافة مضان الخلفية تطرح على أنها شدة الآخرة.
- لكل خلية، وحساب متوسط كثافة خلال دقائق 2-8 من التسجيل. هذا يمثل الأساس للخلية في 2.5 ملي الجلوكوز. ويستخدم العازلة 2 دقيقة على طرفي كل معاملة للحد من الضوضاء.
- لكل خلية، وحساب نسبة التغير من الأساس: (الكثافة الأساس) / خط الأساس
- إنشاء رسم بياني تمشيا مع التغيير في المائة من خط الأساس مقابل الوقت.
- حساب متوسط التغير في المئة من خط الأساس خلال دقائق 18-23. حساب متوسط التغير في المئة من خط الأساس خلال دقائق 35-40. في حين لم يتم استخدام معالجة الصور، يتم تقليل الضوضاء من خلال المتوسط من شدة داخل كل منطقة الخلية، والطرح الخلفية، والمتوسط من كثافة المنطقة خلال 5 دقائق سص لفترة أطول.
- يجب إجراء التجارب السيطرة التي يتم فيها تبادل 2.5 ملي حل تسجيل الجلوكوز مع 2.5 ملي حل تسجيل الجلوكوز لتحديد عتبة الضوضاء. حساب متوسط التغير في المئة من خط الأساس خلال دقائق 18-23 للا يقل عن 6 الأطباق و 3 الفئران. تحديد الانحراف المتوسط ومستوى هذه القيم.
- تعيين عتبة لاستجابة الاستقطاب إيجابية إلى الوسط زائد 2 الانحرافات المعيارية. يعني زائد 2 الانحرافات المعيارية يناظر الفرق مع ع <0.05. وكشفت التجارب عن سيطرتنا تغيير 10٪ من خط الأساس كقيمة حدية مناسبة.
- لكل خلية، وتقييم استجابة الاستقطاب عكسها على أساس معايير 2. أولا، يجب أن يكون معدل التغير في المئة من خط الأساس خلال دقائق 18-23 أكبر من 10٪، وعتبة تحدد في الخطوة السابقة. الثانية، يجب أن يكون معدل التغير في المئة من خط الأساس خلال دقائق 35-40 أقل من نصف متوسط التغير في المئة منخط الأساس خلال دقائق 18-23. وقد تم اختيار المعيار الثاني منذ وجدت لتكون أكثر صرامة من التحفيز مع الغلوتامات أو بوكل. الخلايا العصبية غير صحية في كثير من الأحيان لتحفيز الاستجابة مع الغلوتامات أو بوكل على الرغم من ردودهم إلى انخفاض الجلوكوز ليست عكسها.
- لكل طبق، وحساب٪ من الخلايا العصبية استقطابها. يتم استخدام هذه القيمة لقياس٪ من الخلايا العصبية GI بين مجموعات العلاج المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تشريح دقيق للVMH بعيدا عن المناطق الأخرى طائي المهم للحصول على نتائج متسقة. إدراج مجالات أخرى يمكن أن يخفف من السكان العصبية VMH، وتغيير٪ من الخلايا العصبية استقطابها المحسوبة. وعلاوة على ذلك، تم تحديد الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز في المناطق طائي أخرى، مثل منطقة ما تحت المهاد الجانبية، التي قد تختلف وظيفيا وميكانيكيا من VMH الجلوكوز الاستشعار عن الخلايا العصبية. الشكل 1 يوضح المواقع التشريحية الصحيحة لتشريح السليم. بعد بروتوكول أعلاه، تحتوي على أنسجة المخ المنطقة VMH الصحيح يمكن فصلها. مزيد من تشريح لفصل بالضبط VMN ومركز البحوث الزراعية، مع الحفاظ على مجمل كل حيوانية، قد لا يكون ممكنا. ويبين الشكل 2 مثالا صحية فصل الخلايا العصبية VMH. باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية، ونحن أكد أن إعداد لدينا هو> 90٪ العصبية. وينبغي أن تستخدم الخلايا العصبية السليمة فقط لanaly البياناتيجب التخلص من جهاز الأمن والمخابرات والأطباق مع عدد كبير جدا من الخلايا العصبية غير صحية. الخلايا العصبية التي هي غير صحية وغالبا ما يكون حواف داكنة جدا، تناول MPD إلى حد كبير، ولها أشكال غير منتظمة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي مطلي الخلايا العصبية في مناطق ذات كثافة مثل أن معظم الخلايا العصبية لا لمس كل منهما الآخر أثناء التسجيل. اختار الخلايا العصبية للتحليل لا ينبغي أن لمس الخلايا الأخرى أو الحطام.
وتظهر البيانات التي تم الحصول عليها من التسجيلات من الخلايا العصبية والخلايا العصبية GI nonGI في الشكل 3. بعد الحصول على خط الأساس لمدة 10 دقيقة، وانخفض السكر في خارج الخلية 2،5-0،1 مم. ويبين الخلايا العصبية GI استجابة قوية عكسها أكبر من عتبة محددة سلفا من تغير 10٪ من خط الأساس. الزيادة في مضان يعكس الاستقطاب. في حين يتم الكشف أيضا ردود GE الخلايا العصبية فرط الاستقطاب، وتردد منخفض جدا (<1٪ الخلايا العصبية) للاستخدام الناجح لهذه التقنية على هذا النوع الفرعي من الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز. وهناك مجموعة من glucos الفسيولوجيةتم اختبار يظهر انخفاض الإلكترونية وتم حساب النسبة المئوية للخلايا العصبية التي VMH استقطابها عكسية لكل طبق. الشكل 4 أن العلاقة الإيجابية القائمة بين حجم انخفاض الجلوكوز ونسبة إزالة إستقطاب الخلايا العصبية. هذا يدل على أن الثقافة الأولية الناجحة من الخلايا العصبية الفئران الكبار يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع التصوير مضان للسماح لدراسة الخلايا العصبية الكبار VMH GI.
الشكل 1. القسم الاكليلية مع علامات للالصحيح VMH تشريح. يحتوي الأنسجة تشريح VMN ومركز البحوث الزراعية مع الحد الأدنى من التلوث من المناطق طائي الأخرى. وينبغي بذل تخفيضات قطري من ~ 25-30٪ أقل من الجزء العلوي من البطين الثالث إلى ~ 25-30٪ بين النقطة حيث يلتقي اللحاء منطقة الوطاء (الازرق *) والبطين الثالث(3V). مقتبس من bregma -2.8 مم Paxinos واتسون 9 1998 ه الموافق ماوس الدماغ bregma-1.7MM. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. صورة Brightfield من الخلايا العصبية VMH صحية من الماوس الكبار .. اخذت هذه الصورة 24 ساعة بعد التفكك واستخدمت لتصوير MPD. وهناك أمثلة قليلة من الخلايا العصبية التي من شأنها أن (الأزرق *) أو لن (أحمر خ) أن تستخدم لتحليل وتتميز. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Figure 3. آثار MPD مضان ممثل من الخلايا العصبية GI (الخط الأخضر) والخلايا العصبية nonGI (الخط البرتقالي). تم perfused الخلايا مع 2.5 ملي الجلوكوز (G) الحل تسجيل لمدة 10 دقيقة، تليها انخفاضا إلى 0.1 ملي G لمدة 15 دقيقة و العودة إلى 2.5 ملي G لمدة 15 دقيقة. في الخلايا العصبية GI، زادت نسبة التغير من خط الأساس إلى أكثر من 10٪ خلال الفترة نضح ملي G 0.1 (متوسط 40٪ 20-25 دقيقة) وانخفضت إلى أقل من نصف هذه الزيادة في الفترة ملي G 2.5 الانعكاس (15 متوسط٪ 35-40 دقيقة). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. النسبة المئوية للبالغين الخلايا العصبية VMH الذي يزيل الاستقطاب عكسية في استجابة لانخفاض السكر في الكشف باستخدام التصوير MPD الفلورسنت. Aوجود علاقة إيجابية بين حجم انخفاض الجلوكوز ونسبة إزالة إستقطاب الخلايا العصبية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المفتاح لتكون قادرة على دراسة نشاط الخلايا العصبية من الفئران الكبار هو القدرة على فصل الخلايا العصبية السليمة. تفكك الخلايا العصبية طائي من الفئران الكبار هو أكثر صعوبة في عدة خطوات أساسية في البروتوكول مقارنة مع الخلايا العصبية من الفئران الأحداث. تغلبنا على هذه المشكلة في عدد من الطرق. صنع شرائح سميكة 500 ميكرون الدماغ يقلل الأضرار الميكانيكية إلى الخلايا العصبية بالمقارنة مع 250-350 ميكرون شرائح المعتادة المستخدمة لأنسجة المخ من الفئران الأصغر سنا. ومع ذلك، وشرائح سمكا تتطلب اهتماما أكبر لنضح القلب وغراء هضم أنسجة المخ. إذا رأيت الدم على أنسجة المخ، وتقييم دقيق والتنسيب من قطع في الأذين الأيمن وإبرة وضعت في البطين الأيسر. ويمكن أيضا أن يتم ضبط معدل تدفق وكمية من محلول الارواء. ونضح شامل لا بد منذ الدم هي سامة بالنسبة للخلايا العصبية، وسوف يؤدي إلى انخفاض العائد من الخلايا العصبية السليمة. يجب أن يكون غراء الهضم فعالة بما فيه الكفاية للسماح لللسحن لطيف وإطلاق سراح من السهل واحد من الخلايا من أنسجة المخ. ويشتبه في عدم كفاءة الهضم غراء عندما تغرق الأنسجة VMH بسرعة في نهاية الهضم وعند وجود قطعة نسيج أكبر خلال سحن الثانية. مع الهضم الجيد، والكشف عن قطعة نسيج بالكاد بالعين المجردة خلال سحن الثالث. إذا كان سحن ليس لطيف، وسوف تعاني الصحية العصبية. في حال الاشتباه في عدم كفاءة الهضم غراء، ويمكن زيادة تركيز غراء بنسبة 5 U / مل أو قارورة جديدة من غراء يمكن استخدامها. ومع ذلك، لا ينبغي زيادة تركيز غراء فوق 30 U / مل لأن هذا يمكن أن يضعف صحة الخلايا العصبية.
التعرض لجيش صرب البوسنة هو خطوة حاسمة أخرى في البروتوكول. تم طرد الخلايا بعد المسحوقة على التدرج BSA، فإن كلا من كمية الخلايا العصبية الوقت يتعرضون لجيش صرب البوسنة ومقدار يسمح BSA بالبقاء مع بيليه يجب أن يكون الحد الأدنى. طاف والتدرج BSAيجب أن يستنشق مباشرة بعد فترة الطرد المركزي. شفط فراغ يمكن استخدامها لإزالة معظم طاف، ولكن يجب إزالة مشاركة ~ 100 ميكرولتر يدويا مع ماصة بحيث لا يتم تعطيل بيليه الخلية. جانب مهم آخر للحصول على الخلايا العصبية السليمة هو لتحسين كثافة الخلية. الخلايا العصبية هي قليلة جدا مطلي يست صحية كما. منذ يتم الحصول على عدد قليل جدا من الخلايا العصبية من كل مخ الفأر، أنه ليس من العملي لحساب الخلايا قبل الطلاء. خلال الفترة التي ستنفق العد، فإن عددا كبيرا من خلايا التمسك البلاستيك وسوف تضيع. باستخدام 4 أطباق في الماوس (~ 1 × 10 4 خلية / مل) كنقطة انطلاق، تقرير التجريبية لعدد من الأطباق هو النهج الأكثر عملية لتحقيق الأمثل كثافة الخلايا العصبية. يمكن توقع أن يكون ما يقرب من نصف محصول من الفئران الشباب العائد من الخلايا العصبية VMH من الفئران الأكبر سنا. مزيد من المشاكل لتحسين العائد الخلايا العصبية ينطوي على تقدير حجم الخلايا العصبية المتبقيةفي كل خطوة من البروتوكول تفارق لتحديد الخطوات الثقيلة الاستنزاف العصبية.
باستخدام بروتوكول لدينا، يمكن أن الخلايا العصبية فصلها صحية البقاء على قيد الحياة في الثقافة تصل إلى 2-3 أيام. ومع ذلك، فإن استخدام تصفيتها وسائط النمو مكيفة نجمية يسمح الخلايا العصبية من أجل البقاء لتصل إلى 2 أسابيع في الثقافة. وسائط النمو يمكن أن يكون مشروطا التي يحتضنها على الخلايا النجمية الأولية متموجة بين عشية وضحاها. وينبغي أن تستخدم الخلايا النجمية من نفس سلالة القوارض، والجنس، والمنطقة الدماغ. في حين أن استخدام وسائل الإعلام مكيفة نجمية يدخل متغير آخر، قد يكون هذا التعديل اللازمة لإجراء التجارب البديلة التي تتطلب المزيد من الوقت في الثقافة. علاوة على ذلك، لأسباب ليست واضحة، وقد وجدنا أن القدرة على الإحساس الجلوكوز يتم فقدان بسهولة مع صحة الخلايا العصبية الأمثل، على الرغم من الحفاظ على الاستجابات للمؤثرات أخرى، مثل الغلوتامات. وبالتالي، يجب توخي الحذر إضافية. لمراقبة استجابات العصبية إلى انخفاض الجلوكوز، وأنه لا بد من تجنب contaminatiعلى طريق البكتيريا والعفن والأملاح والصابون، والجلوكوز. جميع الأواني الزجاجية والبلاستيكية غير المعقمة يجب غسلها جيدا مع DH 2 O. إلى جانب الملوثات الحية، فإن المنظفات والأملاح تؤثر على سلامة الخلايا العصبية والنشاط. كميات صغيرة من الجلوكوز يمكن أن يتغير بشكل كبير تركيزات الجلوكوز. وهذا من شأنه تعطيل النتائج منذ الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز هي حساسة جدا للتغيرات الصغيرة في الجلوكوز خارج الخلية ضمن نطاق الفسيولوجية nonhyperglycemic من 0،1-2،5 ملي 10،11.
عند استخدام التصوير MPD والاتساق وجنبا إلى جنب التجريب بين مجموعات العلاج أمر حيوي لتحقيق نتائج ذات معنى. وينبغي اختبار مجموعات العلاج المختلفة في نفس اليوم إن أمكن أو على الأقل بالتناوب يوما. هذا يقلل من الاختلافات الممكنة في الاستعدادات الثقافة أو مأخوذة MPD. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا يحدث أقل اختلاف عند إجراء التصوير في غضون 24 ساعة من الخلايا العصبية التفكك لأسباب المذكورة أعلاه. منذ النتائجويتم تحليل كنسبة مئوية من إزالة إستقطاب الخلايا العصبية والدقة والاتساق في VMH تشريح وإعداد الخلايا العصبية ضروري أيضا. يجب أن يكون مجمل السكان العصبية VMH حصاد مستمر ويجب أن لا يحتوي الخلايا العصبية من مناطق أخرى. وبالتالي، ينبغي اتباع البروتوكول أعلاه عن كثب وبدقة. ومع ذلك، إذا التجارب البديلة هي التي يتعين القيام بها وصيانة السكان ليست مصدر قلق، ويمكن إجراء اللكمات الأنسجة لعزل VMN أو ARC الخلايا العصبية.
الأساليب المذكورة هنا إنشاء كيفية حصاد الخلايا العصبية VMH صحية من الماوس الكبار وكيفية استخدام MPD التصوير لدراسة الجلوكوز الاستشعار الخلايا العصبية. بدلا من ذلك، يمكن تصميم التجارب لدراسة الاستجابات العصبية VMH للمحفزات أخرى من التغييرات الجلوكوز. بدلا من ذلك، يمكن استقراء بروتوكول التفكك إلى الخلايا العصبية الحصاد من مناطق أخرى من الدماغ. باستخدام الخلايا العصبية من الفئران الكبار، ويمكن الآن إجراء دراسات باستخدام نماذج الفئران التي تنمي المرض أو التقدم في العمر. Moreoveص، الخلايا العصبية البالغين الأصحاء يمكن دراستها باستخدام مزيد من تقنيات أخرى من التصوير مثل التصوير MPD الكالسيوم، الكهربية، وحيدة الخلية PCR، كيمياء سيتولوجية مناعية أو مزيج من هذه التقنيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
NIH R01 DK55619، المعاهد الوطنية للصحة R21 CA139063
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI | used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th edn, Academic Press. (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
