Summary
L'attività di singoli neuroni di topi-adulti di età può essere studiato dissociandosi neuroni da regioni specifiche del cervello e l'utilizzo di membrana fluorescenti potenziale di imaging colorante. Da sperimentazioni risposte alle modifiche del glucosio, questa tecnica può essere utilizzata per studiare la sensibilità glucosio di adulti neuroni ipotalamici ventromedial.
Abstract
Studi di attività neuronale vengono spesso eseguite utilizzando i neuroni di roditori meno di due mesi di età a causa delle difficoltà tecniche connesse con l'aumento del tessuto connettivo e diminuiscono la vitalità neuronale che si verificano con l'età. Qui, descriviamo una metodologia per la dissociazione di sano neuroni ipotalamici di topi adulti di età. La capacità di studiare i neuroni da topi adulti età consente l'utilizzo di modelli di malattia che si manifesta in età più avanzata e potrebbe essere più evolutivamente accurato per alcuni studi. Imaging di fluorescenza dei neuroni dissociati può essere usato per studiare l'attività di una popolazione di neuroni, anziché utilizzare elettrofisiologia per studiare un singolo neurone. Ciò è particolarmente utile quando si studia una popolazione eterogenea neuronale in cui il tipo neuronale desiderato è raro come per i neuroni ipotalamici glucosio sensing. Abbiamo utilizzato potenziale di membrana di imaging tintura di adulti neuroni ipotalamici ventromedial di studiare le loro risposte a chaNGES in glucosio extracellulare. Neuroni sensori del glucosio si ritiene di svolgere un ruolo centrale nella regolazione del bilancio energetico. La possibilità di studiare sensing del glucosio nei roditori adulti è particolarmente utile in quanto la prevalenza di malattie legate al bilancio energetico disfunzionale (ad es. Obesità) aumenta con l'età.
Introduction
Il cervello regola l'omeostasi energetica attraverso il sistema neuroendocrino e nervoso autonomo. L'ipotalamo ventromediale (VMH), composto dal nucleo ventromediale (VMN) e il nucleo arcuato (ARC), è importante per la regolazione centrale dell'omeostasi energetica. Specializzati neuroni sensori del glucosio, all'interno del VMH, attività collegamento neuronale e periferico omeostasi del glucosio 1. Ci sono due tipi di glucosio sensing neuroni; glucosio eccitati (GE) neuroni aumentano mentre il glucosio inibita (GI) neuroni diminuiscono la loro attività di aumenti di glucosio extracellulare. Neuroni rilevamento VMH glucosio sono generalmente studiate usando elettrofisiologia o calcio / potenziale di membrana di imaging colorante sensibile.
La tecnica patch clamp elettrofisiologia è considerato il gold standard nello studio ex vivo di attività neuronale. In questa tecnica, un elettrodo micropipetta di vetro è attaccato alla membrana cellulare tramite una elevata resistenza(GΩ) sigillo. Elettrodi di patch clamp consentono la registrazione in tempo reale di azione potenziale frequenza (pinza di corrente) o conduttanza ionica (morsetto di tensione) cambia all'interno di un singolo neurone. Mentre la tecnica patch clamp fornisce informazioni dettagliate concernenti le modifiche specifiche conduttanze del canale ionico, un grave inconveniente è che solo neurone può osservata alla volta. Ci vogliono circa 30-45 min di registrazione per verificare che si sta registrando da un neurone di rilevamento del glucosio prima ancora di iniziare un trattamento sperimentale specifico. Inoltre, GI e GE neuroni comprendono <20% della popolazione totale neuronale VMH. Ad aggravare il problema è la mancanza, in molti casi, di un marcatore cellulare per identificare questi neuroni. Pertanto, è chiaro che, nonostante fornendo informazioni elettriche preziose che altre tecniche non possono, analisi patch clamp è laborioso, richiede tempo e bassa resa.
L'uso di imaging di fluorescenza dei neuroni VMH dissociate consente lo studio di hundreds di neuroni contemporaneamente. Coloranti sensibili calcio possono essere usati per misurare le variazioni di calcio intracellulare, che indirettamente correlano alle variazioni dell'attività neuronale. Potenziale di membrana coloranti sensibili vengono utilizzati per monitorare membrana potenziali cambiamenti. Misurazione del potenziale di membrana cellulare è un indice più diretta dell'attività neuronale rispetto a variazioni dei livelli di calcio intracellulare. Inoltre, potenziale di membrana immagini colorante (MPD) rileva potenzialmente piccoli cambiamenti nel potenziale di membrana in cui l'azione potenziale di cottura non viene alterata e livelli intracellulari di calcio potrebbe non cambiare. Entrambe queste tecniche di imaging di fluorescenza sono stati utilizzati per studiare i neuroni VMH di rilevamento del glucosio da topi giovanile 2-7. Mentre i risultati sono meno dettagliate di quelle ottenute con patch clamp elettrofisiologia, la forza di esperimenti di imaging è che contemporaneamente valutare una vasta popolazione di cellule che includono inevitabilmente un numero significativo di neuroni sensori di glucosio. MPD di imaging is particolarmente utile per studiare i neuroni GI che sono più uniformemente localizzata nell'intero VMH, fornendo così una popolazione adeguato allo studio nel VMH dissociato (~ 15% GI). Al contrario, mentre i neuroni GE sono densamente localizzate al ventrolateral-VMN e cella regione povera tra l'ARC e VMN, non rappresentano un numero significativo di neuroni nel VMH (<1% GE). Inoltre, studiando i neuroni isolati, astrociti e gli effetti presinaptici sono eliminati. Questo può essere un vantaggio nello studiare effetti primo ordine neurone, così come uno svantaggio in quanto le connessioni e processi fisiologici vengono persi.
Un fattore limitante sia elettrofisiologia patch clamp e MPD / Imaging di calcio colorante è la necessità di utilizzare gli animali più piccoli (ad es. Topi o ratti <8 settimane di età). Questo è principalmente dovuto all'aumento del tessuto connettivo in combinazione con diminuita vitalità neuronale che si verifica con l'età. Nel cervello-slice elettrofisiologia pernoi, aumento del tessuto connettivo rende più difficile visualizzare i neuroni. Tessuto connettivo aumentato rende anche più difficile dissociare un gran numero di neuroni sani per studi di imaging. Inoltre, i neuroni provenienti da animali più giovani sopravvivono più a lungo durante la registrazione patch clamp o immagini. Tuttavia, l'uso di giovani mouse può essere una limitazione importante. Attività neuronale e / o risposte a neurotrasmettitori o sostanze nutritive circolanti cambiano con l'età. Ad esempio, dal momento che il bilancio energetico è strettamente legata allo stato riproduttivo, i neuroni ipotalamici che regolano il bilancio energetico possono rispondere in modo diverso in pre-vs animali postpubescent. Inoltre, molte malattie richiedono un trattamento a lungo termine o non si manifestano fino all'età adulta. Primi esempi di tali malattie sono l'obesità o diabete di tipo 2 dieta. Dal momento che i neuroni sensibili al glucosio si ritiene di svolgere un ruolo in queste patologie abbiamo sviluppato una metodologia per la coltura di successo adulti sani VMH neuroni per l'uso in immagini MPD experiments.
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Protocol
1. Animali
- Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l'Università di Medicina e Odontoiatria del New Jersey.
- Casa di gruppo maschile C57BL / 6 topi su un light/12 hr pianificazione buio 12 ore e permettere ad libitum accesso ad acqua e cibo. Sacrifica a 4-5 mesi di età. L'eutanasia dei topi è stata effettuata utilizzando il piano chirurgico di anestesia e una forma secondaria di eutanasia (cioè penetrante incisione nella cavità toracica attraverso la membrana). Ciò è coerente con gli orientamenti AVMA sull'eutanasia.
2. Preparazione della perfusione Solution, vetrini, pipette di vetro, e dei media
- Preparare la soluzione di perfusione 1L comprensivi di 2,5 mM KCl, 7 MgCl 2 mM, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 NaHCO mm 3, 0.5 mM CaCl 2, glucosio 7 mm, 1 ascorbato mM, e piruvato 3 mm distillata dH 2 O. Regolare l'osmolarità a ~ 300 mOsm usando approssimativamente 80 g / L di saccarosio. Ossigenare facendo gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2 e regolare il pH a 7,4. Ogni esperimento richiede di circa 200 ml di soluzione di perfusione. Aliquote possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di 2 mesi.
- Fai da 250 ml Neurobasal archivio contenente i media Neurobasal senza glucosio, 2,5 mM di glucosio, e 100 U / ml penicillina di streptomicina. Regolare l'osmolarità dello stock Neurobasal a 280 mOsm con saccarosio. Fai 500 ml Hibernate magazzino contenente Hibernate-A supporto senza glucosio, 2,5 mM di glucosio, e 100 U / ml penicillina di streptomicina.
- Mescolare entrambi i titoli bene e filtro sterilizzare utilizzando Stericup unità filtranti vuoto. Fare attenzione a non introdurre glucosio o altri contaminanti attraverso le sbarre vetro o agitare. Avvolgere le bottiglie in un foglio per proteggere i supporti dalla luce e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 mesi.
- Fiamma le punte dei 4 pipette di vetro autoclave (9), in modo che le punte non sono lodiametri nger taglienti e l'apertura sono grandi (~ 0,9 millimetri), medio-grande (~ 0,7 mm), medio (~ 0,5 mm) e piccolo (~ 0.3 mm). Il più grande opportuno malapena lucido e il più piccolo dovrebbe essere di circa un terzo di quel diametro.
- Il giorno prima i neuroni di raccolta, puliti quattro vetrini 25 millimetri con il 70% di etanolo e passano sopra una fiamma del bruciatore Bunsen. Mettete ogni vetrino in una sterile 35 millimetri capsula di Petri e aggiungere 2 ml sterile 1% di poli-D-lisina in dH 2 O. Mettere i piatti in un incubatore (37 ° C) durante la notte. Il giorno dopo, lavare con dH 2 O sterile 3x e permettere coprioggetto asciugare completamente.
- Fai 75 aliquote microlitri di 1 M di acido lattico e 200 microlitri aliquote di GlutaMAX; conservare a -20 ° C. Scongelare completamente aliquote di acido lattico e GlutaMAX prima dell'uso per garantire l'omogeneità.
- Il giorno dei neuroni di raccolta, fare 30 ml di mezzo di coltura fresco, comprensivi di Hibernate-A magazzino contenente acido lattico 1mM, 0,5 mm GlutaMAX, e il 2% B27 senza insulina. VoRTEX e aggiustare il pH a 7,4 con 1 N NaOH.
- Mettere 10 ml di coltura in una piastra di Petri 60 millimetri di vetro su ghiaccio, mettere 2 ml in un tubo da 15 ml su ghiaccio e mantenere la carta residua a temperatura ambiente.
- Il giorno dei neuroni di raccolta, fare 25 ml di terreni di coltura fresco, comprensivi di Neurobasal magazzino contenente 1 mM di acido lattico, Glutamax 0,5 mm, 2% B27 senza insulina. Vortex e aggiustare il pH a 7,4 con 1 N NaOH. Lasciare i mezzi di crescita fresco equilibrare in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per almeno 30 min.
3. Perfusione cardiaca
- Scongelare completamente soluzione di perfusione ml 200 e ossigenato con il 95% O 2/5% di CO 2 in ghiaccio per almeno 15 minuti.
- Lavare una lama vibratome con acetone, etanolo al 70%, e dH 2 O. Posizionare la lama in vibratome.
- Sciacquare la camera di raffreddamento vibratome e tubo per perfusione con dH 2 O. Riempire la camera di raffreddamento (4 ° C) Con la soluzione di perfusione e continuare a ossigenare.
- Anestetizzare un mouse con sodio pentobarbital 50 mg / ml, diluito 1:1 con acqua sterile, iniettata per via intraperitoneale. Verificare che il mouse è completamente anestetizzato da pizzicare la coda e osservando nessuna risposta.
- Versare liquido di perfusione fredda nel serbatoio perfusione e tubo appena prima dissezione. Salvare 20-30 ml per la dissezione del cervello e continuano a ossigenare sul ghiaccio. Flusso di gravità da un elevato siringa da 60 ml con tubo e un ago G 20 fornisce un flusso sufficiente. Lasciare la soluzione di eseguire fino a quando le bolle d'aria vengono lavati. Continuare a ossigenare.
- Tagliare la pelle sopra la gabbia toracica del mouse. Sollevare la cassa toracica e fare attenzione un taglio orizzontale attraverso il diaframma. Fare due tagli laterali attraverso la gabbia toracica su verso le braccia per esporre il cuore. Usare pinze per trattenere la cassa toracica.
- Fare un piccoli 2 mm Taglio nell'atrio destro per fornire un punto di uscita per il sangue da lavare fuori dalla vascolarizzazionesistema lar.
- Forare il ventricolo sinistro con l'ago perfusione, quanto basta per inserire l'apertura dell'ago. Mantenere l'ago in posizione con una mano e avviare il flusso di liquido di perfusione con l'altra mano. Dopo 10-15 ml di soluzione di perfusione, il sangue va lavato fuori e l'effluente sarà chiaro.
4. Cervello affettare e dissezione
- Dopo perfusione cardiaca, trasferimento ossigenato liquido di perfusione fredda per una piastra di Petri su ghiaccio appena prima dell'uso.
- Rapidamente decapitare, rimuovere il cervello dal cranio e posizionare il cervello nella soluzione di perfusione. Per rimuovere il cervello: tirare la pelle in avanti, fare un taglio linea mediana nel cranio verso le orbite, fare due tagli laterali verso ciascun occhio, usare il forcipe per tirare indietro ogni lato del cranio, fare un taglio coronale tra le orbite, e utilizzare una spatola di convincere delicatamente il cervello fuori nella soluzione di perfusione. Usare le forbici per tagliare i tratti ottici, se necessario. Non toccare la ipotalamiArea C e non tirare i tratti ottici, perché questo mette troppa pressione sul eminenza mediana e il tessuto ipotalamico sottostante.
- Utilizzare una lama di rasoio e ago per tagliare lateralmente tessuto cerebrale di circa 3 mm posteriormente e anteriormente al ipotalamo, mentre il tessuto è sommerso (bregma -3,52 mm). E 'particolarmente importante per il taglio lato anteriore sia livello in modo che il cervello si siederà direttamente sul mandrino vibratome.
- Rimuovere il tessuto cerebrale rimanente dalla soluzione e utilizzare carta da filtro per evacuare la soluzione dalla sezione cervello montato.
- Posizionare una piccola quantità di colla super di un mandrino vibratome e diffondere la colla alle dimensioni del cervello. Mettere il tessuto cerebrale in cima alla colla con il lato anteriore rivolto verso il basso e l'ipotalamo fronte alla lama. Wick via eccesso di colla e posizionare il mandrino nella camera di raffreddamento vibratome. Fare attenzione a non lasciare più la colla come sarà la bolla intorno al cervello quando sono immessi in soluzione.
- Con il vibratome impostare una velocità lenta (livello 2) e alta ampiezza (livello 9), fare 300-500 micron fette fino a raggiungere la zona ipotalamica. Ora fare sottili 100 micron fette taglio dal posteriore alla anteriore. I segnali visivi sono i seguenti. Posteriormente al ipotalamo terzo ventricolo sarà molto piccolo (bregma -2,70 a -2,30 mm). A bregma -2.30 mm, il terzo ventricolo viene separato in sezioni dorsale e ventrale sulla fetta coronale.
- Una volta sezioni del terzo fusibile ventricolo, fanno due fette 500 micron che conterranno la corretta regione del VMH (bregma -2.18 a -1.22 mm). Anteriore al VMH, il terzo ventricolo non si estende al pavimento ventrale del cervello (bregma -1.06 a -0.82) 8.
- Trasferire queste fette alla piastra di Petri su ghiaccio contenenti terreni di coltura. Sezionare il VMH (VMN + ARC) come mostrato in Figura 1. Utilizzare una pipetta per trasferire delicatamente i pezzi VMH in 2 ml di coltura sul ghiaccio.
5. Dissociazione e cultura
- Rimuovere il VMH dal ghiaccio e mettere a temperatura ambiente. Aggiungere 20 U / ml papaina a 4 ml di coltura. Miscelare e posto in un bagno d'acqua a 34 °. Controllare e miscelare capovolgendolo ogni minuto fino a quando il supporto di digestione non è più torbida. Filtro (0,22 micron) in una beuta sterile e trasferire il tessuto ai media digestione.
- Digerire il tessuto mediante agitazione a 100 rpm a 34 ° C per 30 min.
- Preparare 1 ml di terreni contenenti 8% di albumina di siero bovino (BSA) durante la digestione. Disciogliere 80 mg di BSA in 1 ml di terreni di coltura e filtri (0,22 micron) in una provetta conica.
- Lavare il tessuto trasferendo a 5 ml di coltura in una provetta conica e lentamente invertendo volta.
- Aggiungere 30 microlitri DNasi enzima a 6 ml di terreni di coltura e mescolare per fare media triturazione. Aspirare i media lavaggio e aggiungere 3 ml di mezzi di triturazione.
- Utilizzare le pipette di vetro per triturare in ordine di largest al più piccolo. Triturare delicatamente 10x e quindi attendere 4 minuti per pezzi più grandi da risolvere. Utilizzare la seconda pipetta per trasferire le prime 2 ml contenenti una sospensione cellulare dissociata in un tubo conico. Aggiungere 2 ml di mezzi di triturazione, triturare 10x e attendere 3 min. Utilizzare il terzo pipetta per trasferire le prime 2 ml di sospensione cellulare. Aggiungere 1 ml di mezzi di triturazione, 5x triturare e aspettare 2 min. Utilizzare il quarto pipetta di trasferire il 2ml superiore alla sospensione cellulare.
- Strato sospensione cellulare dissociata in cima alla BSA 8%, facendo attenzione a non mescolare. Centrifugare a 1000 rpm per 5 min.
- Posizionare autoclavato 6 millimetri x 8 mm clonazione cilindri del centro di ogni coprioggetto. Coprivetrini devono essere completamente asciutti. Aspirare e risospendere il pellet in 440 terreni di crescita microlitri caldo. Riempire clonazione cilindri con la sospensione neuronale e posto in incubatrice per 20 min.
- Rimuovere i cilindri di clonazione e molto delicatamente lavare via i detriti. Riempire ogni piatto wi° 2 ml di terreni di crescita. Permettono alle cellule di recuperare per almeno 1 ora prima di ogni test vengono eseguiti.
6. Preparazione per la MPD Imaging
- Fai la soluzione di registrazione consiste di 121 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 0.1 mM MgCl 2, 1.2 MgSO mm 4, 0.97 mM K 2 HPO 4, 0.23 mM KH 2 PO 4, 5 mM NaHCO 3, e 25 mm HEPES. Regolare il pH a 7,4.
- Aggiungi il glucosio per rendere la soluzione di test glucosio basso desiderata (0,1-2,0 mM di glucosio). Mescolare accuratamente e prenotare 400 ml di soluzione di glucosio basso la registrazione. Aggiungi glucosio per i restanti 600 ml di rendere soluzione di registrazione di glucosio 2,5 mm e mescolare accuratamente.
- Proteggere colorante dalla luce il più possibile. Aggiungere 4 ml di tampone a temperatura ambiente in una fiala blu MPD. Mescolare bene e aggiungere 5 ml di colorante per soluzione di registrazione ml. Mantenere soluzione omogenea miscelando con pipetta tra soluzioni. Il colorante fluorescente contiene molecules, che entrano le celle con depolarizzazione e quencher molecole, che non possono attraversare la membrana cellulare. Le aliquote possono essere conservati a -20 ° C ed utilizzati entro 4 giorni. Non congelare e scongelare più di una volta.
- Incubare le cellule in 2 ml di 2,5 mM soluzione di registrazione glucosio più colorante a 34 ° C per 30 min. Un blocco di riscaldamento a secco può essere utilizzato. Proteggere dalla luce.
- Preparare pompe siringa e sistema di perfusione con 2,5 mm e 0,1 mm più soluzioni di registrazione colorante. Tubo da 60 ml siringhe deve essere collegato ad un collettore.
- Dopo aver interrotto ogni pompa, attendere ~ 10 secondi prima di passare a soluzioni collettore per evitare l'accumulo di pressione nella siringa. Le variazioni di pressione alterano la consegna del fluido alla camera chiusa contenente i neuroni, provocando cambiamenti nella messa a fuoco del microscopio durante l'esperimento e la distorsione delle immagini.
- Il tubo di uscita del collettore deve essere collegato a un riscaldatore in linea e poi tubo di polietilene, che si collega a una camera chiusa. Bubbles dovrebbero essere cancellati e il tasso di perfusione deve essere impostato a 0,5 ml / min. Proteggere dalla luce.
- Trasferire 25 millimetri coprioggetto con i neuroni aderenti alla camera chiusa, facendo attenzione a non permettere vetrino a secco e non introdurre bolle d'aria. Lo scorrimento è allineato nelle scanalature del pezzo inferiore, un paio di gocce di soluzione di registrazione viene posizionato lungo i lati, e la parte superiore è leggermente montati per tenere il coprioggetto in posizione.
- Utilizzare un contagocce per riempire la camera con soluzione di registrazione e poi mettere un coprioggetto 18 millimetri sulla parte superiore. Montare delicatamente anello bianco nella camera di tenere il vetrino più piccolo posto. Premere molto lentamente e leggermente per evitare bolle d'aria vengano introdotti nella camera chiusa.
- Avviare la pompa a siringa per la soluzione di registrazione di glucosio 2,5 mm, premere verso il basso l'anello bianco, e collegarsi a camera chiusa. Rilasciare lentamente la pressione anello bianco e collegarsi a tubo che porta a un contenitore per rifiuti.
- Centrare i neuroni con la luce campo bassa brillante. Cercare di minimizzare la quantità di tempo le cellule vengono esposte alla luce.
- Lasciare che il sistema di perfusione a correre per 10 minuti per consentire la stabilizzazione della temperatura, messa a fuoco, e colorante equilibrio.
- Mentre adescamento, aprire il programma MetaMorph e prendere in un campo luminoso (10X) dei neuroni. Utilizzare la funzione Auto-Focus prendere 3 pile di immagini fluorescenti (150 msec, filtro Cy3 Narrow, 10X) e la messa a fuoco all'interno di 5 micron. Alla fine del periodo di adescamento 10 min, controllare la messa a fuoco ancora una volta.
- Inizia a registrare le immagini fluorescenti ogni 30 secondi per 40 min. Stabilire una linea di base a glucosio 2,5 mM per 10 minuti, poi diminuire glucosio per 15 min, ed infine ritorno al glucosio 2,5 mM per 15 min. Le soluzioni sono cambiati fermando una pompa a siringa, attesa 10 sec, trasformando una porta sul collettore, e partendo un'altra pompa a siringa. I cambiamenti devono avvenire in anticipo desiderati punti temporali based sul ritardo tra il collettore e le cellule.
- Dopo la registrazione di tutte le immagini fluorescenti, prendere un'immagine luminosa campo dei neuroni.
8. Analisi MPD Imaging
- Utilizzare MetaMorph per creare regioni ovali intorno ogni cella l'immagine brillante campo scattata al termine dell'esperimento in. Le regioni dovrebbero essere leggermente più grande di ogni neurone e può essere fatta 1 pixel al di fuori del bordo scuro della cellula. Non scegliere le celle che sono malsani, sovrapposizioni, o in prossimità di detriti. Cellule malsane spesso appaiono scure. Infine, creare 5 grandi regioni ovali in aree prive di cellule o detriti per le misurazioni del fondo.
- Trasferire le regioni a tutte le immagini fluorescenti e ispezionare per verificare che non abbia subito nessun movimento / spostamento. Utilizzare la funzione Misura per registrare l'intensità di fluorescenza di ogni regione per tutte le immagini in un file di Excel. Si consiglia l'uso di riviste in Metamorph.
- In Excel, creare una media di 5 regioni di sfondo per ogni flimmagine ent. Questo rappresenta il valore di fondo media ad ogni tempo. Per ogni punto dell'immagine / tempo, sottrarre lo sfondo da tutte le misurazioni regione. L'intensità di fluorescenza di fondo sottratti verrà indicato come Intensity seguito.
- Per ogni cella, calcolare l'intensità media durante 2-8 minuti di registrazione. Questo rappresenta la linea di base della cella in 2,5 mM di glucosio. Un tampone 2 minuto su entrambe le estremità di ogni trattamento viene utilizzato per ridurre il rumore.
- Per ogni cella, calcolare la variazione percentuale dal basale: (Intensity-Baseline) / Baseline
- Creare un grafico linea con la variazione percentuale dal basale vs tempo.
- Calcolare la variazione media percentuale rispetto al basale durante 18-23 minuti. Calcolare la variazione media percentuale rispetto al basale durante 35-40 minuti. Mentre elaborazione delle immagini non viene utilizzato, il rumore viene ridotto mediante la media di intensità all'interno di ciascuna regione cellula, sottrazione dello sfondo, e la media della regione di intensità superiore a 5 min or più.
- Esperimenti di controllo in cui 2,5 soluzione di registrazione mM di glucosio viene scambiato con 2,5 mM di glucosio soluzione di registrazione devono essere eseguite per determinare la soglia di rumore. Calcolare la variazione media percentuale rispetto al basale durante 18-23 minuti per almeno 6 piatti e 3 topi. Determinare la media e deviazione standard di questi valori.
- Impostare la soglia di una risposta positiva alla depolarizzazione media più 2 deviazioni standard. La media più 2 deviazioni standard corrispondente ad una differenza con p <0,05. I nostri esperimenti di controllo hanno rivelato una variazione del 10% rispetto al basale come valore soglia.
- Per ogni cella, valutare la risposta depolarizzazione reversibile basato su 2 criteri. In primo luogo, la variazione media percentuale dal basale durante 18-23 minuti deve essere superiore al 10%, la soglia determinata nel passaggio precedente. In secondo luogo, la variazione media percentuale dal basale durante 35-40 minuti deve essere inferiore alla metà della variazione media percentuale dabasale durante 18-23 minuti. Il secondo criterio è stato scelto poiché è risultato essere più rigorosa di stimolazione con glutammato o KCl. Neuroni malsane spesso rispondono alla stimolazione con glutammato o KCl anche se le loro risposte alla diminuzione di glucosio non sono reversibili.
- Per ogni piatto, calcolare la% di neuroni depolarizzati. Questo valore viene utilizzato per quantificare la% di neuroni GI tra diversi gruppi di trattamento.
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Representative Results
La dissezione precisa del VMH lontano da altre aree ipotalamiche è importante ottenere risultati coerenti. L'inclusione di altre aree potrebbe diluire la popolazione neuronale VMH, cambiando la% dei neuroni depolarizzati calcolati. Inoltre, neuroni sensori di glucosio sono stati identificati in altre regioni ipotalamici, quali l'ipotalamo laterale, che possono differire funzionalmente e meccanicamente da VMH glucosio sensing neuroni. Figura 1 illustra le posizioni anatomiche corrette per una corretta dissezione. Secondo il suddetto protocollo, tessuto cerebrale contenente la regione VMH corretta può essere dissociato. Ulteriori dissezione per separare precisamente la VMN e ARC, pur mantenendo la totalità di ogni sottopopolazione, potrebbe non essere possibile. Figura 2 mostra un esempio di sana dissociato neuroni VMH. Utilizzando immunocitochimica, abbiamo confermato che la nostra preparazione è> 90% neuronale. Solo i neuroni sani dovrebbero essere utilizzati per analisi di datisis e piatti con troppi neuroni insalubri devono essere eliminati. Neuroni che sono malsano spesso hanno bordi molto scuri, prendere la MPD misura maggiore, e hanno forme irregolari. Inoltre, i neuroni devono essere seminati ad una densità tale che la maggior parte dei neuroni non si tocchino durante la registrazione. I neuroni scelti per l'analisi non deve toccare altre cellule o detriti.
I dati ottenuti da registrazioni di un neurone GI e un neurone nonGI sono mostrati in Figura 3. Dopo aver ottenuto una base per 10 min, il glucosio extracellulare era diminuita 2,5-0,1 mM. Il neurone GI denota una risposta reversibile robusto superiore alla soglia predeterminata di variazione del 10% rispetto al basale. L'aumento della fluorescenza riflette depolarizzazione. Mentre vengono rilevate le risposte GE neurone iperpolarizzazione, la frequenza è troppo bassa (<1% dei neuroni) per l'uso con successo questa tecnica su questo sottotipo di glucosio sensing neurone. Una gamma di glucos fisiologichee decrementi sono stati testati e la percentuale di neuroni VMH che reversibilmente depolarizzata è stato calcolato per ogni piatto. Figura 4 mostra che esiste una relazione positiva tra l'entità della diminuzione del glucosio e la percentuale di depolarizzante neuroni. Questo dimostra che la cultura primaria successo di neuroni murini adulti può essere utilizzato in combinazione con fluorescenza per consentire lo studio di adulti VMH neuroni GI.
Figura 1. Sezione coronale con marcatori per una corretta dissezione VMH. Il tessuto sezionato contiene il VMN e ARC con la contaminazione minima da altre aree ipotalamiche. Tagli diagonali devono essere effettuate da ~ 25-30% sotto la parte superiore del terzo ventricolo a ~ 25-30% tra il punto in cui la corteccia incontra l'area ipotalamica (blu *) e il terzo ventricolo(3V). Adattato da bregma -2.8 mm Paxinos e Watson 1998 9, corrispondente al cervello di topo bregma-1.7mm. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Immagine Brightfield di sano neuroni VMH di un topo adulto. Questa immagine è stata scattata 24 ore dopo la dissociazione ed è stato utilizzato per l'imaging MPD. Alcuni esempi di neuroni che sarebbe (blu *) o non sarebbe (x rossa) utilizzati per l'analisi sono contrassegnati. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
FIGURA 3. Rappresentativi tracce MPD fluorescenza di un neurone GI (linea verde) e un neurone nonGI (linea arancione). Cellule sono state perfusi con 2,5 mM di glucosio (G) soluzione di registrazione per 10 minuti, seguito da una diminuzione di 0,1 mM G per 15 min e un ritorno a 2,5 mM G per 15 min. Nel neurone GI, la variazione percentuale dal basale è aumentata a oltre il 10% durante il periodo di perfusione mm G 0,1 (40% in media 20-25 min) e sceso a meno della metà di questo aumento nel periodo di 2,5 mm G inversione (15 % in media 35-40 min). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. La percentuale di adulti VMH neuroni che reversibilmente depolarizza in risposta alla diminuzione della glicemia rilevata tramite fluorescente di imaging MPD. Aesiste relazione positiva tra l'entità della diminuzione di glucosio e la percentuale di depolarizzante neuroni. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
La chiave per poter studiare l'attività dei neuroni da topi adulti è la capacità di dissociare neuroni sani. Dissociazione dei neuroni ipotalamici di topi adulti è più difficile in diversi passaggi chiave nel protocollo rispetto ai neuroni di topi giovani. Abbiamo superare questo problema in vari modi. Fare fette spesse 500 micron di cervello riduce al minimo i danni meccanici ai neuroni rispetto ai soliti 250-350 micron fette utilizzati per il tessuto cerebrale di topi più giovani. Tuttavia, fette spesse richiedono maggiore attenzione alla perfusione cardiaca e papaina digestione del tessuto cerebrale. Se il sangue è visto sul tessuto cerebrale, valutare la precisione e il posizionamento del taglio nell'atrio destro e l'ago inserito nel ventricolo sinistro. La velocità e la quantità di soluzione di perfusione flusso possono essere regolati. Un perfusione approfondita è indispensabile in quanto il sangue è tossica per i neuroni e si tradurrà in una minore resa di neuroni sani. La papaina digestione deve essere sufficientemente efficace per consentireper gentile triturazione e facile il rilascio di singole cellule dal tessuto cerebrale. Un papaina digestione inefficiente è sospettata quando il tessuto VMH affonda rapidamente alla fine della digestione e quando sono presenti grandi pezzi di tessuto durante la seconda triturazione. Con buona digestione, pezzi di tessuto sono appena rilevati ad occhio nudo durante la terza triturazione. Se la triturazione non è dolce, la salute neuronale si soffre. Se un papaina digestione inefficiente si sospetta, la concentrazione di papaina può essere aumentata di 5 U / ml o un nuovo flaconcino di papaina può essere utilizzato. Tuttavia, la concentrazione papaina non deve essere superiore a 30 U / ml, poiché questo può compromettere la salute neuronale.
L'esposizione al BSA è un altro passo fondamentale nel protocollo. Dopo cellule sono state triturate centrifugato sul gradiente BSA, sia la quantità di neuroni temporali sono esposti a BSA e la quantità di BSA può rimanere con il pellet deve essere minimizzato. Il surnatante e il gradiente BSAdeve essere aspirato immediatamente dopo il periodo centrifugazione. Aspirazione di vuoto può essere usato per rimuovere la maggior parte di supernatante, ma l'ultimo ~ 100 microlitri deve essere rimosso manualmente con una pipetta in modo che il pellet cellulare non viene interrotto. Un altro aspetto importante di ottenere neuroni sani è quello di ottimizzare densità cellulare. I neuroni placcato troppo poco non sono così sani. Poiché così pochi neuroni sono ottenuti da ciascun cervello di topo, non è pratico per contare le cellule prima placcatura. Durante il tempo che sarebbe stato speso contando, un numero significativo di cellule del mantenimento della plastica e verrebbe perso. Utilizzando 4 piatti per topo (~ 1 x 10 4 cellule / ml) come punto di partenza, determinazione empirica del numero di piatti è l'approccio più pratico per ottenere densità ottimale neurone. La resa di VMH neuroni di topi anziani può essere prevista per circa la metà del rendimento da giovani topi. Ulteriore risoluzione dei problemi per migliorare la resa dei neuroni comporta la quantificazione dei neuroni rimanentiad ogni passo del protocollo dissociazione di individuare fasi di pesante logoramento neuronale.
Utilizzando il nostro protocollo, i neuroni dissociati sane possono sopravvivere in coltura fino a 2-3 giorni. Tuttavia, l'uso di mezzi di crescita filtrato-astrociti condizionata neuroni permette di sopravvivere fino a 2 settimane in coltura. Mezzi di crescita possono essere condizionate incubando su astrociti primari confluenti durante la notte. Astrociti dallo stesso ceppo roditore, sesso e regione cerebrale dovrebbero essere utilizzate. Mentre l'uso dei supporti astrociti condizionata introduce un'altra variabile, tale modifica può essere necessaria per esperimenti alternativi che richiedono più tempo di coltura. Inoltre, per ragioni che non sono chiare, abbiamo trovato che la capacità di percepire il glucosio si perde facilmente con subottimale salute neuronale, nonostante il mantenimento di risposte ad altri stimoli, come il glutammato. Così, la cura supplementare deve essere presa. Per osservare risposte neuronali alla diminuzione di glucosio, è indispensabile evitare contaminatiil da batteri, muffe, sali, sapone, e glucosio. Tutti cristalleria e plastica non sterili devono essere accuratamente lavati con dH 2 O. Oltre contaminanti vivente, detergenti e sali interesserebbero l'integrità e l'attività neuronale. Piccole quantità di glucosio potrebbe cambiare significativamente le concentrazioni di glucosio. Ciò interrompere risultati poiché i neuroni sensibili al glucosio sono molto sensibili alle piccole variazioni di glucosio extracellulare all'interno del range fisiologico nonhyperglycemic di 0,1-2,5 mM 10,11.
Quando si utilizza l'imaging MPD, la coerenza e side-by-side sperimentazione tra i gruppi di trattamento sono essenziali per ottenere risultati significativi. Diversi gruppi di trattamento devono essere testati nello stesso giorno, se possibile, o almeno a giorni alterni. Questo riduce al minimo le possibili variazioni di preparazioni cultura o aliquote MPD. Inoltre, abbiamo trovato la minima variazione si verifica quando l'imaging viene eseguita entro 24 ore di neurone dissociazione per i motivi di cui sopra. Poiché i risultatisono analizzati in% del depolarizzante neuroni, accuratezza e coerenza in VMH dissezione e preparazione neuronale è anche essenziale. La popolazione neuronale complessivo VMH raccolto deve essere costante e non deve contenere i neuroni provenienti da altre regioni. Pertanto, il protocollo di cui sopra dovrebbe essere seguito da vicino e preciso. Tuttavia, se gli esperimenti alternativi devono essere eseguite e la manutenzione della popolazione non è una preoccupazione, pugni tessuti possono essere fatte per isolare Vmn o ARC neuroni.
I metodi qui descritti stabilire come raccogliere i neuroni VMH sani da un topo adulto e come utilizzare l'imaging MPD per studiare i neuroni glucosio sensing. Invece, gli esperimenti potrebbero essere progettati per esaminare VMH risposte neuronali a stimoli di diverso da cambiamenti di glucosio. In alternativa, il protocollo di dissociazione può essere estrapolato per neuroni raccolto da altre regioni del cervello. Utilizzando i neuroni da topi adulti, studi possono ora essere eseguite utilizzando modelli murini di malattie che si sviluppano o il progresso con l'età. Moreover, neuroni adulti sani possono essere ulteriormente studiate con tecniche diverse immagini MPD come l'imaging calcio, elettrofisiologia, unicellulare PCR, immunocitochimica o una combinazione di queste tecniche.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI | used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
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