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Biology

रासायनिक मध्यस्थता interspecies बातचीत का पता लगाने के लिए coculture का प्रयोग

Published: October 31, 2013 doi: 10.3791/50863
Automatic Translation
1
1Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

बैक्टीरिया को अपने माइक्रोबियल पड़ोसियों के शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित करने की क्षमता है कि secreted यौगिकों का उत्पादन. यहाँ हम ठोस मीडिया पर बेसिलस subtilis के फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता उपभेदों के साथ मिट्टी रोगाणुओं के मिश्रण से इस तरह के रासायनिक मध्यस्थता interspecies बातचीत का पता लगाने की अनुमति देता है कि एक coculture स्क्रीन का वर्णन.

Abstract

प्रकृति में, जीवाणु शायद ही कभी अलगाव में मौजूद हैं, वे बजाय मेटाबोलाइट्स स्रावित द्वारा स्थानीय पर्यावरण में परिवर्तन है कि अन्य सूक्ष्म जीवाणुओं की एक विविध सरणी से घिरे हैं. ये मेटाबोलाइट्स उनके माइक्रोबियल पड़ोसियों के फिजियोलॉजी और भेदभाव मिलाना करने की क्षमता है और स्थापना और जटिल सूक्ष्म समुदायों के रखरखाव में होने की संभावना महत्वपूर्ण कारक हैं. हम इस तरह के रासायनिक मध्यस्थता माइक्रोबियल बातचीत की पहचान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति आधारित coculture स्क्रीन विकसित किया है. स्क्रीन ठोस मीडिया पर पर्यावरण रोगाणुओं के साथ एक फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता तनाव के संयोजन और कालोनियों coculture में विकसित करने की अनुमति शामिल है. यह ब्याज की एक विशेष phenotype व्यक्त करते है जब चुना बैक्टीरियल तनाव fluoresces इतना है कि फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर बनाया गया है (यानी biofilm गठन, sporulation, डाह कारक उत्पादन, आदि.) स्क्रीनिंग विकास शर्तों के तहत किया जाता है wheइस phenotype फिर से व्यक्त (और इसलिए संवाददाता तनाव आम तौर पर nonfluorescent है) नहीं है. एक पर्यावरण सूक्ष्म जीव इस phenotype सक्रिय हो जाता है कि एक metabolite स्रावित करता है, यह अगर माध्यम से diffuses और फ्लोरोसेंट संवाददाता निर्माण को सक्रिय करता है. इस उत्प्रेरण-metabolite उत्पादक सूक्ष्म जीव पता लगाया जा करने की अनुमति देता है: वे फ्लोरोसेंट कालोनियों के लिए सबसे समीपस्थ nonfluorescent कालोनियों हैं. इस प्रकार, इस स्क्रीन एक संवाददाता तनाव में एक विशेष शारीरिक प्रतिक्रिया को सक्रिय कि प्रसारण मेटाबोलाइट्स कि उत्पादन पर्यावरण रोगाणुओं की पहचान देता है. इस प्रकाशन के लिए चर्चा कैसे: एक) उचित coculture स्क्रीनिंग शर्तों का चयन, ख) रिपोर्टर और स्क्रीनिंग के लिए पर्यावरण रोगाणुओं को तैयार, ग) coculture स्क्रीन प्रदर्शन, घ) ख्यात जीवों उत्प्रेरण अलग, और ई) एक माध्यमिक स्क्रीन में उनकी गतिविधियों की पुष्टि करें. हम बेसिलस subtilis में biofilm मैट्रिक्स उत्पादन को सक्रिय कि मिट्टी जीवों के लिए स्क्रीन करने के लिए इस विधि विकसित

Introduction

हम बैक्टीरिया कि छिपाना मेटाबोलाइट्स पड़ोसी रोगाणुओं के शरीर विज्ञान और विकास को प्रभावित कैसे समझ में रुचि रखते हैं. कई मेटाबोलाइट्स अन्य रोगाणुओं पर उनके bioactive प्रभाव के लिए किया गया विशेषता है. दो अच्छी तरह से वर्णित उदाहरण अन्य रोगाणुओं की वैश्विक जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन जो अन्य रोगाणुओं के विकास को बाधित जो एंटीबायोटिक दवाओं,, और कोरम संवेदन अणुओं, शामिल हैं. हालांकि, बैक्टीरिया कोई ज्ञात bioactivities 1 है कि कई अन्य छोटे अणु प्राकृतिक उत्पादों का उत्पादन. हम बैक्टीरिया विकसित किया है और वे उन्हें सबसे ज्यादा बैक्टीरिया मौजूद हैं, जो भीतर जटिल सूक्ष्म समुदायों में उनके माइक्रोबियल पड़ोसियों के सेलुलर फिजियोलॉजी मिलाना करने की अनुमति है क्योंकि इन मेटाबोलाइट्स से कुछ का उत्पादन करने की क्षमता संरक्षित है कि परिकल्पना है.

बेसिलस subtilis प्रकार की कोशिकाओं

हम बेसिल शामिल है कि रासायनिक मध्यस्थता माइक्रोबियल बातचीत पर हमारी पढ़ाई ध्यान केंद्रित किया हैlus subtilis. यह सिर्फ इसलिए नहीं कि ग्राम पॉजिटिव मॉडल जीवाणु और उसके हेरफेर के लिए उपलब्ध परिणामी आनुवंशिक उपकरण के रूप में अपनी स्थिति की, बल्कि इसलिए भी कि विशेषता प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता का है. उदाहरण हैं कि कोशिकाओं में शामिल हैं:; मजबूत biofilm गठन के लिए आवश्यक है कि बाह्य मैट्रिक्स का निर्माण, पर्यावरण से डीएनए लेने के लिए सक्षम, तैराकी और 2 अन्य के बीच, sporulating. इन प्रकार की कोशिकाओं में से प्रत्येक उन्हें physiologically और / या शारीरिक रूप से अलग उनके आनुवंशिक रूप से समान भाई बहन से बनाता है कि एक विशेषता ट्रांसक्रिप्शनल regulon व्यक्त करता है. कई विकास शर्तों के तहत, अनेक प्रकार की कोशिकाओं बी की एक कॉलोनी के भीतर ही विभिन्न subpopulations समय में होना subtilis कोशिकाओं 3. बैक्टीरिया की कई प्रजातियों के अनुरूप सेल प्रकार विविधता का प्रदर्शन हो सकता है, इस घटना विशेष रूप से अच्छी तरह से बी में अध्ययन किया गया है subtilis.

UPR हैं कि विशेष रूप से, जीन मेंइन विशिष्ट बी से प्रत्येक के भीतर egulated subtilis प्रकार की कोशिकाओं की पहचान की गई है. ब्याज की इन माइक्रोबियल phenotypes की कई सीधे निरीक्षण करने के लिए मुश्किल या असंभव है क्योंकि ऐसी upregulated जीन की पहचान यहाँ वर्णित काम के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, हम नेत्रहीन, ऐसे ठोस (1.5%) अगर प्लेटों पर तैराकी के रूप में एक विशेषता का पता नहीं लगा सकते हैं, भले ही बी के एक subpopulation subtilis कोशिकाओं उन शर्तों के तहत 3 flagella उत्पादन. एक अन्य उदाहरण biofilm मैट्रिक्स उत्पादन है. मैट्रिक्स उत्पादन (यह macroscopically wrinkly कालोनियों में परिणाम के रूप में) कॉलोनी आकारिकी द्वारा कल्पना, लेकिन केवल कुछ मध्यम विकास पर है, और केवल विकास 4 के कई दिनों के बाद किया जा सकता है. हालांकि, जीन भेदभाव के दौरान upregulated हैं जो जानने के द्वारा, हम इन प्रकार की कोशिकाओं में सेलुलर भेदभाव के लिए मार्कर के रूप में कार्य है कि transcriptional संवाददाताओं से निर्माण कर सकते हैं.

रिपोर्टर निर्माणों

इन फ्लोरोसेंट टीranscriptional संवाददाताओं से सेल प्रकार विशिष्ट जीन एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन उदाहरण के लिए, एक पत्रकार जीन का उत्पादन ड्राइविंग के लिए प्रमोटरों से मिलकर. उदाहरण पी एक्स जीन एक्स के लिए प्रमोटर क्षेत्र को इंगित करता है, जहां पी (कोशिकाओं तैराकी के लिए) डायन-YFP, पी तप-YFP (biofilm मैट्रिक्स के उत्पादन की कोशिकाओं के लिए), और (कोशिकाओं sporulating के लिए) पी sspB-YFP, शामिल हैं. Phenotype के मूल निवासी विनियमन बरकरार रह गया है कि ताकि ये पत्रकार निर्माणों गुणसूत्र पर एक तटस्थ लोकस में एकीकृत (चित्रा 1 और नीचे देखें) कर रहे हैं. एक सेल इस phenotype व्यक्त करता है जब बहरहाल, अब, यह भी एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है. इससे हमें यह शारीरिक प्रतिक्रिया को सक्रिय कि रोगाणुओं के लिए स्क्रीन की अनुमति, विशेष प्ररूपी व्यवहार की सक्रियता का एक आसानी से कल्पना पढ़ने के लिए बाहर प्रदान करता है. ऐसे पत्रकारों सामान्यतः सूक्ष्म जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है, वे मोटे तौर पर identif को स्क्रीन में लागू नहीं किया गया हैइस विधि से पहले रोगाणुओं के बीच Y चयापचय चर्चा 5 में वर्णित किया गया.

सेल प्रकार विशिष्ट संवाददाता उपभेदों के डिजाइन और निर्माण में महत्वपूर्ण कारणों में से एक नंबर रहे हैं. निर्माणों के अन्य प्रकार निश्चित रूप से संभव हो रहे हैं, हालांकि हम विशेष रूप से ट्रांसक्रिप्शनल फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से उपयोग किया है. हम दो कारणों के लिए, हालांकि, हमारे स्क्रीन में सेल प्रकार भेदभाव के लिए मार्कर के रूप में translational fusions के उपयोग को हतोत्साहित: बेफिक्र देशी सेल प्रकार विशिष्ट प्रोटीन छोड़ने के लिए 1) इच्छा, और 2) मान्यता है कि एक फैलाना, सेल विस्तृत प्रतिदीप्ति (translational fusions के साथ आम) कोशिकाओं के भीतर स्थानीयकृत puncta से पता लगाने के लिए आसान हो जाएगा.

रिपोर्टर जीन चयन

एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में प्रतिलेखन उपयोग करने के लिए तय करने के बाद, रिपोर्टर जीन (जैसे lacZ, प्रतिदीप्ति, या luciferase) का चयन किया जाना चाहिए. LacZ कम से कम विशेष ज़रूरत का लाभ दिया हैपता लगाने के लिए उपकरण ized, लेकिन पर्यावरण रोगाणुओं के बीच झूठी सकारात्मक का एक बहुत अधिक संभावना है. हमारे हाथ में, लाख मिट्टी रोगाणुओं के बीच जीवों + की पृष्ठभूमि स्तर (; नहीं दिखाया डेटा मिट्टी रोगाणुओं का 10% एक्स लड़की प्लेटों पर) लाख + (नीला थे >>) बेहद उच्च था. हम इस प्रयास नहीं किया, हालांकि यह मध्यम में एक्स लड़की की एकाग्रता titrating द्वारा, यह एक एक्स लड़की संवाददाता के उपयोग की अनुमति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि संभव है. Luciferase का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है और सबसे orthogonal संवाददाता: पर्यावरण रोगाणुओं स्वाभाविक luminescent होने का लगभग कोई संभावना नहीं है. हालांकि, हम सबसे बहु अच्छी तरह प्लेटें में केवल स्थानीय क्षेत्रों स्कैन करने के लिए डिजाइन किए गए थे के रूप में यह मुश्किल है, पूरे पेट्री प्लेटें भर luminescence पता लगाने की अनुमति दी है कि हमारी संस्था में इंस्ट्रूमेंटेशन की पहचान करने के लिए मिला. यह भी एक साथ भौतिक है की अनुमति दी है एक तरह से luminescent कालोनियों दृश्यमान करने में जटिलताओं हो सकता हैउत्प्रेरण जीवों की olation. Fiduciaries का उपयोग कर यह संभव बना दिया है सकते हैं, हम बजाय बी में काम करने के लिए साबित हो रहे थे जो फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल पत्रकारों, उपयोग करने के लिए निर्वाचित subtilis, का पता लगाने और मिट्टी जीवों के बीच कम झूठी सकारात्मक दरों की पर्याप्त संवेदनशीलता प्रदान की है, और दृश्य और अलगाव प्रक्रियाओं दोनों के लिए आसानी से उपलब्ध उपकरण के उपयोग की अनुमति दी.

Fluorophore चयन

चयनित विशिष्ट fluorophore अपने बैक्टीरियल प्रजातियों पर निर्भर करेगा, आप प्रयोग कर रहे हैं अगर विकास मध्यम, और विशेष रूप से प्रतिदीप्ति फिल्टर उपलब्ध है सेट. हमारे उपकरण के साथ, हमने पाया है कि बी दोनों subtilis खुद को और YFP (पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन) फिल्टर इस्तेमाल किया गया, जब वे हमारे हाथ में GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) को उस रिपोर्टर बेहतर बनाने, प्रदर्शन कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर बड़े हो रहे थे अगर कालोनियों. फ्लोरोसेंट प्रोटीन का कोडोन उपयोग कर रहे हैंअक्सर या तो अपने बैक्टीरियल प्रजातियों में काम करने के लिए, या एक विधान प्रमोटर का उपयोग स्पष्ट रूप से यह परीक्षण करने के लिए साहित्य से जाना जाता है एक fluorophore चयन करने के लिए यह महत्वपूर्ण है, जिससे eukaryotes के लिए अनुकूलित. कभी विकसित फ्लोरोसेंट प्रोटीन वेरिएंट की एक बड़ी संख्या के सूत्रों स्पष्ट रूप से अपने प्रयोग 9 के लिए एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन के चयन पर मार्गदर्शन प्रदान जिनमें से कुछ 7,8, के एक नंबर में समीक्षा की गई है, जो 6 वर्तमान में उपलब्ध हैं.

प्रोमोटर चयन

एक प्रमोटर का चयन काफी हद तक अपने सेल प्रकार या ब्याज के phenotype पर निर्भर करेगा. ऐसे बी के रूप में जीवों के लिए subtilis, कुछ सेल प्रकार विशिष्ट रिपोर्टर जीन साहित्य में स्थापित किया गया है. अन्य जीवाणु उपभेदों के लिए, माइक्रोएरे या transcriptional डेटा का परीक्षण अत्यधिक परिस्थितियों में upregulated हैं जो जीन के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, जहां ब्याज मैं के अपने सेल प्रकारएस प्रकट. एक ताजा अध्ययन बी के प्रतिलेखन सूचीबद्ध टाइलिंग प्रोटीन 10 का उपयोग करते हुए 104 विभिन्न विकास शर्तों के तहत subtilis. इस पत्र जीन अत्यधिक कम अच्छी तरह से विशेषता phenotypes के लिए अमूल्य है, जो विभिन्न परिस्थितियों में upregulated हैं जिसके बारे में व्यापक जानकारी प्रदान करता है.

बल्कि ब्याज की हर जीन के लिए सटीक प्रमोटर क्षेत्रों मानचित्रण से, हम आम तौर पर बस प्रवर्तक के रूप में जीन के अपस्ट्रीम अनुक्रम 200-500 बी पी का उपयोग करें. सही अनुक्रम लंबाई जीनोमिक संदर्भ पर निर्भर करता है: आवश्यक खुला पढ़ने फ्रेम पड़ोसी से ऊपर को कोडिंग के क्षेत्रों सहित बचने के लिए जब छोटे क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जाता है.

तटस्थ स्थलों और एकीकरण

आपके बैक्टीरियल तनाव में रिपोर्टर का निर्माण एक फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता तनाव को डिजाइन करने में अंतिम सवाल बन जाता है को बनाए रखने के लिए. बैक्टीरिया में, ब्याज की जीन अक्सर बनाए रखा हैएंटीबायोटिक चयन का उपयोग plasmids पर. हालांकि, यह पर्यावरण के रोगाणुओं की हत्या के बिना coculture दौरान एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने के लिए संभव नहीं हो सकता. Plasmids stably अपने बैक्टीरियल प्रजातियों में रखा जाता है, तो यह आपके बैक्टीरिया जांच के लिए अपने संवाददाता तैयार करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में एक प्लाज्मिड जनित संवाददाता युक्त हो जाना संभव हो, और फिर आशा में coculture के दौरान ही एंटीबायोटिक दवाओं को खत्म हो सकता है कि प्लाज्मिड होगा पर्याप्त प्रतिदीप्ति के लिए अनुमति देने के लिए बनाए रखा जाना. Plasmids आसानी से आपके जीवाणु में खो जाते हैं, या तनाव परिस्थितियों में खो जाते हैं, तो हालांकि, यह एक व्यवहार्य विकल्प नहीं होगा. कई मामलों में, सबसे अच्छा समाधान भी चयन के अभाव में रिपोर्टर के स्थिर रखरखाव की अनुमति देता है जो बैक्टीरिया के गुणसूत्र, पर पत्रकार के निर्माण को एकीकृत करने के लिए किया जाएगा. अपने हित के जीन की सामान्य अभिव्यक्ति या विनियमन को बाधित नहीं करने के एकीकरण के लिए आदेश में, हम गुणसूत्र पर एक अस्थानिक साइट में एकीकृत करने की सलाह देते हैं कि सीएN एक के रूप में कार्य "तटस्थ ठिकाना." बी में subtilis इन एकीकरण साइटों जीन हैं कि - जब उत्परिवर्तित - (integrants एंटीबायोटिक चयन बिना पहचान करने की अनुमति) कुछ कम से कम मीडिया में एक phenotype हूं, अभी तक अमीर मीडिया में वृद्धि या sporulation दरों में परिवर्तन नहीं करते हैं, और amyE, Laca के रूप में इस तरह के जीन शामिल हैं, thrC, pyrD, gltA, और एसएसीए (स्टार्च का उपयोग करने की क्षमता को संदेश, β-galactosides, threonine, uracil, ग्लूटामेट, और सुक्रोज, क्रमशः) 11-13.

इन जीनों में एकीकरण बी में कई वर्षों के लिए मज़बूती से इस्तेमाल किया गया है subtilis (विशेष रूप से amyE और Laca पर), इसी तरह ज्ञान कई अन्य प्रजातियों के जीवाणु में जीनों के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता. फेज लगाव साइटों का उपयोग तटस्थ गुणसूत्र एकीकरण साइटों के लिए महान विकल्प हैं: कई प्रजाति विशेष 14-16, साथ ही इस तरह के Tn7 लगाव साइट (ATT Tn7) के रूप में सामान्य एकीकरण साइटोंकई प्रजातियों के जीवाणु 17,18 में पहचान की है और जीन सम्मिलन के लिए उपयोग किया गया.

पर्यावरण रोगाणुओं

हम अपने coculture स्क्रीन के लिए पर्यावरण रोगाणुओं का एक सीधा स्रोत के रूप में मिट्टी का उपयोग करें. मिट्टी रोगाणुओं के एक उच्च विविधता शामिल है, और इन जीवों की कई प्राकृतिक उत्पादों की समृद्ध स्रोत हैं. (मिट्टी से बैक्टीरिया की पूर्व अलगाव के बिना) हमारे फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता तनाव के साथ प्लेटों पर सीधे रखा मिट्टी का तरल निलंबन का उपयोग करके, हम बहुत प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को आसान बनाने में. मिट्टी या तो तुरंत कटाई के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है, या भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया. तत्काल उपयोग अच्छी तरह से ठंड से बच नहीं होगा कि उन सहित रोगाणुओं का एक बड़ा विविधता संभावित उगाया जा सकता है कि लाभ है. यह प्रयोग किया जाना चाहिए कि स्क्रीन प्लेटों की संख्या बढ़ रही है, इन नमूनों से कृषि योग्य मिट्टी जीवों की एकाग्रता अज्ञात है कि नुकसान है. डेलAyed उपयोग कालोनियों के एक अनुकूलित संख्या प्रत्येक स्क्रीन थाली पर विकसित किया जा करने की अनुमति, प्रत्येक मिट्टी स्रोत के लिए CFU / एमएल अग्रिम में निर्धारित किया जा सकता है कि लाभ है. हालांकि, यह मिट्टी जीवों ठंड जीवित करने में सक्षम होने की आवश्यकता है.

अधिक से अधिक वंशावली विविधता के रूप में हमारे मैट्रिक्स प्रेरण स्क्रीन में पहचान की हिट फिल्मों में मनाया गया: (मिट्टी के सूत्रों आईई) की जांच की जा रही inducer पूल का विविधीकरण एक ही मिट्टी पर गहराई से स्क्रीनिंग की तुलना में नई interspecies बातचीत की पहचान करने में अधिक प्रभावी प्रतीत होता है कि नोट अतिरिक्त मिट्टी के सूत्रों के बजाय और अधिक अच्छी तरह एक ही मिट्टी स्रोतों (ईए टांग और आर Kolter, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, अप्रकाशित परिणाम) स्क्रीनिंग से जांच की गई.

अवलोकन

हम यहाँ वर्णन दृष्टिकोण अपने तकनीकी आवश्यकताओं के संदर्भ में स्पष्ट है. यह शामिल है: 1) बी में एक फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता निर्माण subtilis या एकब्याज की अन्य प्रजातियों के जीवाणु, 2), इस संवाददाता सक्रिय नहीं है जिन स्थितियों की पहचान 3) (हमारे मामले मिट्टी में, लेकिन अन्य स्रोतों के बजाय उपयोग किया जा सकता है) इस संवाददाता तनाव और जांच की जानी जीवों की aliquots तैयारी 4) इन मिश्रण ठोस मीडिया, 5) की पहचान करने और ख्यात जीवों उत्प्रेरण अलग, और 6) इन जीवों वास्तव में एक माध्यमिक स्क्रीन में इस phenotype को सक्रिय करते हैं कि इस बात की पुष्टि पर रोगाणुओं के दो सेट. एक बार की पहचान, इन जीवों और उनके मेटाबोलाइट्स जीवाणु शरीर विज्ञान और सूक्ष्म बातचीत का अध्ययन करने के लिए, बैक्टीरियल व्यवहार ठीक करने के लिए, और संभवतः भविष्य चिकित्सकीय यौगिकों के लिए ही उपन्यास scaffolds के कार्य करने के लिए रासायनिक उपकरण के साथ हमें प्रदान करते हैं.

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Protocol

1. एक पत्रकार जीन का चयन करें और एक फ्लोरोसेंट Transcriptional रिपोर्टर का निर्माण

बी subtilis के लिए:

  1. बेसिलस subtilis में फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाताओं के निर्माण का वर्णन एक प्रोटोकॉल के लिए संदर्भ 19 में जौव लेख देखें.

अन्य प्रजातियों के जीवाणु के लिए:

  1. ब्याज की शारीरिक प्रतिक्रिया दौरान upregulated है कि एक जीन की पहचान. यह वर्तमान साहित्य या विशेष परिस्थितियों में सूक्ष्म जीव के transcriptional विश्लेषण के आधार पर किया जा सकता है.
  2. Phenotype में परिवर्तन के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करने के लिए इस जीन के लिए एक फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता का निर्माण. इस निर्माण (चित्रा 1 देखें) एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन ड्राइविंग इस upregulated जीन के प्रमोटर भी शामिल करना चाहिए.
  3. गुणसूत्र पर एक तटस्थ लोकस में इस निर्माण को एकीकृत. यह सुनिश्चित करता है कि देशी regब्याज की जीन की आबादी बाधित, और पर्यावरण रोगाणुओं के विकास के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि प्लाज्मिड चयन तंत्र (जैसे एंटीबायोटिक दवाओं) की आवश्यकता टाल नहीं है.

2. Coculture शर्तों का निर्धारण

बी subtilis पी तप-YFP पत्रकार के लिए:

  1. इस्तेमाल की 0.1x लेग, इस संवाददाता के लिए लेनोक्स (1 ग्राम tryptone, 0.5 ग्राम खमीर निकालने, प्रति लीटर 0.5 ग्राम NaCl) मध्यम, बी के बाद subtilis मैट्रिक्स उत्पादन Luria रसा 20 पर कम है. इस माध्यम की अनुमति देता बी 5 बढ़ने की मिट्टी से विविध taxa की अनुमति है जबकि subtilis कालोनियों submillimeter लेकिन नमूदार आकार को विकसित करने के लिए.
  2. संभावित पीएच परिवर्तन को कम करने के लिए 100 मिमी MOPS बफर शामिल करें.

अन्य प्रजातियों के जीवाणु के लिए:

  1. प्रयोग activatio transcriptional डेटा प्रकाशित या अनुभव से सूक्ष्म जीव बढ़ता है, जहां एक की पहचान करने के लिए विभिन्न संस्कृति की स्थिति का परीक्षण लेकिनफ्लोरोसेंट संवाददाता के एन (संवाददाता तनाव उत्प्रेरण रोगाणुओं के साथ coculture में उगाया जाता है जब अपने सक्रियण पता लगाया जा करने की अनुमति है.) नगण्य है
  2. (जैसे मिट्टी के रूप में) oligotrophic वातावरण से पर्यावरण रोगाणुओं स्क्रीनिंग जब उच्च पोषक तत्व की स्थिति 21 के साथ प्रस्तुत जब कई oligotrophic बैक्टीरिया विकसित नहीं है, के बाद से (पारंपरिक अमीर सूक्ष्मजीवविज्ञानी मीडिया के सापेक्ष) कम पोषक तत्व सामग्री के साथ एक माध्यम का उपयोग. एक कम मध्यम पोषक भी स्क्रीन के throughput बढ़ाने, कॉलोनी का आकार कम कर देता है.
  3. कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और अच्छा ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ एक माध्यम का चयन करें.
  4. संवाददाता तनाव और पर्यावरणीय रोगाणुओं दोनों एक साथ विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए विकास तापमान का अनुकूलन.
  5. एक बफरिंग एजेंट के अलावा विचार करें. ऐसी बातचीत रुचि के हैं, जब तक प्लेटों में बफर का उपयोग करते हैं, शरीर क्रिया विज्ञान के 22 में पीएच की मध्यस्थता परिवर्तन का पता लगाने की संभावना कम हो जाएगा.

3. रिपोर्टर Aliquots तैयार करें

बी subtilis पी तप-YFP पत्रकार के लिए:

  1. एक बाँझ दन्तखुदनी या applicator छड़ी का उपयोग कर एक ताजा लेग थाली पर -80 डिग्री सेल्सियस जमे हुए स्टॉक से स्ट्रीक संवाददाता तनाव.
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ो
  3. एक ठोस माध्यम पर विकास से उत्पन्न होने वाली पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए तरल संस्कृति में धारावाहिक dilutions प्रदर्शन:
    1. लेग की एक 5 एमएल तरल संस्कृति टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ हो जाना
    2. संस्कृति एक आयुध डिपो ~ 0.6 600 तक पहुँच जाता है, 0.02 के एक आयुध डिपो से 600 5 मिलीलीटर ताजा लेग में पतला.
    3. संस्कृतियों आयुध डिपो 600 ~ 0.6 तक पहुँच जाता है जब तक झटकों के साथ फिर से 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ने.
    4. सीरियल विकास dilutions 3x की कुल दोहराएँ.
    5. अंतिम धारावाहिक कमजोर पड़ने संस्कृति 600 ~ 0.4 आयुध डिपो बढ़ता है.
  4. 15-20% ग्लिसरॉल जोड़ें.
  5. विभाज्य 50-200 0.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में μl और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज
  6. मासंवाददाता के nonfluorescent माता पिता तनाव के लिए के बराबर aliquots (वे माध्यमिक स्क्रीनिंग के दौरान आवश्यक हो जाएगा).

अन्य प्रजातियों के जीवाणु के लिए:

  1. एक कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है कि कोशिकाओं का प्रयोग (यानी रिपोर्टर में इस्तेमाल प्रमोटर से थोड़ा अभिव्यक्ति है, जहां परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं).
  2. (विवरण के लिए ऊपर अनुभाग देखें) बनाओ और कालोनियों का एक उचित संख्या प्रत्येक coculture स्क्रीन थाली पर विकसित किया जा सकता है, ताकि संवाददाता तनाव के ज्ञात CFU / एमएल (कॉलोनी मिलीलीटर प्रति इकाइयों के गठन) युक्त aliquots फ्रीज.
  3. Nonfluorescent माता पिता के तनाव के लिए बराबर aliquots बनाओ (वे माध्यमिक स्क्रीनिंग के दौरान आवश्यक हो जाएगा).

4. मिट्टी के नमूने प्राप्त

  1. उजागर सतह मिट्टी के ऊपर 0.5 सेमी discarding, बाँझ शंक्वाकार ट्यूब या एक रंग का उपयोग बाँझ बैग में मिट्टी लीजिए.
  2. 1 ग्राम प्रति 10 मिलीलीटर के अनुपात में बाँझ खारा (0.85% NaCl) जोड़ेंएक मिट्टी गारा बनाने के लिए मिट्टी की.
  3. मिट्टी के कणों से बैक्टीरिया को बेदखल करने के लिए एक विधि का चयन करें: ताजा नमूना से एक) तत्काल उपयोग या नमूना की ठंड के बाद बी) में देरी का उपयोग करें.
    1. तत्काल उपयोग के लिए, 1 मिनट के लिए भंवर घोल.
    2. देरी उपयोग के लिए, सम्मिश्रण चक्र के बीच 1 मिनट के लिए बर्फ पर ब्लेंडर जार टिकी हुई रखकर, तीन 1 मिनट चक्र के लिए ब्लेंडर में मिट्टी गारा मिश्रण.
  4. मिट्टी गारा ~ 1 मिनट के लिए समझौता करते हैं.
  5. एक ताजा ट्यूब ऊपरी जलीय परत चाल.
  6. 15-20% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लिसरॉल जोड़ें.
  7. विभाज्य 50-200 0.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में μl और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज

5. जमे हुए रिपोर्टर और मिट्टी aliquots की CFU / एमएल का निर्धारण करें

  1. एक जमी मिट्टी और पत्रकार विभाज्य पिघलना. मिट्टी रोगाणुओं बर्फ पर thawed किया जा सकता है. क्योंकि बी 4 डिग्री सेल्सियस पर subtilis lyses, उन aliquots कम तापमान पर बिताए समय को कम करने के लिए आरटी पर जल्दी thawed किया जाना चाहिए.
  2. दो दोहराने SERIA बनाओ0.1x लेग या अन्य isotonic बफर में एल dilutions (10 -8 के लिए).
  3. Coculture स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाएगा जो एक ही माध्यम से अगर प्लेटों पर प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने की प्लेट 5 μl स्पॉट.
  4. आर टी (या स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाएगा कि तापमान) में आगे बढ़ें.
  5. अगले दिन, हर जगह के भीतर कालोनियों की संख्या गिनती और जमे हुए aliquots में से प्रत्येक की CFU / एमएल की गणना.

6. फैलाओ स्क्रीन प्लेटों के लिए विभाज्य सांद्रता की पुष्टि

  1. 5.1 कदम के रूप में एक जमे हुए विभाज्य पिघलना.
  2. 5 एक्स 10 5, 1 एक्स 10, 1 x 10 5, 2.5 x 10 5 को पतला 6, और 2.5 x 10 7 CFU / एमएल.
  3. व्यक्तिगत प्लेटों के केंद्र के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने की 50 μl हाजिर जोड़ें. ये गणना प्रति प्लेट 25,000 कालोनियों के इष्टतम है, साथ ही 2 के साथ प्लेटें उपज चाहिए - और 5 - सबसे अच्छा वास्तविक कमजोर पड़ने निर्धारित करने की अनुमति है, और अधिक और कम गुना.
  4. लगभग 20 बाँझ गिलास (3 मिमी) मोतियों से जोड़ेंधीरे थाली पर उन्हें दोहन. मोती एक तुला ग्लास प्रसारित करता है थाली भर कालोनियों का एक और भी वितरण प्रदान करते हैं.
  5. तरल अवशोषित किया गया है, जब तक benchtop पर प्लेटें रखने और उन्हें आगे और पीछे मिलाते हुए, आप काम के रूप में उन्हें घूर्णन द्वारा कोशिकाओं बिखरा हुआ है. थाली सूखी है एक बार मोती हिला जारी नहीं है, अन्यथा यह बैक्टीरिया को मारने के लिए शुरू हो जाएगा.
  6. अधिक प्लेटों पलटें और इथेनॉल युक्त कचरे बीकर में मोती त्यागें.
  7. प्लेट (उदाहरण के लिए 24 डिग्री सेल्सियस / आर टी) अपने परख के लिए सही तापमान पर अपनी परख (जैसे 24 घंटा) के समय के लिए बढ़ता है.
  8. एक विदारक त्रिविमेक्ष का प्रयोग, देखने के दो या अधिक क्षेत्रों में कालोनियों की संख्या गिनती.
  9. क्षेत्र के प्रति कालोनियों की संख्या की गणना करें, और प्रत्येक प्लेट पर कितने कालोनियों का निर्धारण.
  10. आवश्यक के रूप में भविष्य dilutions समायोजित करें. कालोनियों की वास्तविक संख्या प्रत्येक तुलनीय स्क्रीन प्लेट पर एक ही नंबर होने के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है.

  1. 5.1 कदम के रूप में पिघलना संवाददाता विभाज्य (और जमे हुए अगर मिट्टी विभाज्य).
  2. 0.1x लेग या अन्य कम पोषक तत्व, isotonic समाधान में (धारा 6 में अनुकूलित सांद्रता) संवाददाता पतला.
    1. जमी मिट्टी के लिए: 0.1x लेग या अन्य कम पोषक तत्व, isotonic समाधान में धारा 6 में अनुकूलित एकाग्रता के लिए पतला.
    2. ताजा मिट्टी के लिए: मिट्टी गारा की CFU / एमएल 10 -4 से 10 -9 CFU / एमएल को लेकर सकता है कि भविष्यवाणी के आधार पर नए सिरे से मिट्टी गारा की dilutions, बनाओ.
  3. स्पॉट coculture स्क्रीन थाली के केन्द्र पर मिट्टी और पत्रकार dilutions की 50 μl. इसके अलावा, थाली अकेले मिट्टी और अकेले नियंत्रण के रूप में संवाददाता.
  4. कदम 6.4-6.6 में वर्णित के रूप में ग्लास मनकों का उपयोग बिखरा हुआ है.
  5. अपने फ्लोरोसेंट संवाददाता, लकीर को सक्रिय या इन परिस्थितियों में अपने संवाददाता प्लेट और स्क्रीनिंग के दौरान एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए विकसित ज्ञात है कि विकास की स्थिति कर रहे हैं. 28 घंटा (या अपने संवाददाता / परख के लिए उचित रूप में) - 24 के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर सेते

8. प्रतिदीप्ति के लिए स्क्रीन coculture प्लेट्स

  1. कालोनियों तेज कर रहे हैं कि इतने brightfield रोशनी का उपयोग करना, अपने त्रिविमेक्ष ध्यान केंद्रित.
  2. अपनी मिट्टी नमूना कालोनियों autofluorescent गया है कि यह निर्धारित करने के लिए मिट्टी केवल प्लेटों को देखो. यदि हां, तो यह मिट्टी (माध्यमिक स्क्रीनिंग में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ) झूठी सकारात्मक की एक उच्च दर में हो सकता है.
    1. एक inducer वे झूठी सकारात्मक रूप में पता लगाया जाएगा मौका (चित्रा 2) को कम करने, कई पत्रकार कालोनियों से घिरा हो जाएगा कि मौका बढ़ाने के लिए अपनी coculture प्लेटों में मिट्टी: संवाददाता के एक उच्च अनुपात का प्रयोग करें.
    2. एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एक अलग चैनल में उत्सर्जन करता है कि एक) का उपयोग करें.
  3. परख समय निर्धारित करते हैं. सबसे नए पत्रकारों के लिए, संभावित प्रेरण के समय अज्ञात है, और इस तरह अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए.
    1. जैसे ही कालोनियों विदारक त्रिविमेक्ष (बढ़ाई ~ 30X) के साथ स्पष्ट रूप से दिखाई देने लगते हैं और वृद्धि नहीं रह गया है और / या पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बहुत अधिक हो जाता है जब तक समय - समय प्लेटों की जांच जारी रखने के रूप में प्रतिदीप्ति के लिए जांच शुरू.
    2. संभावित प्रेरण के समय खिड़की एक विशेष संवाददाता के लिए निर्धारित किया जाता है एक बार, यह स्क्रीन प्लेटों की निगरानी को सरल बनाने, कि रिपोर्टर युक्त सभी coculture प्लेटों के लिए समान होना चाहिए. B के लिए subtilis पी तप-YFP संवाददाता, प्लेटों की जांच करने के लिए उचित समय कोशिकाओं चढ़ाना के बाद 24-28 घंटे के बीच है, बी के लिए subtilis पी sspB-YFP संवाददाता, यह विकास की 26-32 घंटे के बीच है.
  4. अपने प्रतिदीप्ति संवेदनशीलता को अधिकतम:
    1. अपने प्रतिदीप्ति गुंजाइश विदारक एक अंधेरे कमरे में है या अंधकार पर्दे से घिरे सुनिश्चित करें. प्रेरण संभावना एक अनिवार्यता से उत्पादित एफपी से कम तीव्र हो और अधिक से अधिक संवेदनशील आवश्यकता होगीपता लगाने के लिए tivity.
    2. प्रतिदीप्ति दीपक को स्थिर करने के लिए और अपनी आँखें अपने coculture प्लेट (कम से कम 1-2 मिनट) से प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए प्रयास करने से पहले अंधेरे को समायोजित करने के लिए समय की अनुमति दें.
  5. एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करना (यदि आप एक है), तो आप उपयोग कर रहे हैं बढ़ाई आप प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए अनुमति देता है कि यह सुनिश्चित करें. बढ़ाई आमतौर पर सबसे अच्छा है देखने के अपने क्षेत्र लगभग अपने ठेठ कॉलोनी व्यास (200-400x) 30-50x है.
  6. चमकदार रोशनी बंद करें और अपने प्रतिदीप्ति के लिए शटर खुला.
  7. अपनी आंखों के अंधेरे को समायोजित करने के बाद, धीरे धीरे उज्ज्वल स्पॉट की तलाश में, देखने के अपने क्षेत्र में आगे और पीछे की थाली ले जाएँ.
    1. प्लेट के ऊपर से शुरू करें और आप प्लेट के नीचे की ओर ले जाने के रूप में थाली पक्ष की ओर ले जाने के लिए एक वक्र पैटर्न का उपयोग करें.
    2. अभ्यास प्लेट को स्थानांतरित करने के लिए धीरे धीरे के लिए एक समझ पाने के लिए, और आप पूरे सुर कवर कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित हो brightfield में थाली आगे बढ़क्षेत्र चेहरा.
    3. धीरे - धीरे काफी कालोनियों धुँधली नहीं हो जाते कि थाली ले जाएँ. बल्कि यह मिस क्षेत्रों से सतह oversample करने के लिए बेहतर है.
    4. एक पूर्ण स्वीप के बाद, थाली 90 डिग्री और दोहराने की बारी है. मानव आँखें इस विधि के माध्यम से भी बेहोश प्रतिदीप्ति का पता लगाने में उल्लेखनीय अच्छा कर रहे हैं.
  8. आप प्रतिदीप्ति का पता लगाने, थाली बढ़ रोकने और वापस जाने के लिए और फ्लोरोसेंट क्षेत्र लगता है.
  9. धीरे धीरे पर brightfield टर्निंग, प्रतिदीप्ति एक जीवाणु कॉलोनी (और नहीं autofluorescent मिट्टी कतरे या मीडिया घटकों) के साथ जुड़ा हुआ है कि क्या यह निर्धारित. यदि हां, फ्लोरोसेंट कॉलोनी को समीपस्थ nonfluorescent कालोनियों ख्यात उत्प्रेरण जीव हैं.

9. ख्यात उत्प्रेरण जीवों को अलग

  1. एक बार प्रेरित (फ्लोरोसेंट) कालोनियों की पहचान की गई है, उत्प्रेरण यौगिकों स्रावित उन कालोनियों को अलग.
    1. पत्रकार कालोनियों का एक उच्च पर्याप्त एकाग्रता थाली पर बढ़ रहे हैं(> 0.5:1 संवाददाता: मिट्टी CFU), ख्यात उत्प्रेरण कालोनियों (फिर से, चित्रा 2 देखें) कई फ्लोरोसेंट कॉलोनियों से घिरा हो जाएगा.
    2. मामलों में जहां coculture वृद्धि की जटिलता, inducer है जो कॉलोनी यह अस्पष्ट बनाता माध्यमिक स्क्रीन में बाद में परीक्षण के लिए कई संभावित उत्प्रेरण कालोनियों को अलग.
  2. आप देखने के क्षेत्र के केंद्र में लेने के लिए चाहते कालोनियों स्थानीयकरण.
    1. वे थाली के किनारे के करीब हैं, तो थाली के होंठ (आप दाएँ हाथ के हैं यानी अगर बाईं तरफ थाली के होंठ डाल) दूर अपने प्रमुख हाथ से है, इसलिए है कि थाली बारी बारी से. इससे आप अपने चुनने की सटीकता को बेहतर बनाता है, जो एक कम कोण, पर कालोनियों दृष्टिकोण करने के लिए अनुमति देता है.
  3. इस्तेमाल किया सुझावों में त्यागने के लिए पास करने पर लकीर ख्यात उत्प्रेरण जीवों, साथ ही एक बेकार बीकर को ताजा प्लेटें प्लेस.
  4. पर प्रतिदीप्ति दीपक छोड़कर, चमकदार रोशनी धीरे धीरे बारीआप (आकार और स्थिति से) फ्लोरोसेंट कॉलोनी और आसपास के ख्यात उत्प्रेरण जीवों की पहचान करने में सक्षम हो जाएगा, जिससे कि पर. आप कोई प्रतिदीप्ति और केवल उज्ज्वल प्रकाश है जब वहाँ लेने के लिए चाहते कालोनियों की पहचान करने में सक्षम होना प्रकाश के साथ आगे और पीछे एक कई बार जाने की जरूरत हो सकती है.
  5. एक बाँझ, गोल 200 μl जेल लोडिंग टिप लेने के लिए और एक पेंसिल की तरह इसे पकड़ने के लिए एक गिलास छड़ी (200 मिमी लंबे एक्स 5 मिमी व्यास) का प्रयोग करें. यह आप व्यक्तिगत कालोनियों को अलग करने के लिए इस्तेमाल करेगा उठा उपकरण है.
  6. काम की सतह पर यह स्थिर करने के लिए मंच के खिलाफ अपने बाहरी हथेली आराम. अपने उठा उपकरण को स्थिर करने के लिए अपने हाथ का भीतरी, अंगूठे पक्ष पर अपने दूसरे हाथ रखें.
  7. यदि आवश्यक हो, आप चुनना चाहते कालोनियों की पहचान करने के लिए प्रतिदीप्ति और brightfield विचारों के बीच फिर से फ्लिप.
  8. थाली की सतह से ऊपर पिपेट टिप रखते हुए देखने के अपने क्षेत्र में यह कदम और तुम्हें लेने के लिए चाहेंगे कॉलोनी ऊपर यह केंद्र. टिप ध्यान से बाहर हो जाएगा.
  9. (खुर्दबीन मंच या काम की सतह पर आराम कर रहा है जो) अपने हाथ के बाहरी छोर का प्रयोग, धीरे धीरे नीचे उठाया जाएगा कॉलोनी में पिपेट टिप धुरी. कैसे कई अन्य कालोनियों टिप संपर्कों को कम करने की कोशिश कर रहा है, बहुत ही हल्के ढंग से स्पर्श करें.
  10. एक ताजा थाली के एक वर्ग पर उठा उपकरण, लकीर घूर्णन बिना. Gouging अगर बचने के लिए एक कोमल स्पर्श के साथ बिखरा हुआ है. इस विधि द्वारा हस्तांतरित कोशिकाओं की संख्या (कालोनियों आम तौर पर हेर तुलना में बहुत छोटे हैं) काफी छोटा है, क्योंकि एक भी निरंतर लकीर अलग कालोनियों में परिणाम होगा.
  11. अन्य ख्यात उत्प्रेरण जीवों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं.
  12. 24 डिग्री सेल्सियस (या आपके परख के तापमान) प्लेटें सेते हैं.

10. स्ट्रीक ख्यात उत्प्रेरण जीवों पृथक एकल कालोनियों प्राप्त करने के लिए

  1. एक त्रिविमेक्ष का उपयोग करना, निर्धारित - कॉलोनी संरचना या आकृति विज्ञान पर आधारित है - अपने ख्यात उठाया इंडस्ट्रीज़ में से प्रत्येक के भीतर निहित विभिन्न कॉलोनी प्रकार के होते हैं कि क्याजीवों ucing.
    1. आप संभावित कॉलोनी मतभेदों का पता लगाने के लिए ऊपर के साथ ही नीचे से दोनों से कालोनियों रोशन कर सकते हैं जहां एक मंच का उपयोग कालोनियों को देखो.
  2. एक ताजा थाली पर प्रत्येक अलग morphotype Restreak और बढ़ी जब तक सेते हैं.
  3. एक बार और Restreak और बढ़ता है. विभिन्न morphotypes जारी रहती है, पवित्रता को restreak जारी है.

11. माध्यमिक स्क्रीन में ख्यात उत्प्रेरण जीवों जांचना

  1. फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता सक्रिय कर रहे हैं, जो निर्धारित करने के लिए एक उच्च माध्यमिक स्क्रीन में ख्यात उत्प्रेरण जीवों के सभी जांचना. माध्यमिक स्क्रीन ख्यात उत्प्रेरण जीवों समझौता या देखा जाता है जो पर नियंत्रण प्लेटों के साथ फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता तनाव की microcolonies के एक लॉन, के होते हैं.
  2. एक ही एकाग्रता एक में फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता तनाव का एक microcolony लॉन (युक्त एक: तीन समान प्लेटें सेट करेंs) coculture स्क्रीनिंग के दौरान इस्तेमाल किया गया था, और कोई लॉन युक्त एक, एक एक microcolony एक प्रतिदीप्ति संवाददाता बिना जंगली प्रकार माता - पिता तनाव के लॉन युक्त.
    1. प्लेट ओरिएंटेशन निर्धारित करने के लिए एक थाली के पीछे के निशान के ऊपर.
    2. पैच / स्थानों के लिए स्थितीय मार्करों जोड़ें, दस ख्यात उत्प्रेरण जीवों प्लेटों के प्रत्येक सेट (चित्रा 3) पर परीक्षण किया जा सकता है.
    3. पिघलना लॉन aliquots 5.1 कदम के रूप में (रिपोर्टर और nonfluorescent माता पिता तनाव).
    4. कदम 6.4 में के रूप में बाँझ मोती का उपयोग लॉन प्लेट (या अन्य अनुकूलित dilutions) पर एक 5 x 10 5 CFU / एमएल कमजोर पड़ने की 50 μl बिखरा हुआ है.
    5. प्लेटें शुष्क करते हैं.
  3. पैच या ख्यात जीवों उत्प्रेरण स्पॉट:
    1. एक आसान और तेजी से दृष्टिकोण वांछित है पट्टी का चयन करें, और यह जमा कोशिकाओं की एक कम सटीक संख्या के लिए स्वीकार्य है. पैच करने के लिए:
      1. परीक्षण करने के लिए कॉलोनी के लिए एक बाँझ दन्तखुदनी टच - कोशिकाओं के सभी लेने के लिए नहीं है.
      2. खाली थाली पर पैच (एक छोटी सी लकीर बनाने के लिए).
      3. रिपोर्टर की थाली पर ताजा दंर्तखोदनी के साथ पैच दोहराएँ.
      4. नियंत्रण की थाली पर ताजा दंर्तखोदनी के साथ पैच दोहराएँ.
    2. एक मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण वांछित है खोलना का चयन करें. खोलना जमा कोशिकाओं की संख्या (पूर्ण विवरण के लिए 5 संदर्भ देखें) समान्य होने के लिए अनुमति देता है, और तुलना करने के लिए अलग उत्प्रेरण जीवों के सापेक्ष शक्ति परमिट. हाजिर करने के लिए:
      1. Resuspend ख्यात एक बाँझ प्लास्टिक क्युवेट में तरल मीडिया के 1 मिलीलीटर में जीवों उत्प्रेरण.
      2. आयुध डिपो resuspensions की 600 लो.
      3. सूत्र एक्स = 250 ÷ (आयुध डिपो 600-0.5) का उपयोग करना, एक आयुध डिपो 0.5 के 600 के साथ एक समाधान पाने के लिए तरल माध्यम के 500 μl को प्रत्येक मेजबान के लिए मात्रा एक्स जोड़ें. आप एक ही मात्रा (50 उपयोग कर सकते हैं क्योंकि आयुध डिपो के मानक के अनुसार करने के लिए कई dilutions प्रदर्शन जब इस विधि आवश्यक pipetting कदम को सरलअपने dilutants सभी के लिए 0 μl).
      4. तीन प्लेटों में से प्रत्येक के लिए प्रत्येक ओडी सामान्यीकृत मेजबान के स्पॉट 1 μl.
  4. 24-28 घंटे (या अपने संवाददाता / परख के लिए उचित रूप में) के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है.
  5. अपने फ्लोरोसेंट संवाददाता तनाव नहीं बल्कि अपने माता पिता का नियंत्रण तनाव को सक्रिय कि ख्यात उत्प्रेरण जीवों की पहचान करने के लिए फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. ये आइसोलेट्स अपने सकारात्मक हिट कर रहे हैं - अपने हित के फेनोटाइप प्रेरित यौगिकों कि छिपाना कि पर्यावरण रोगाणुओं.

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Representative Results

यह स्क्रीन बी के शरीर क्रिया विज्ञान बदल यौगिकों कि स्रावित मिट्टी जीवों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था subtilis. यहाँ वर्णित परिणामों बी की मैट्रिक्स उत्पादक सेल प्रकार पर ध्यान केंद्रित इस जीवाणु में मजबूत biofilm गठन के लिए आवश्यक हैं कि प्रोटीन और exopolysaccharide जो उत्पादन subtilis,. हम अपने फ्लोरोसेंट संवाददाता निर्माण (पी तप-YFP) के लिए तप-sipW-TASA operon के प्रमोटर का चयन किया. इस operon मैट्रिक्स प्रोटीन संरचनात्मक घटक encodes और biofilm मैट्रिक्स उत्पादन 23 के दौरान upregulated है. हमारे मैट्रिक्स रिपोर्टर (चित्रा 1) के पहले 19 में वर्णित के रूप में निर्माण किया गया था.

पिछले काम दिखाया गया है कि बी subtilis स्वयं उत्पादित कोरम संवेदन की तरह अणु surfactin, साथ ही अन्य मिट्टी बैक्टीरिया 20 द्वारा उत्पादित शुद्ध किया मेटाबोलाइट्स के जवाब में मैट्रिक्स पैदा करता है. हम विस्तार में रुचि रखते थेमिट्टी रोगाणुओं बी में मैट्रिक्स उत्पादन उत्प्रेरण के मेटाबोलाइट्स सक्षम बनाने के लिए जो अधिक मोटे तौर पर जांच करने के लिए एसई पढ़ाई subtilis. हम हमारे संवाददाता तनाव nonfluorescent था जहां एक विकास शर्त के साथ हमें प्रदान करने, इस माध्यम का पहले से ही गरीब मैट्रिक्स उत्पादन 20 करने के लिए नेतृत्व करने के लिए जाना जाता था, के बाद से विकास के लिए कमजोर लेग उपयोग करने के लिए चुने गए. हम तो इन विकास शर्तों के तहत स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त कालोनियों की संख्या अनुकूलित. प्रत्येक स्क्रीन थाली का अनुकूलन करने के लिए, यह जमी मिट्टी और पत्रकार aliquots से बढ़ने कितने कालोनियों निर्धारित करने के लिए आवश्यक है और कालोनियों और पोषक तत्व की स्थिति की उचित एकाग्रता क्या कर रहे हैं. और बारीकी से, व्यक्तिगत कालोनियों दूरी पर होना करने के लिए: आदर्श रूप में हम प्रत्येक coculture थाली मिट्टी और पत्रकार कालोनियों के एक बराबर संख्या (मिट्टी संवाददाता यानी एक 1:1 अनुपात) को शामिल करना चाहते हैं. पत्रकार कालोनियों का यह उच्च अनुपात एक inducer कई आसपास के संवाददाता कालोनियों को सक्रिय करेंगे कि संभावना बढ़ जाती है. कई एसी होनेवास्तविक उत्प्रेरण जीव (चित्रा 2) pinpointing में एक ख्यात inducer कॉलोनी बढ़ता है आत्मविश्वास आसपास tivated inducer कालोनियों. inoculum के कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप कालोनियों उचित बिखरे हैं कि निर्धारित करता है, जबकि पोषक तत्व सामग्री विकास / कॉलोनी गठन की हद तक नियंत्रित करता है. कम पोषक माध्यम के साथ एक मानक 10 सेमी व्यास पेट्री थाली में, हम प्लेट के अनुसार लगभग 25,000 कालोनियों कुल (एक 5 x 10 5 CFU / एमएल कमजोर पड़ने की 50 μl) बी का सबसे अच्छा जुदाई प्रदान की है 0.1x लेग MOPS मध्यम (चित्रा 4) पर subtilis कालोनियों.

धारावाहिक dilutions से गणना CFU / एमएल aliquots में बैक्टीरिया की एक अनुमानित एकाग्रता प्रदान करता है, यह एक पूरी थाली कोशिकाओं के साथ फैल रहा है जब परिणामस्वरूप कालोनियों की एकाग्रता उपयुक्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. गणना की CFU / प्लेट और वास्तविक CFU / प्लेट हमेशा समान नहीं हैं (चित्रा 4

पत्रकार और मिट्टी की aliquots तैयार करने के बाद, हम coculture स्क्रीन प्लेटों पर उन्हें मिलाया और एक त्रिविमेक्ष (चित्रा 5) का उपयोग कर प्रतिदीप्ति के लिए उन्हें जांच की. हम यह भी केवल मिट्टी या बी के साथ या तो inoculated थे कि नियंत्रण चढ़ाया subtilis पी तप-YFP संवाददाता तनाव. बी subtilis चित्रा 5 में coculture छवि में फ्लोरोसेंट कालोनियों के द्वारा देखा के रूप में मिट्टी से कई रोगाणुओं के जवाब में biofilm मैट्रिक्स (प्रतिदीप्ति) पैदा करता है. हम जांच की मिट्टी के लिए, हम पी तप-YFP रिपोर्टर के लिए एक उच्च मारा दरों था. (छह अलग मिट्टी के नमूने से) आइसोलेट्स के 12-67% के बीच संदर्भ 5 में वर्णित के रूप में उद्योगों की क्षमता थीपी तप-YFP संवाददाता तनाव में CE प्रतिदीप्ति. इस sporulation (पी sspB-YFP) और क्षमता (पी comG-YFP) संवाददाताओं का उपयोग कर अनुरूप स्क्रीन से हमारे अप्रकाशित परिणाम के विपरीत है. कोई भी उस क्षमता को उत्पन्न की पहचान की गई है, जबकि व्यापक प्रदर्शन (प्रत्येक रिपोर्टर के लिए> 2,00,000 कालोनियों) के बाद केवल दो जीवों, कि sporulation प्रेरित पहचान की गई. इस प्रकार, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए हिट दरें अत्यधिक चर हो जाता है और अग्रिम में भविष्यवाणी करना मुश्किल हो सकता है.

हम तो व्यक्ति ख्यात उत्प्रेरण कालोनियों उठाया. कम पोषक माध्यम पर हम (submillimeter व्यास) की सिफारिश coculture स्क्रीन प्लेटों पर कालोनियों काफी छोटे हैं. फिर भी, यह सही एक जटिल coculture स्क्रीन प्लेट के भीतर से (चित्रा 6) लेने के लिए और हाथ से बहुत छोटी कालोनियों को अलग करना संभव है. कि हम इस्तेमाल मैनुअल विधि सरल है और विशेष उपकरणों और न ही न तो आवश्यकता है लौ नसबंदी. ये ख्यात inducer कालोनियों तो अलगाव को restruck रहे हैं. Coculture प्लेटें कालोनियों के साथ भीड़ कर रहे हैं, यह असामान्य नहीं है - प्रत्येक ख्यात inducer नमूना से बढ़ रही है और अधिक से अधिक एक जीव है - यहां तक ​​कि बहुत सावधान उठा तकनीक के साथ. सावधान परीक्षा आकृति विज्ञान अलग कालोनियों के अलगाव की अनुमति चाहिए. सभी ख्यात उत्प्रेरण जीवों तो एक माध्यमिक स्क्रीन में जांच की जाती है. पैच और मौके विधि से दोनों सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम 3 चित्र में दिखाया गया है. उनके घने विकास, शारीरिक रूप से हमारे माध्यमिक स्क्रीन सच सकारात्मक होने में जांच की कालोनियों के लगभग 50% के साथ काफी अच्छा coculture प्लेटों से कालोनियों गया था उत्प्रेरण इकट्ठा करने की हमारी क्षमता को ध्यान में रखते. अतिरिक्त इस स्क्रीन से परिणामों के साथ ही यह उभरते से अनुवर्ती काम किया गया है जो पहले 5 का वर्णन किया.

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चित्रा 1. फ्लोरिसेंट ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाता का निर्माण. नीले अंडाकार एक बैक्टीरिया कोशिका का प्रतिनिधित्व करता है और धराशायी लाइन इसकी गुणसूत्र का प्रतिनिधित्व करता है. इस उदाहरण मैट्रिक्स के उत्पादन के लिए एक फ्लोरोसेंट ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर से पता चलता है. संवाददाता का निर्माण (पी मैट्रिक्स YFP) एक तटस्थ लोकस में गुणसूत्र में कहीं डाला जाता है, जबकि देशी ठिकाना, ('पी' और तीर प्रमोटर क्षेत्र को इंगित करता है, जहां पी मैट्रिक्स मैट्रिक्स) भी बरकरार है.

चित्रा 2
चित्रा 2. पर्यावरण रोगाणुओं: संवाददाता के विभिन्न अनुपात के साथ coculture स्क्रीनिंग के परिणाम की idealized उदाहरण हैं. ए) एक कम रिपोर्टर का प्रयोग: पर्यावरण सूक्ष्म जीव अनुपात से ख्यात उत्प्रेरण जीवों की पहचान करने में अधिक अस्पष्टता की ओर जाता है, जब बी) एक उच्च संवाददाता: पर्यावरण सूक्ष्म जीव अनुपात प्रयोग किया जाता है. ब्राउन हलकों लाल हलकों नीले हलकों uninduced संवाददाता कालोनियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, उत्प्रेरण मिट्टी जीवों का प्रतिनिधित्व करते हैं, मिट्टी जीवों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और हरे रंग की कालोनियों प्रेरित संवाददाता कालोनियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. धराशायी लाल लाइनों उत्प्रेरण metabolite की कार्रवाई त्रिज्या का संकेत मिलता है. फ्लोरोसेंट कालोनियों को उनकी निकटता के आधार पर - - ख्यात उत्प्रेरण जीव हैं और उठाया और माध्यमिक स्क्रीन में पुनर्परीक्षण किया जाना चाहिए स्टार कि nonfluorescent कालोनियों से संकेत मिलता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. माध्यमिक स्क्रीन. समझौता या देखा बी के लिए, क्रमशः, माध्यमिक स्क्रीन प्लेटों पर आइसोलेट्स कैसे वितरित करने के ए और बी) Schematics subtilis मैट्रिक्स संवाददाता. अधिक उदार रिक्ति अन्य पत्रकारों या उत्प्रेरण वियोजन, रवानगी के लिए आवश्यक हो सकता हैबी उत्प्रेरण के लिए, क्रमशः, नकारात्मक और सकारात्मक रहे हैं कि समझौता मिट्टी से. सी और डी) प्रतिनिधि परिणाम आइसोलेट्स उनके सक्रिय मेटाबोलाइट्स के प्रसर्यता पर समाप्त subtilis पी तप-YFP-संवाददाता. शीर्ष पैनल brightfield छवियों हैं, कम पैनल प्रतिदीप्ति छवियों हैं. स्केल बार 1 मिमी. ई) नकारात्मक है और देखा मिट्टी से सकारात्मक परिणाम एक ही रिपोर्टर के लिए आइसोलेट्स. स्केल बार 2 मिमी है.

चित्रा 4
चित्रा 4. Microcolony एकाग्रता का निर्धारण. अपनी कालोनियों के वितरण और आकार पोषक तत्व और सेल सांद्रता पर दोनों निर्भर करेगा बी के विकास में. ए) मतभेद 0.08x पौंड (कम पंक्ति) बनाम 0.01x पौंड (ऊपरी पंक्ति) पर subtilis. 0.01x लेग पर कक्ष, microcolonies में फार्म नहीं है, जबकि टी0.08x लेग पर नली करते हैं. (कि हमारे स्क्रीन के लिए हम यहाँ दिखाया गया है उन लोगों से थोड़ा पोषक तत्व के स्तर में वृद्धि हुई ध्यान दें:. 0.08x लेग से 0.1x पौंड) इन छवियों में जाना CFU / एमएल में अनुक्रमिक 01:05 dilutions की 1 μl धब्बों से कर रहे हैं. 3,200,000; 640,000, और प्लेट प्रति 128,000 CFU कुल: एक 10 सेमी पेट्री थाली भर कालोनियों के समान वितरण प्राप्त करने के लिए, इन सांद्रता से Extrapolating चढ़ाना (बाएं से) की आवश्यकता होगी. हालांकि, कोशिकाओं के असमान वितरण (वे मौके किनारों पर केंद्रित कर रहे हैं) में खोलना परिणाम पूरी थाली से अधिक कोशिकाओं के प्रसार की तुलना में. एक पोषक एकाग्रता चयन किया गया है एक बार इस प्रकार, यह सांद्रता की एक किस्म के साथ फैल प्लेटों की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. . स्केल बार) बी 0.1 मिमी है इन पैनलों) बाएँ से (50,000 फैलाने का परिणाम दिखा, 25,000, और 0.08x लेग प्लेटों पर प्लेट प्रति 5,000 कुल CFU. इन छवियों से, हम CFU / प्लेट के हमारे लक्ष्य की संख्या के रूप में 25,000 चयनित. स्केल बार 0.1 मिमी है.


चित्रा 5. बी के coculture subtilis पी तप-YFP मिट्टी जीवों के साथ मिश्रित बी युक्त coculture स्क्रीन थाली से brightfield और प्रतिदीप्ति छवि की. ओवरले मिट्टी जीवों के साथ मिश्रित subtilis पी तप-YFP मैट्रिक्स संवाददाता. Arrowhead प्रतिदीप्ति संवाददाता microcolonies से घिरे ख्यात inducer इंगित करता है. स्केल बार 1 मिमी है.

चित्रा 6
चित्रा 6. Coculture प्लेटों से छोटे जीवाणु कालोनियों को अलग करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन. ए और बी) इन पैनलों मिट्टी से जटिल माइक्रोबियल समुदायों युक्त अगर प्लेटों की दृष्टि से दो क्षेत्रों को दिखाते हैं. 0.1 मिमी के रूप में के रूप में छोटी कालोनियों वर्णित उठा तकनीक का उपयोग कर अलग किया जा सकता हैयहाँ. कॉलोनी उठा, और नीचे पैनल कॉलोनी उठा के बाद देखने का एक ही क्षेत्र हैं पहले शीर्ष पैनल देखने के क्षेत्र हैं. कोशिकाओं को हटा दिया गया है, जहां लाल तीर से संकेत मिलता है.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के निहित सीमाओं में से एक यह माइक्रोबियल जीवों की cultivability पर निर्भर करता है. अच्छी तरह से 24 से प्रलेखित किया गया है, इस ग्रह पर सबसे माइक्रोबियल जीवन (अभी तक) की तारीख को पता लगाया संवर्धन परिस्थितियों में नहीं उगाया जा सकता है. इस प्रकार, प्राकृतिक सेटिंग्स में उत्पन्न कर रहे हैं कि माइक्रोबियल प्रजातियों के बीच बातचीत की एक बड़ी संख्या इस दृष्टिकोण का उपयोग नहीं चल पाता जाना होगा. हमारी इच्छा ऐसी बातचीत के अस्तित्व की पहचान है, लेकिन फिर भी उन्हें मध्यस्थता में शामिल तंत्र और अणुओं का अध्ययन करने के लिए ही नहीं है लेकिन, जब से इन रोगाणुओं को खेती करने की क्षमता की आवश्यकता है. यहां तक ​​कि कृषि योग्य प्रजातियों के भीतर, इस क्षेत्र खराब दृष्टिकोण यहां रोगाणुओं के बीच रासायनिक मध्यस्थता बातचीत की पहचान करने के लिए एक विधि के रूप में एक बहुमूल्य योगदान का वर्णन किया है, जिससे पता लगाया गया है. इस प्रोटोकॉल दण्डाणु subtilis के मैट्रिक्स प्रेरण लिए स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया गया है, हालांकि इसके साथ ही, यह सैद्धांतिक रूप से एक करने के लिए लागू किया जा सकता हैकिसी भी अन्य बैक्टीरियल प्रजातियों में वाई ट्रांसक्रिप्शनल फ्लोरोसेंट संवाददाता.

इस दृष्टिकोण का एक अन्य संबंधित सीमा (परिभाषा से) इस स्क्रीन coculture की आवश्यकता है. विभिन्न पर्यावरण आलों शोषण जबकि प्राकृतिक वातावरण में, विभिन्न विकास दर के साथ रोगाणुओं अभी भी स्थानिक निकटता में रह सकता है. इस तरह के सूक्ष्म जीवाणु बातचीत केवल पोषक तत्व आवश्यकताओं और पत्रकार प्रजातियों के समान विकास दर के साथ पर्यावरण रोगाणुओं के विकास की अनुमति देगा, लेकिन, हमारे coculture स्क्रीन से नहीं चल पाता जाना होगा. संवाददाता तनाव के विकास से संभावित उत्प्रेरण जीवों का विकास होगा अलग संशोधनों कि निश्चित रूप से संभव हैं. मिट्टी में आम - सह - संस्कृति स्क्रीन में कठिनाइयों का कारण हो सकता है हम भी कवक के hyphal विकास कि प्रत्याशित. जबकि बी के साथ हमारे स्क्रीन की कमी timescale subtilis मध्यम विकास को रोधी यौगिकों उनका कहना है, कुछ कवक पाया गया कि मतलब सका एमयह चिंता का विषय inimize.

फ्लोरोसेंट संवाददाता निर्माण के लिए एक उपयुक्त phenotype और जीन का चयन करने की क्षमता अनुक्रमण और transcriptional डेटा कई प्रजातियों के जीवाणु के लिए पहले से ही उपलब्ध है या आसानी से प्राप्य या तो का धन पर विचार, मुश्किल नहीं होना चाहिए. हालांकि, यहां वर्णित दृष्टिकोण के साथ एक कठिनाई प्रतिदीप्ति प्रेरण का पता लगाने की अनुमति, अपने संवाददाता तनाव की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कि कम से कम विकास की स्थिति की पहचान करने की जरूरत है. transcriptional डेटा इस खोज (उदाहरण के लिए बी subtilis के विकास के लिए उपलब्ध टाइलिंग माइक्रोएरे डेटा ब्याज की जीन खराब 10 व्यक्त कर रहे हैं, जहां की स्थिति की पहचान परमिट) की सहायता कर सकते हैं, हालांकि इन स्थितियों की पहचान अक्सर अनुभव से किया जाना चाहिए. कई जीवाणु phenotypes की अभिव्यक्ति विषम है क्योंकि कुछ पत्रकारों के लिए यह अनुभवजन्य खोज भाग में, चुनौतीपूर्ण हो सकता है. दूसरे शब्दों में, यह सी खोजने के लिए दुर्लभ हैonditions आबादी के भीतर कोई कोशिकाओं कि subpopulation और जीन अभिव्यक्ति की शक्ति के भीतर कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है, इस प्रकार Phenotype एक्स व्यक्त कर रहे हैं, जिसमें यह प्रेरण पता लगाया जा करने की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रदान की स्थिति है कि पहचान करना मुश्किल हो सकता है . आदर्श स्क्रीनिंग स्थितियों के लिए इस अनुभवजन्य खोज के लिए एक वैकल्पिक "धुन" निर्देशित mutagenesis का उपयोग कर रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के स्तर तक जा सकता है. प्रमोटर क्षेत्र और / या रिपोर्टर निर्माण की ribosomal बाध्यकारी साइट फेरबदल करके, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर कम किया जा सकता है. यह कुछ विधान सक्रियण के साथ भी जीन शामिल करने के लिए जांच की जा करने की अनुमति देकर इस स्क्रीन की उपयोगिता का विस्तार कर सकता है.

एक बार उत्प्रेरण जीवों की पहचान की और एक माध्यमिक स्क्रीन में पुष्टि की गई है, वे जातीवृति के आधार पर उनके -16 rRNA जीन अनुक्रमण द्वारा पहचाना जा सकता है. यह fluores की हद तक यों भी संभव हैcence माध्यमिक स्क्रीन 5 में आयुध डिपो 600 सामान्यीकृत मौके का उपयोग कर. इस समुदाय के सदस्यों को अपने संवाददाता तनाव को प्रभावित और किस हद तक है कि यौगिकों का उत्पादन जो के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. नतीजतन, इस माइक्रोबियल बातचीत प्राकृतिक सेटिंग और इन उत्पादन और जवाब देने के जीवों की क्षमता coevolution पता लगाने की क्षमता में होने वाली हो सकती है, जो के बारे में परिकल्पना को जन्म दे सकता है. अन्य भविष्य दिशाओं, स्रावित अणु ही की संरचना elucidating प्रत्युत्तर देना जीव इस परिसर होश व्यवस्था है जिसके द्वारा (ओं) का निर्धारण, और बैक्टीरियल phenotypes व्यवस्थित करना एक रसायन के उपकरण के रूप में उपयोग शामिल है.

बातों से ऊपर उल्लिखित के साथ भी, विधि यहाँ वर्णित एक महत्वपूर्ण योगदान है. यह पर्यावरण के रोगाणुओं का एक पुस्तकालय कोडांतरण में शामिल श्रम से बचा जाता है, लेकिन ठोस मीडिया का उपयोग कर अपनी शारीरिक जुदाई और अलगाव की अनुमति देता है. इस coculture स्क्रीन की ताकत है कियह कई प्रजातियों के जीवाणु और phenotypes करने के लिए लागू किया जा रहा है, जबकि ब्याज की bioactive यौगिकों छिपाना कि उन लोगों की पहचान करने के लिए माइक्रोबियल प्रजातियों के हजारों के माध्यम से स्क्रीन करने के लिए एक धारणा और तकनीकी रूप से सरल तरीका प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखक धन्यवाद अपने अमूल्य सलाह और इस coculture स्क्रीन के विकास के दौरान सहायता के लिए रॉबर्टो Kolter (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल). वह 6 चित्र प्राप्त करने के साथ सहायता के लिए भी स्पष्टता के लिए पांडुलिपि पढ़ने के लिए धन्यवाद मैथ्यू शक्तियों, और चिया यी चेंग.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox VWR 80017-484 Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm VWR 26396-508
Gel loading tips, round VWR 29442-666
Glass rods VWR 59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope Zeiss N/A The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.

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References

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Shank, E. A. Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions. J. Vis. Exp. (80), e50863, doi:10.3791/50863 (2013).

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