L'attività di singoli neuroni di topi-adulti di età può essere studiato dissociandosi neuroni da regioni specifiche del cervello e l'utilizzo di membrana fluorescenti potenziale di imaging colorante. Da sperimentazioni risposte alle modifiche del glucosio, questa tecnica può essere utilizzata per studiare la sensibilità glucosio di adulti neuroni ipotalamici ventromedial.
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Articolo metodologico
Potenziale di membrana Dye Imaging di ventromediale dell'ipotalamo neuroni da topi adulti per studiare glucosio Sensing
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studi di attività neuronale vengono spesso eseguite utilizzando i neuroni di roditori meno di due mesi di età a causa delle difficoltà tecniche connesse con l'aumento del tessuto connettivo e diminuiscono la vitalità neuronale che si verificano con l'età. Qui, descriviamo una metodologia per la dissociazione di sano neuroni ipotalamici di topi adulti di età. La capacità di studiare i neuroni da topi adulti età consente l'utilizzo di modelli di malattia che si manifesta in età più avanzata e potrebbe essere più evolutivamente accurato per alcuni studi. Imaging di fluorescenza dei neuroni dissociati può essere usato per studiare l'attività di una popolazione di neuroni, anziché utilizzare elettrofisiologia per studiare un singolo neurone. Ciò è particolarmente utile quando si studia una popolazione eterogenea neuronale in cui il tipo neuronale desiderato è raro come per i neuroni ipotalamici glucosio sensing. Abbiamo utilizzato potenziale di membrana di imaging tintura di adulti neuroni ipotalamici ventromedial di studiare le loro risposte a chaNGES in glucosio extracellulare. Neuroni sensori del glucosio si ritiene di svolgere un ruolo centrale nella regolazione del bilancio energetico. La possibilità di studiare sensing del glucosio nei roditori adulti è particolarmente utile in quanto la prevalenza di malattie legate al bilancio energetico disfunzionale (ad es. Obesità) aumenta con l'età.
Introduzione
Il cervello regola l'omeostasi energetica attraverso il sistema neuroendocrino e nervoso autonomo. L'ipotalamo ventromediale (VMH), composto dal nucleo ventromediale (VMN) e il nucleo arcuato (ARC), è importante per la regolazione centrale dell'omeostasi energetica. Specializzati neuroni sensori del glucosio, all'interno del VMH, attività collegamento neuronale e periferico omeostasi del glucosio 1. Ci sono due tipi di glucosio sensing neuroni; glucosio eccitati (GE) neuroni aumentano mentre il glucosio inibita (GI) neuroni diminuiscono la loro attività di aumenti di glucosio extracellulare. Neuroni rilevamento VMH glucosio sono generalment....
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Protocollo
1. Animali
- Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l'Università di Medicina e Odontoiatria del New Jersey.
- Casa di gruppo maschile C57BL / 6 topi su un light/12 hr pianificazione buio 12 ore e permettere ad libitum accesso ad acqua e cibo. Sacrifica a 4-5 mesi di età. L'eutanasia dei topi è stata effettuata utilizzando il piano chirurgico di anestesia e una forma secondaria di eutanasia (cioè penetrante incisione nella cavità toracica attraverso la membrana). Ciò è coerente con gli orientamenti AVMA sull'eutanasia.
2. Prepara....
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Risultati
La dissezione precisa del VMH lontano da altre aree ipotalamiche è importante ottenere risultati coerenti. L'inclusione di altre aree potrebbe diluire la popolazione neuronale VMH, cambiando la% dei neuroni depolarizzati calcolati. Inoltre, neuroni sensori di glucosio sono stati identificati in altre regioni ipotalamici, quali l'ipotalamo laterale, che possono differire funzionalmente e meccanicamente da VMH glucosio sensing neuroni. Figura 1 illustra le posizioni anatomiche corrette per una cor.......
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Discussione
La chiave per poter studiare l'attività dei neuroni da topi adulti è la capacità di dissociare neuroni sani. Dissociazione dei neuroni ipotalamici di topi adulti è più difficile in diversi passaggi chiave nel protocollo rispetto ai neuroni di topi giovani. Abbiamo superare questo problema in vari modi. Fare fette spesse 500 micron di cervello riduce al minimo i danni meccanici ai neuroni rispetto ai soliti 250-350 micron fette utilizzati per il tessuto cerebrale di topi più giovani. Tuttavia, fette spesse richiedono.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | su misura senza glucosio |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | su misura senza glucosio | |
| Penicillina streptomicina (20.000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | altri fornitori accettabili |
| Unità filtranti sottovuoto Stericup (0,22 μ m) | Millipore | altri fornitori accettabili | |
| 25 mm Vetrini coprioggetti | Warner | #1 25mm rotondo | |
| 18 mm Vetrini coprioggetti | Warner | #1 18mm rotondo | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 meno insulina (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Lama di rasoio | VWR | 55411 | |
| Vibratomo e camera di raffreddamento | Vibratome | Serie 1000 | |
| Lame vibratomo | Iniettore Polysciences | 22370 | o lame a doppio taglio di altri fornitori |
| accettabili Papaina, sospensione | Worthington | LS003124 | |
| BSA, adatto per colture cellulari | Sigma | altri fornitori accettabili | |
| DNAse, per colture cellulari | Invitrogen | altri fornitori accettabili | |
| cilindri di clonazione, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrana Potenziale Colorante (blu) | Molecular Devices | R8042 | |
| Riscaldatore in linea | Warner | SF-28 | |
| Pompe a siringa | WPI | sp100i | altro fornitore accettabile |
| Camera | chiusa Warner | RC-43C | |
| Tubo in polietilene | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | software di analisi delle immagini alternativo accettabile | |
| Microscopio | Olympus | BX61 WI | usato con 10X obiettivo |
| Fotometria | della fotocamera | Cool Snap HQ | |
| Set di filtri Cy3 stretti | Chroma | 41007a | |
| Sistema di illuminazione | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Riferimenti
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs gluc....
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Ristampe e permessi
