झिल्ली वयस्क चूहों से ventromedial Hypothalamus न्यूरॉन्स की संभावित डाई इमेजिंग ग्लूकोज सेंसिंग अध्ययन करने के लिए
Summary
वयस्क आयु वर्ग के चूहों से एकल न्यूरॉन्स की गतिविधियों विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से न्यूरॉन्स अलग कर और फ्लोरोसेंट झिल्ली संभावित डाई इमेजिंग का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है. ग्लूकोज में परिवर्तन करने के लिए परीक्षण प्रतिक्रियाओं से, यह तकनीक वयस्क ventromedial हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स की ग्लूकोज संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
Neuronal गतिविधि का अध्ययन अक्सर कारण बढ़ रही संयोजी ऊतक के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों को कृन्तकों उम्र के कम से कम 2 महीने से न्यूरॉन्स का उपयोग किया जाता है और उम्र के साथ होते हैं कि neuronal व्यवहार्यता घट रहे हैं. यहाँ, हम वयस्क आयु वर्ग के चूहों से स्वस्थ hypothalamic न्यूरॉन्स की हदबंदी के लिए एक पद्धति का वर्णन. वयस्क आयु वर्ग के चूहों से न्यूरॉन्स अध्ययन करने की क्षमता एक बाद की उम्र में प्रकट और कुछ अध्ययनों के लिए अधिक developmentally सही हो सकता है कि बीमारी मॉडल के उपयोग की अनुमति देता है. एक न्यूरॉन का अध्ययन करने के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करने के लिए विरोध के रूप में अलग न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति इमेजिंग, न्यूरॉन्स की आबादी की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वांछित neuronal प्रकार इस तरह के हाइपोथैलेमस ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स के लिए के रूप में दुर्लभ है जिसमें एक विषम neuronal आबादी का अध्ययन करने पर यह विशेष रूप से उपयोगी है. हम चा करने के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए वयस्क ventromedial hypothalamic न्यूरॉन्स की झिल्ली संभावित डाई इमेजिंग उपयोगकोशिकी ग्लूकोज में nges. ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स ऊर्जा संतुलन के केंद्रीय विनियमन में एक भूमिका निभा माना जाता है. वयस्क कृन्तकों में ग्लूकोज संवेदन अध्ययन करने की क्षमता बेकार ऊर्जा संतुलन (जैसे. मोटापा) उम्र के साथ वृद्धि से संबंधित रोगों की प्रबलता के बाद से विशेष रूप से उपयोगी है.
Introduction
मस्तिष्क neuroendocrine और स्वायत्त तंत्रिका प्रणाली के माध्यम से ऊर्जा homeostasis को नियंत्रित करता है. ventromedial हाइपोथेलेमस (VMH), ventromedial नाभिक (VMN) और धनुषाकार नाभिक (एआरसी) के शामिल, ऊर्जा homeostasis के केंद्रीय विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है. विशिष्ट ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स, VMH भीतर, neuronal गतिविधि और परिधीय ग्लूकोज homeostasis 1 लिंक. ग्लूकोज उत्साहित (जीई) ग्लूकोज (सैनिक) न्यूरॉन्स कोशिकी ग्लूकोज बढ़ जाती है के रूप में अपनी गतिविधि को कम हिचकते हैं, जबकि न्यूरॉन्स वृद्धि, न्यूरॉन्स संवेदन ग्लूकोज के दो प्रकार के होते हैं. VMH ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स आम तौर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या कैल्शियम / झिल्ली संभावित संवेदनशील डाई इमेजिंग अध्ययन का उपयोग कर रहे हैं.
electrophysiological पैच दबाना तकनीक पूर्व vivo neuronal गतिविधि के अध्ययन में स्वर्ण मानक माना जाता है. इस तकनीक में, एक गिलास micropipette इलेक्ट्रोड एक उच्च प्रतिरोध के माध्यम से कोशिका झिल्ली से जुड़ा हुआ है(GΩ) मुहर. पैच दबाना इलेक्ट्रोड कार्रवाई संभावित आवृत्ति (वर्तमान दबाना) या आयन प्रवाहकत्त्व (वोल्टेज दबाना) की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग एक न्यूरॉन के भीतर परिवर्तन की अनुमति. पैच दबाना तकनीक विशिष्ट आयन चैनल conductances में परिवर्तन के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है, एक बड़ी खामी केवल एक न्यूरॉन एक समय में मनाया सकता है. यह भी एक विशिष्ट प्रयोगात्मक उपचार शुरू होने से पहले एक ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन से एक है कि रिकॉर्डिंग है सत्यापित करने के लिए रिकॉर्डिंग के लगभग 30-45 मिनट लगते हैं. इसके अलावा, सैनिक और जीई न्यूरॉन्स <कुल VMH neuronal आबादी का 20% शामिल है. इस समस्या को और जटिल इन न्यूरॉन्स के लिए एक पहचान सेलुलर मार्कर के कई मामलों में कमी,, है. इस प्रकार, यह स्पष्ट है कि अन्य तकनीकों, पैच दबाना विश्लेषण श्रमसाध्य है नहीं कर सकते हैं कि मूल्यवान विद्युत जानकारी, समय लेने वाली और कम उपज प्रदान करने के बावजूद.
अलग VMH न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग हू के अध्ययन के लिए अनुमति देता हैएक साथ न्यूरॉन्स की ndreds. कैल्शियम संवेदनशील रंगों परोक्ष रूप से neuronal गतिविधि में परिवर्तन से संबद्ध हों जो intracellular कैल्शियम परिवर्तन, मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. झिल्ली क्षमता संवेदनशील रंजक झिल्ली संभावित परिवर्तन की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है. सेलुलर झिल्ली क्षमता मापने intracellular कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन की तुलना में neuronal गतिविधि का एक और अधिक प्रत्यक्ष सूचकांक है. इसके अलावा, झिल्ली संभावित डाई (एमपीडी) इमेजिंग संभावित कार्रवाई संभावित फायरिंग बदल नहीं है और intracellular कैल्शियम का स्तर बदल नहीं सकता जहां झिल्ली क्षमता में छोटे परिवर्तन का पता लगाता है. इन प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक के दोनों किशोर चूहों 2-7 से VMH ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. परिणाम पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी साथ प्राप्त की तुलना में कम विस्तृत हो रहे हैं, इमेजिंग प्रयोगों की ताकत है कि वे एक साथ अनिवार्य रूप से ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स की एक महत्वपूर्ण संख्या में शामिल हैं जो कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी का मूल्यांकन करता है. एमपीडी इमेजिंग मैंअधिक समान रूप से पूरे VMH भर स्थानीयकृत हैं जो सैनिक न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, इस प्रकार अलग VMH (~ 15% सैनिक) में अध्ययन करने के लिए एक पर्याप्त आबादी प्रदान करते हैं. जीई न्यूरॉन्स घनी ventrolateral-VMN और एआरसी और VMN के बीच सेल गरीब क्षेत्र के लिए स्थानीय कर रहे हैं, जबकि इसके विपरीत, वे VMH भीतर न्यूरॉन्स की एक महत्वपूर्ण संख्या (<1% जीई) का प्रतिनिधित्व नहीं करते. इसके अलावा, पृथक न्यूरॉन्स का अध्ययन करके, astrocytic और presynaptic प्रभाव समाप्त हो जाते हैं. शारीरिक कनेक्शन और प्रक्रियाओं खो रहे हैं के बाद से यह पहला आदेश न्यूरॉन प्रभावों के अध्ययन में एक फायदा है, साथ ही एक नुकसान हो सकता है.
पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और एमपीडी / कैल्शियम डाई इमेजिंग दोनों में एक सीमित कारक छोटे जानवरों (उदाहरण. चूहों या चूहों <उम्र के 8 सप्ताह) का उपयोग करने की आवश्यकता है. इस वजह से उम्र के साथ होता है कि कमी हुई neuronal व्यवहार्यता के साथ संयोजन में वृद्धि हुई संयोजी ऊतक के लिए मुख्य रूप से है. मस्तिष्क टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी संवर्धन मेंएँ, बढ़ संयोजी ऊतक इसे और अधिक कठिन न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए बनाता है. बढ़ी हुई संयोजी ऊतक भी यह कठिन इमेजिंग अध्ययन के लिए स्वस्थ न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या को अलग कर देना पड़ता है. इसके अलावा, छोटे जानवरों से न्यूरॉन्स पैच दबाना रिकॉर्डिंग या इमेजिंग या तो के दौरान लंबे समय तक जीवित रहते हैं. हालांकि, युवा चूहों के उपयोग के एक प्रमुख सीमा हो सकती है. Neuronal गतिविधि और / या न्यूरोट्रांसमीटर या परिसंचारी पोषक तत्वों के लिए प्रतिक्रियाओं उम्र के साथ बदल जाते हैं. ऊर्जा संतुलन बारीकी से प्रजनन की स्थिति से जुड़ा हुआ है क्योंकि उदाहरण के लिए, ऊर्जा संतुलन को विनियमित hypothalamic न्यूरॉन्स postpubescent जानवरों पूर्व बनाम में अलग ढंग से प्रतिक्रिया हो सकती है. साथ ही, कई रोगों लंबे समय तक इलाज की आवश्यकता होती है या वयस्कता जब तक प्रकट नहीं करते. इस तरह के रोगों के प्रमुख उदाहरण आहार मोटापे या टाइप 2 मधुमेह रहे हैं. ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स इन रोगों में एक भूमिका निभा माना जाता है के बाद से हम सफलतापूर्वक एमपीडी इमेजिंग EXP में उपयोग के लिए स्वस्थ वयस्क VMH न्यूरॉन्स संवर्धन के लिए एक पद्धति विकसित कीeriments.
Protocol
Representative Results
Discussion
वयस्क चूहों से न्यूरॉन्स की गतिविधियों का अध्ययन करने में सक्षम होने की कुंजी स्वस्थ न्यूरॉन्स अलग कर देना करने की क्षमता है. वयस्क चूहों से hypothalamic न्यूरॉन्स की हदबंदी किशोर चूहों से न्यूरॉन्स की तुलना…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच R01 DK55619, एनआईएच R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
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