Summary
חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.
Abstract
בטבע, חיידקים קיימים רק לעתים נדירות בבידוד, הם מוקפים במקום על ידי מערך רחב של מיקרואורגניזמים אחרים המשנים את הסביבה המקומית על ידי הפרשת המטבוליטים. יש מטבוליטים אלה הפוטנציאל לווסת את הפיסיולוגיה ובידול של שכניהם של חיידקים והם גורמים חשובים צפויים בהקמה והתחזוקה של קהילות חיידקים מורכבות. פיתחנו מסך coculture הקרינה מבוססת לזהות אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי מסוג זה. המסך כולל שילוב מתח כתב תעתיק ניאון עם חיידקים סביבתיים על תקשורת מוצקה ומאפשר למושבות לגדול בcoculture. כתב תעתיק הניאון מתוכנן כך שזן החיידקים שנבחר מאיר כאשר הוא מבטא את הפנוטיפ מסוים של עניין (כלומר היווצרות biofilm, נביגה, ייצור גורם ארסיות, וכו '.) הקרנה מתבצעת בתנאי צמיחת wheמחדש פנוטיפ זה לא בא לידי ביטוי (ולכן מתח הכתב הוא בדרך כלל nonfluorescent). כאשר חיידק סביבתי מפריש המטבוליט שמפעיל פנוטיפ הזה, זה מפזר באמצעות אגר ומפעיל את מבנה כתב הניאון. זה מאפשר-ייצור המטבוליט גרימת החיידק כדי להתגלות: הם מושבות nonfluorescent הפרוקסימלי ביותר למושבות ניאון. כך, מסך זה מאפשר זיהוי של חיידקים סביבתיים שמייצרים מטבוליטים diffusible המפעילים תגובה פיזיולוגית מסוימת במתח כתב. פרסום זה דן באופן: א) לבחור תנאי הקרנת coculture מתאימים, ב) להכין את הכתב וחיידקים סביבתיים להקרנה, ג) לבצע את מסך coculture, ד) לבודד משוער גרימת אורגניזמים, וה) לאשר את פעילותם במסך משנית. פיתחנו שיטה זו כדי למסך עבור אורגניזמים אדמה שיפעילו biofilm מטריצת ייצור בsubtilis Bacillus
Introduction
אנחנו מעוניינים להבין כיצד מטבוליטים שחיידקים מפרישים משפיעים על הפיסיולוגיה והתפתחות של חיידקים שכנים. מטבוליטים רבים כבר מאופיינים לתופעות ביו בחיידקים אחרים. שתי דוגמאות שתוארו היטב כוללות אנטיביוטיקה, אשר לעכב את הצמיחה של חיידקים אחרים, ומולקולות חישת מניין, אשר משנה את ביטוי הגנים העולמי של חיידקים אחרים. עם זאת, חיידקים מייצרים מוצרים רבים אחרים קטנים מולקולה טבעיות שאין להם bioactivities ידוע 1. אנו משערים כי חיידקים התפתחו ונשמרו את היכולת לייצר כמה מטבוליטים אלה משום שהם מאפשרים להם לווסת את הפיסיולוגיה התאית של חיידקי שכניהם בקהילות חיידקים המורכבים שבתוכה רוב החיידקים להתקיים.
סוגי תאי subtilis Bacillus
אנו מתמקדים המחקרים שלנו על אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי הכרוכים בBacilsubtilis lus. זה לא רק בגלל מעמדו כחיידק מודל גראם חיובי והכלים גנטיים כתוצאה זמינות למניפולציה שלו, אלא גם בגלל יכולתה להתמיין לסוגים מאופיינים תא. דוגמאות כוללות תאים שהם: שחייה; הפקת המטריצה תאית הנדרשת ליצירת biofilm חזקה; מוסמך לקחת את ה-DNA מהסביבה, והמתנבג בין יתר 2,. כל אחד מסוגי התאים מבטא regulon תעתיק מאפיין שהופך אותם מבחינה פיזיולוגית ו / או פיזי להבדיל מהאחים זהים מבחינה גנטית שלהם. בתנאי גידול רבים, סוגי תאים מרובים לדור בכפיפה אחת אוכלוסיות שונות כמו בתוך מושבה אחת של B. תאי subtilis 3. למרות שמינים רבים של חיידקים עשויים להפגין את ההטרוגניות מקבילה סוג התא, תופעה זו כבר בעיקר למדה היטב ב ' subtilis.
בפרט, הגנים שהם UPRegulated בתוך כל אחד מB. הספציפי אלה סוגי subtilis תאים זוהו. זיהוי גנים שהוגברו כזה הוא חיוני לעבודה המתוארת כאן כי רבים של פנוטיפים חיידקים אלה של עניין קשה או בלתי אפשריים להתבונן באופן ישיר. לדוגמא, אנחנו לא יכולים מבחינה ויזואלית לזהות תכונה כגון שחייה על צלחות מוצקות (1.5%) אגר, למרות שsubpopulation של B. תאי subtilis לייצר שוטונים בתנאים אלה 3. דוגמא נוספת היא מטריצת ייצור biofilm. ייצור מטריקס ניתן דמיינו ידי מורפולוגיה מושבה (כפי תוצאות מושבות macroscopically מקומטות), אלא רק במדיום גידול מסוים, ורק אחרי ימים רבים של צמיחת 4. עם זאת, על ידי לדעת אילו גנים שהוגברו במהלך התמיינות, אנחנו יכולים לבנות לכתבים תעתיק המשמשים כסמנים להתמיינות לסוגי התאים.
כתב בונה
לא ניאון אלהכתבי ranscriptional מורכבים מהיזמים עבור גנים תאים מסוג מסוימים נוהגים בייצור של גן כתב, למשל חלבון פלואורסצנטי. דוגמאות כוללות מכשפה-YFP P (לשחייה בתאים), P טאפה-YFP (לתאים מייצרי מטריצת biofilm), ו-P-sspB YFP (להמתנבג תאים), כאשר x P מציין את האזור המקדם עבור x גן. כתב בונה אלה משולבים לוקוס ניטראלי בכרומוזום (איור 1 וראה להלן), כך שרגולצית יליד פנוטיפ נותרה בשלמותה. עם זאת, כעת, כאשר תא מבטא פנוטיפ זה, זה גם מבטא את חלבון פלואורסצנטי. זה מספק דמיינו בקלות לקריאה מתוך ההפעלה מסוימת פנוטיפי התנהגות, מאפשר לנו להקרין לחיידקים שמפעילים את תגובה פיזיולוגית זה. למרות שכתבים כאלה משמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה, הם לא יושמו באופן רחב במסכים לidentifאינטראקציות מטבוליות y בין חיידקים לפני שיטה זו תוארה 5.
ישנם מספר השיקולים החשובים בתכנון והבנייה של תאים מסוג ספציפי לזני כתב. יש לנו מנוצלים באופן בלעדי כתבי ניאון תעתיק, אם כי סוגים אחרים של מבנים הם בהחלט אפשריים. אנו לעודד את השימוש בשילובי translational כסמנים לבידול סוג התא במסך שלנו, לעומת זאת, משתי סיבות: 1) הרצון להשאיר מהסוג ספציפי של תאי החלבון האם של שלוות נפש, ו2) ההכרה בכך מפוזר, תא הקרינה רחבה תהיה יותר קלה לזהות מאשר puncta מקומי בתוך תאים (משותף עם התכה translational).
בחירת גן כתב
לאחר שהחליט להשתמש בתעתיק כקריאה החוצה, גן הכתב יש לבחור (לדוגמא LacZ, הקרינה, או בלוציפראז). יש LacZ היתרון של צורך מיוחד לפחותized ציוד לגילוי, אך קיימת סבירות גבוהה הרבה יותר של תוצאות חיוביות שגויות בקרב חיידקים סביבתיים. בידיים שלנו, ברמת הרקע לאק + אורגניזמים בין החיידקים קרקע הייתה גבוהה להחריד (>> 10% מחיידקי אדמה היו כחולות (Lac +) על צלחות X-gal, מידע לא מוצג). יתכן כי על ידי titrating הריכוז של X-gal במדיום, זה יכול להיות מותאם כדי לאפשר את השימוש בכתב X-gal, למרות שאנחנו לא ניסינו את זה. לוציפראז מספק רגישות גבוהה של איתור והוא הכתב מאונך ביותר: אין כמעט סיכוי לחיידקים סביבתיים להיות זורח מיסודו. עם זאת, מצאנו את זה קשה לזהות מכשור במוסד שלנו, שאיפשר גילוי הארה פני צלחות פטרי כולו, כפי שרובן נועדו לסרוק אזורים רק מקומיים בצלחות רב גם. ייתכן שקיים גם סיבוכים באופן חזותי מושבות זורח באופן שאפשר גם הפיזי בו זמנית הואolation של אורגניזמים וישכנע. בעת השימוש בנאמנים ייתכן שעשה את זה אפשרי, אנחנו במקום שנבחרו לשימוש כתבי תעתיק ניאון, אשר הוכחו לעבוד בB. subtilis, ובלבד רגישות נאותה של זיהוי ושיעורים חיוביים כוזבים נמוכים בקרב אורגניזמים קרקע, ומותר להשתמש במכשור בקלות זמין עבור שניהם להדמיה ונהלי בידוד.
בחירת Fluorophore
Fluorophore הספציפי שנבחר יהיה תלוי במינים החיידקים שלך, המדיום אגר צמיחתו אתה משתמש, ומסנן הקרינה המסוים קובע שיש לך זמין. עם המכשור שלנו, מצאו ששניהם B. subtilis מושבות עצמם ואגרו הם גדלו על הקרינה רקע פחות הוצגה כאשר מסנני YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב) היו בשימוש, מה שהופך את הכתב שעדיף על ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) בידיים שלנו. שימוש קודון של חלבוני ניאוןלעתים קרובות מותאם לאאוקריוטים, שהופך אותו חשוב לבחור fluorophore ידוע או מהספרות לעבודה במינים החיידקים שלך, או לבדוק אותו באופן מפורש באמצעות אמרגן מכונן. מספר גדול של גרסאות חלבון פלואורסצנטי הולכת ומתפתחים זמין 6 כיום, שכבר נבדק במספר המקורות 7,8, שחלקם באופן מפורש לספק הדרכה בבחירת חלבון פלואורסצנטי מתאים לניסוי שלך 9.
בחירת יזם
הבחירה של אמרגן במידה רבה תהיה תלויה בסוג התא או הפנוטיפ של עניין שלך. לאורגניזמים כגון B. subtilis, כמה גנים כתב תאים מסוג מסוימים הוקמו בספרות. לזני חיידקים אחרים, בחינת microarray או נתונים תעתיק תהיה צורך לספק מידע על אילו גנים שהוגברו מאוד בתנאים שבו סוג התא שלך שלי ענייןבא לידי ביטוי ים. מחקר שנערך לאחרונה מקוטלג השעתוק של B. subtilis תחת 104 תנאי גידול שונים באמצעות מערכי ריצוף 10. מאמר זה מספק מידע מקיף על אילו גנים שהוגברו מאוד בתנאים שונים, שלא יסולא בפז לפנוטיפים-היטב מאופיינים פחות.
במקום מיפוי אזורי אמרגן מדויקים לכל גן של עניין, אנחנו בדרך כלל פשוט להשתמש נ"ב הרצף 200-500 במעלה הזרם של הגן כאמרגן. אורך הרצף המדויק תלוי בהקשר הגנומי: אזורים קצרים יותר נמצאים בשימוש בעת צורך כדי להימנע מהכללת אזורי קידוד במעלה הזרם משכן מסגרות קריאה פתוחות.
לוקוסים ואינטגרציה ניטראליים
איך לשמור על הכתב לבנות בזן החיידקים שלך הופכת להיות השאלה האחרונה בעיצוב זן כתב תעתיק ניאון. בחיידקים, גנים של עניין נשמרים בתדירות גבוההעל פלסמידים באמצעות בחירה אנטיביוטיות. עם זאת, ייתכן שלא ניתן יהיה להשתמש באנטיביוטיקה במהלך coculture בלי להרוג את החיידקים הסביבתיים. אם פלסמידים נשמרים ביציבות במינים החיידקים שלך, זה עשוי להיות אפשרי לגדול החיידקים שלך מכילים כתב שמקורן בפלסמיד בנוכחות של אנטיביוטיקה כדי להכין את הכתב שלך להקרנה, ולאחר מכן לחסל אנטיביוטיקה במהלך coculture עצמו בתקווה שיהיה פלסמיד להישמר במידה מספקת כדי לאפשר לקרינה. עם זאת, אם פלסמידים הולכים לאיבוד בקלות בחיידק שלך, או הולכים לאיבוד בתנאי לחץ, זו לא תהיה אפשרות מעשית. במקרים רבים, הפתרון הטוב ביותר יהיה לשלב את הכתב לבנות על גבי כרומוזום בקטריאלי, המאפשר תחזוקה יציבה של הכתב גם בהיעדר של בחירה. על מנת ששילוב לא לשבש את הביטוי או תקנה הרגיל של גן העניין שלך, אנו ממליצים לשלב לתוך אתר מחוץ לרחם בכרומוזום כי can לשמש "מוקד ניטראלי". בB. subtilis אתרי אינטגרציה אלה הם גנים ה-- כאשר מוטציה - להעביר פנוטיפ בתקשורת מינימאלית מסוימת (המאפשר integrants להיות מזוהה ללא בחירת אנטיביוטיקה), אך אינו משנה את הצמיחה או שיעורים נביגה במדיה עשירה, וכולל כגון גנים כamyE, lacA, thrC, pyrD, gltA, וsacA (שינוע היכולת לנצל עמילן, β-galactosides, תראונין, אורציל, גלוטמט, וסוכרוז, בהתאמה) 11-13.
למרות ששילוב בגנים אלה היה בשימוש באופן אמין במשך שנים רבות בB. subtilis (במיוחד בamyE וlacA), ידע דומה ייתכן שלא יהיה זמין לגנים במינים רבים של חיידקים אחרים. השימוש באתרים מצורפים הפאג חלופות גדולות לאתרי אינטגרציה כרומוזומליות ניטראליים: יש מינים ספציפיים רבים 14-16, כמו גם באתרי אינטגרציה כלליים כגון האתר המצורף Tn7 (Tn7 עו"ד)זוהה ומנוצל להוספות גנים במינים רבים של חיידקי 17,18.
חיידקים סביבתיים
אנו משתמשים באדמה כמקור ישיר של חיידקים סביבתיים למסך coculture שלנו. האדמה מכילה מגוון גבוה של חיידקים, ורבים מיצורים אלה הם מקור עשיר של מוצרים טבעיים. באמצעות תרחיפים נוזליים של אדמה הונחו ישירות על גבי צלחות עם הזן שלנו ניאון תעתיק כתב (ללא בידוד מוקדם של חיידקים מהאדמה), אנחנו מאוד לפשט הגישה הניסויית. האדמה יכולה לשמש מייד לאחר קציר, או להיות קפוא ב-80 ° C לשימוש עתידי. יש שימוש מיידי את היתרון שמגוון גדול יותר של חיידקים ניתן לגדל באופן פוטנציאלי, כולל אלה שלא ישרדו הקפאה היטב. יש לו את החסרון שהריכוז של אורגניזמים אדמה לעיבוד חקלאיים מדוגמאות אלה אינו ידוע, הגדלת מספר צלחות מסך שחייב להיות בשימוש. דליש שימוש עאיד היתרון ש/ מיליליטר CFU עבור כל מקור אדמה ניתן לקבוע מראש, ומאפשר למספר אופטימלי של מושבות שגדל על כל צלחת מסך. עם זאת, הוא דורש שאורגניזמים האדמה להיות מסוגלים לשרוד הקפאה.
שים לב שגיוון בריכת inducer הנבדקת (כלומר מקורות האדמה) מופיע להיות יעילים יותר בזיהוי אינטראקציות interspecies חדשים מאשר הקרנה מעמיקה על אותה האדמה: מגוון פילוגנטי גדול יותר נצפה בנפילות במסך מטריקס האינדוקציה שלנו, כמו מקורות אדמה נוספים נבדקו ולא הקרנה אותם מקורות הקרקע באופן יסודי יותר (EA שאנק ור 'Kolter, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, תוצאות לא פורסמו).
סקירה
הגישה שאנו מתארים כאן היא פשוטה מבחינת הדרישות טכניות שלה. היא כוללת: 1) בניית כתב תעתיק ניאון בB. subtilis אומיני חיידקים אחרים של עניין, 2) זיהוי תנאים שבם הכתב הזה אינו מופעל, 3) הכנת aliquots של זן הכתב הזה ואורגניזמים שיוקרנו (במקרה של אדמתנו, אבל יכולים להיות מנוצלים מקורות אחרים במקום), 4) ערבוב אלה שתי קבוצות של חיידקים על תקשורת מוצקה, 5) זיהוי ובידוד המשוערת גרימת אורגניזמים, ו6) המאשר כי אורגניזמים אלה אכן להפעיל פנוטיפ זה במסך המשני. לאחר שזוהו, אורגניזמים אלה ומטבוליטים שלהם לספק לנו כלים כימיים כדי לווסת את התנהגות חיידקים, ללמוד פיזיולוגיה חיידקים ויחסי גומלין של חיידקים, ואפשרות לפעול פיגומי רומן כמו לתרכובות טיפוליות עתידיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בחר גן כתב ולבנות כתב ניאון תעתיק
לsubtilis ב:
- ראה מאמר יופיטר בהתייחסות 19 לפרוטוקול המתאר את הבנייה של כתבי תעתיק ניאון בsubtilis Bacillus.
למיני חיידקים אחרים:
- לזהות גן שהוגבר במהלך התגובה הפיזיולוגית של עניין. זה יכול להיות מבוסס על ספרות הקיימת או ניתוח תעתיק של החיידק בתנאים מסוימים.
- לבנות כתב תעתיק ניאון לגן הזה לפעול כמדד לשינוי בפנוטיפ. מבנה זה אמור לכלול את האמרגן של גן שהוגברו זה נהיגה הייצור של חלבון פלואורסצנטי מתאים (ראה איור 1).
- שלב את זה לבנות ללוקוס ניטראלי בכרומוזום. הדבר מבטיח כי reg ילידיםulation של הגן של עניין לא יופרע, וימנע את הצורך במנגנוני בחירת פלסמיד (למשל אנטיביוטיקה) שעשוי להפריע לצמיחה של חיידקים סביבתיים.
2. לקבוע תנאי Coculture
לכתב טאפה-YFP B. subtilis P:
- השימוש 0.1x LB, לנוקס בינוני (tryptone 1 גרם, תמצית שמרים 0.5 גרם, 0.5 NaCl גרם לליטר) לכתב הזה, שכן ב ' מטריקס ייצור subtilis הוא מינימאלי על מרק לוריא 20. המדיום הזה מאפשר B. מושבות subtilis לגדול ל submillimeter אבל גודל הנצפה, תוך מתן אפשרות למינים מגוונים מאדמה לגדול 5.
- כולל 100 חיץ מגבים מ"מ למזער שינויי pH פוטנציאליים.
למיני חיידקים אחרים:
- השתמש פרסם נתונים תעתיק או אמפירי לבדוק תנאי תרבות שונים כדי לזהות אחד שבו החיידק גדל אך activation של כתב הניאון הוא זניח (כדי לאפשר ההפעלה שלה כדי להתגלות כאשר מתח הכתב הוא גדל בcoculture עם חיידקים וישכנע.)
- השתמש בינוני עם תוכן נמוך תזונתי (יחסית לתקשורת מיקרוביולוגית עשירה באופן מסורתי) כאשר הקרנת חיידקים סביבתיים מסביבות oligotrophic (כמו האדמה), שכן חיידקי oligotrophic רבים לא גדלים כאשר הציגו עם תנאים גבוהים תזונתי 21. בינוני תזונתי נמוך גם מקטין את גודל מושבה, הגדלת התפוקה של המסך.
- בחר בינוני עם הקרינה רקע נמוכה ובהירות אופטית טובה.
- ייעל את טמפרטורת גידול על מנת לאפשר גם את מתח הכתב וחיידקים סביבתיים לגדול בו זמנית.
- קחו למשל את תוספת סוכן חציצה של. השימוש במאגר בלוחות יפחית את האפשרות לאיתור שינויים בתיווך ה-pH בפיזיולוגיה 22, אלא אם כן אינטראקציות כאלה הן בעלי עניין.
3. הכן Aliquots Reporter
לכתב טאפה-YFP B. subtilis P:
- זן Streak כתב מ-80 ° C מניות קפוא על צלחת טרי LB באמצעות קיסם סטרילי או המוליך מקל.
- לגדול בין לילה ב30 ° C.
- לבצע דילולים סדרה בתרבות נוזלית כדי למזער את הקרינה רקע נובעת מגידול במדיום מוצק:
- לחסן תרבות נוזלית 5 מיליליטר של LB ולגדול עם רעד ב37 ° C.
- כאשר התרבות מגיעה OD 600 ~ 0.6, לדלל לLB הטרי 5 מיליליטר ל OD 600 של 0.02.
- לגדול ב 37 מעלות צלזיוס שוב עם הרעד עד תרבויות מגיעה OD 600 ~ 0.6.
- חזור על דילולים צמיחה סידוריים כולל של 3x.
- בואו תרבות דילול סדרה סופית לגדול ל OD 600 ~ 0.4.
- הוספת גליצרול ל15-20%.
- Aliquot μl 50-200 ל0.5 מיליליטר צינורות microfuge ולהקפיא ב -80 ° C.
- אמאaliquots שווים ke עבור זן הורה nonfluorescent של הכתב (הם יידרשו במהלך הקרנה משני).
למיני חיידקים אחרים:
- השתמש בתאים שיש להם הקרינה רקע נמוכה (כלומר, הם גדלו בתנאים שבם יש ביטוי קטן מהאמרגן בשימוש בכתב).
- הפוך ולהקפיא aliquots המכילים CFU / מיליליטר ידוע (מושבה להרכיב יחידות למ"ל) של זן הכתב, כך שמספר מתאים של מושבות ניתן לגדל על כל צלחת מסך coculture (ראה סעיף לעיל לפרטים נוספים).
- הפוך aliquots שווי ערך לזן הורה nonfluorescent (הם יידרשו במהלך הקרנה משני).
4. להשיג דגימות קרקע
- לאסוף אדמה לתוך צינורות חרוטי סטרילי או שקיות סטריליות בעזרת מרית, השלכת 0.5 ס"מ העליונים של קרקע משטח חשופה.
- להוסיף מלח סטרילית (0.85% NaCl) ביחס של 10 מיליליטר לכל 1 גרםשל אדמה כדי להפוך את תרחיף קרקע.
- בחר שיטה כדי לסלק חיידקים מחלקיקי קרקע: א) שימוש מיידי של דגימה טריות או ב) שימוש התעכב לאחר ההקפאה של מדגם.
- לשימוש מיידי, slurry מערבולת דקות 1.
- לשימוש בפיגור, תערובת תרחיף אדמה בבלנדר למשך שלושה מחזורי 1 דקות, מניח את צנצנת הבלנדר על קרח דק 1 נחה בין מחזורי מיזוג.
- בואו תרחיף אדמה להסתפק ~ 1 דקות.
- להעביר את השכבה עליונה מימית לצינור טרי.
- הוספת גליצרול לריכוז סופי של 15-20%.
- Aliquot μl 50-200 ל0.5 מיליליטר צינורות microfuge ולהקפיא ב -80 ° C.
5. קבע / מיליליטר CFU של קפוא כתב וAliquots קרקע
- הפשירו aliquot קרקע והכתב קפוא. יכולים להיות מופשרים חיידקים קרקע על קרח. בגלל ב ' lyses subtilis על 4 מעלות צלזיוס, צריכים להיות מופשר aliquots אלה במהירות על RT כדי למזער את המשך הזמן בטמפרטורה נמוכה.
- בצע שתי סריה לשכפלדילולים ליטר (ל10 -8) ב0.1x LB או חיץ איזוטוני אחר.
- 5 נקודות μl צלחת של דילול כל סידורי על גבי צלחות אגר מאותו המדיום שישמש להקרנת coculture.
- לגדול ב RT (או הטמפרטורה שיהיה באמצעות להקרנה).
- למחרת, לספור את מספר המושבות בכל נקודה ולחשב / מיליליטר CFU של כל אחד מaliquots הקפואים.
6. לאשר ריכוזי Aliquot לצלחות מסך מורחים
- הפשירו aliquot קפוא כמו בשלב 5.1.
- מדולל ל1 x x 10 5, 2.5 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 6, ו2.5 x 10 7 CFU / מיליליטר.
- הוסף 50 מקום μl של דילול כל למרכז צלחות בודדות. אלה אמורים להניב צלחות עם אופטימלי המחושב של 25,000 מושבות בכל צלחת, כמו גם 2 - ו 5 - לקפל יותר ופחות, ומאפשרים הדילול בפועל הטוב ביותר שייקבע.
- להוסיף כ 20 זכוכית סטרילית חרוזים (3 מ"מ) על ידי בעדינות קשה אותם על גבי הצלחת. חרוזים לספק יותר חלוקה שווה של מושבות על פני הצלחת מאשר מפזר זכוכית מכופף עושה.
- מורחים תאים על ידי שמירה על צלחות על המעבדתיים והרועדים קדימה ואחורה, מסתובב להם שאתה עובד, עד שהנוזל נספג. אל תמשיך ללחוץ את חרוזים פעם אחת את הצלחת היא יבשה, אחרת הוא יתחיל להרוג את החיידקים.
- Flip צלחות מעל וזורקים חרוזים לתוך כוס פסולת המכילה אתנול.
- בואו צלחות לגדול במשך הזמן של assay שלך (למשל 24 שעות) בטמפרטורה נכונה עבור assay שלך (למשל 24 ° C / RT).
- שימוש stereoscope לנתח, לספור את מספר המושבות בשניים או יותר שדות הראייה.
- לחשב את מספר המושבות בכל אזור, ולקבוע כמה מושבות על כל צלחת.
- התאם דילולים עתידיים בהתאם לצורך. המספר האמיתי של מושבות הוא לא חשוב כמו שיש אותו המספר על כל צלחת מסך דומה.
= "Jove_title"> 7. הכן את צלחות Coculture
- aliquot הפשרת כתב (וaliquot אדמה אם קפוא) כמו בשלב 5.1.
- לדלל כתב (לריכוזים מותאמים בסעיף 6) ב0.1x LB או תזונתי נמוך אחרים, תמיסה איזוטונית.
- לאדמה קפוא: לדלל את הריכוז מותאם בסעיף 6 ב0.1x LB או תזונתי נמוך אחרים, תמיסה איזוטונית.
- לאדמה טריות: להפוך את דילולים של תרחיף אדמה טרי, המבוססים על תחזית ש/ מיליליטר CFU של תרחיף האדמה יכול לנוע בין 10 -4 ל10 -9 CFU / מיליליטר.
- ספוט 50 μl של דילולים קרקע וכתב אל מרכז צלחת מסך coculture. כמו כן, אדמת צלחת לבד וכתב לבד כמו פקדים.
- מורחים באמצעות חרוזי זכוכית כמתואר בשלב 6.4-6.6.
- אם יש תנאי גידול ידועים כי יפעילו הכתב, פס הניאון שלך או צלחת הכתב שלך בתנאים אלה ולגדול לשימוש כביקורת חיובית במהלך הקרנה. לדגור על 24 מעלות צלזיוס במשך 24-28 שעה (או כפי שמתאים לכתב / assay שלך)
8. צלחות CoCulture מסך לקרינה
- שימוש בתאורת brightfield, להתמקד stereoscope שלך כך שהמושבות הן חדות.
- תסתכל על צלחות האדמה רק כדי לקבוע אם מדגם האדמה שלך יש autofluorescent מושבות. אם כן, אדמה זה עלולה לגרום לשיעור גבוה של תוצאות חיוביות שגויות (עם גידול מקביל בהקרנה משני).
- השתמש יחס גבוה של כתב: אדמה בצלחות coculture שלך כדי להגדיל את הסיכוי שמשדל יהיה מוקף בהתנחלויות כתב מרובות, ומפחית את הסיכוי שהם יזוהו כשגויים חיוביים (איור 2).
- השתמש בחלבון שונה ניאון (אחד אשר פולטת בערוץ אחר).
- לקבוע את עיתוי assay. עבור רוב הכתבים החדשים, עיתוי הגיוס פוטנציאלי אינו ידוע, ולכן צריך להיקבע באופן אמפירי.
- בגין הקרנה לקרינה ברגע שהפכו למושבות נראות בבירור עם stereoscope לנתח (הגדלה ~ 30X) ולהמשיך ולבחון מעת לעת עד לצלחות הצמיחה חדלה ו / או הקרינה רקע הופכת להיות גבוהה מדי.
- ברגע שהחלון של אינדוקציה פוטנציאל הזמן שנקבע לכתב מסוים, זה צריך להיות דומה לכל צלחות coculture המכילות כתב כי, לפשט את הניטור של צלחות המסך. לB. כתב subtilis P טאפה-YFP, הזמן המתאים כדי לבחון את הצלחות הוא בין 24-28 שעה לאחר ציפוי התאים; לB. כתב sspB-YFP subtilis P, זה הוא בין 26-32 שעות של צמיחה.
- מקסם את רגישות הקרינה שלך:
- ודא הקרינה שלך לנתח היקף היא בחדר חשוך או מוקפת וילונות אפלה. אינדוקציה צפויה להיות פחות אינטנסיבית מאשר FP המיוצר constitutively ודורשת Sensi גדול יותרtivity לזהות.
- לאפשר זמן למנורת הקרינה לייצב והעיניים שלך להסתגל לחשכה, לפני שננסה לזהות הקרינה מהצלחות שלך coculture (לפחות 1-2 דק ').
- שימוש בבקרה חיובית (אם יש לך אחד), להבטיח כי את הגדלתו אתה משתמש מאפשרת לך לזהות הקרינה. ההגדלה היא בדרך כלל הכי טובה אם שדה הראייה שלך הוא כ 30-50x קוטר המושבה הטיפוסי שלך (200-400X).
- כבה את האור הבהיר ולפתוח את התריס לקרינה שלך.
- אחרי עיניכם הסתגלו לחשכה, לנוע באיטיות את הצלחת קדימה ואחורה על פני שדה הראייה שלך, מחפש נקודות אור.
- תתחיל מהחלק העליון של הצלחת ולהשתמש בדפוס זגזג להעביר מצד לצד הצלחת כפי שאתה לנוע לכיוון החלק התחתון של הצלחת.
- עיסוק הזזת הצלחת בbrightfield כדי לקבל תחושה של איך לאט לאט לעבור לצלחת, וכדי להיות בטוח שאתה מכסה את כל surבפני שטח.
- הזז את הצלחת לאט מספיק, כי המושבות אינן הופכות למטושטשות. עדיף oversample פני השטח ולא באזורים מתגעגעים.
- לאחר סריקה אחת מלאה, להפוך את צלחת ° 90 וחזור. עיניים אנושיות להפליא טובות באבחון אפילו הקרינה קלושה באמצעות שיטה זו.
- אם אתה מזהה הקרינה, מפסיק לנוע הצלחת ולחזור ולמצוא את שטח הניאון.
- הפיכת brightfield באיטיות, לקבוע האם הקרינה קשורה במושבת חיידקים (ולא שאריות אדמת autofluorescent או רכיבי תקשורת). אם כן, מושבות nonfluorescent הפרוקסימלי למושבה הניאון הן אורגניזמים גרימת משוערים.
9. לבודד אורגניזמים התרמה משוערת
- מושבות מושרה ברגע (ניאון) זוהו, לבודד אותם המושבות מפרישות תרכובות התרמה.
- אם מספיק ריכוז גבוה של מושבות כתב גדל על הצלחת(> 0.5:1 כתב: CFU אדמה), מושבות הגרימה המשוערות יהיו מוקפות בהתנחלויות ניאון מרובות (שוב, ראו איור 2).
- במקרים בהם את המורכבות של צמיחת coculture עושה את זה חד משמעי שמושבה הוא המשדל, לבודד מושבות גרימת פוטנציאל רבות לבדיקות שלאחר מכן במסך המשני.
- למקם את המושבות אתה רוצה להרים במרכז שדה הראייה.
- אם הם קרובים לקצה של הצלחת, לסובב את הצלחת, כך שהשפות של הצלחת היא מהיד הדומיננטית שלך (אם אתה ימני, כלומר, את השפתיים של הצלחת בצד השמאל). זה מאפשר לך להתקרב למושבות בזווית נמוכה, מה שמשפר את הדיוק של הקטיף שלך.
- הנח צלחות טריות לפס אורגניזמים גרימת משוערת לקרבת מקום, כמו גם כוס פסולת להשליך טיפים לשימוש.
- עוזב את מנורת הקרינה ב, להדליק את האור הבהיר לאטעל, כך שתוכל לזהות (לפי צורה ומיקום), המושבה הניאון ואורגניזמים משוערים שמסביב וישכנע. ייתכן שתצטרך ללכת הלוך ושוב עם האור כמה פעמים כדי להיות מסוגל לזהות את המושבות אתה רוצה להרים כאשר אין הקרינה, ורק אור בהיר.
- השתמש במוט זכוכית (200 מ"מ בקוטר מ"מ ארוך x 5) כדי לאסוף את סיבוב קצה ג'ל טעינת סטרילי, 200 μl ולהחזיק אותו כמו עיפרון. זהו כלי הקטיף בו תשתמש כדי לבודד מושבות בודדות.
- משענת כף היד החיצונית שלך נגד את הבמה כדי לייצב אותו על משטח העבודה. מניחים את היד השנייה על הצד של היד שלך הפנימי, אגודל לייצוב כלי הפריטה שלך.
- במידת צורך, להפוך שוב בין תצוגות הקרינה וbrightfield לזהות את המושבות שברצונך לבחור.
- שמירה על קצה פיפטה מעל פני השטח הצלחת, להעביר אותו לתוך שדה הראייה שלך ולמרכז אותו מעל המושבה שאתה רוצה לבחור. טיפ יהיה מחוץ לפוקוס.
- שימוש בקצה החיצוני של היד שלך (שמונח על הבמה מיקרוסקופ או משטח עבודה), סובב את קצה פיפטה לאט למושבה להיות הרים. לגעת בו מאוד בקלילות, מנסה למזער כמה מושבות אחרות קשר הקצה.
- בלי לסובב את כלי קטיף, הפס על קטע של צלחת טרי. מורחים עם מגע רך, כדי למנוע ניקור אגר. מכיוון שמספר התאים שהועברו על ידי שיטה זו הוא די קטן (המושבות הן הרבה יותר קטנות מאשר מניפולציות בדרך כלל), פס רציף אחת יגרום מושבות מבודדות.
- חזור על תהליך זה עם אורגניזמים גרימה משוערים אחרים.
- דגירה צלחות על 24 ° C (או הטמפרטורה של assay שלך).
10. רצף אורגניזמים התרמה לכאורית השג מושבות אחת מבודדות
- שימוש stereoscope, לקבוע - על בסיס מבנה מושבה או במורפולוגיה - האם יש סוגים שונים מושבה הכילו בתוך כל אחד מind הרים המשוער שלךucing אורגניזמים.
- תסתכל על המושבות באמצעות שלב שבו אתה יכול להאיר את המושבות משני לעיל, כמו גם מלמטה כדי לזהות הבדלי מושבה פוטנציאליים.
- Restreak כל morphotype שונה על צלחת טרי ודגירה עד גדל.
- Restreak עוד פעם אחת ולתת לגדול. אם morphotypes שונה להתמיד, להמשיך restreak לטוהר.
11. בדוק שוב אורגניזמים התרמה המשוערת במסך המשני
- בדוק שוב את כל האורגניזמים וגורם המשוערת במסך משני כדי לקבוע שמפעילים את כתב תעתיק הניאון. המסך משני מורכב מדשא של microcolonies של זן כתב תעתיק הניאון, יחד עם צלחות שליטה, שעליו אורגניזמים גרימת משוערת הם תוקנו או מנומרים.
- הגדר את שלוש צלחות זהות: אחת המכיל דשא microcolony של זן כתב תעתיק הניאון (באותו הריכוזים היה בשימוש במהלך הקרנת coculture), אחד המכיל דשא microcolony של זן ההורה הפראי מהסוג בלי כתב הקרינה, ואחד המכיל לא דשא.
- סמן את החלק העליון של הצד האחורי של כל צלחת כדי לקבוע את כיוון הצלחת.
- הוספת סמני positional לתיקונים / כתמים; ניתן לבדוק עד עשרה אורגניזמים גרימת משוערת על כל סט של צלחות (איור 3).
- aliquots הפשרת דשא (כתב ומתח הורה nonfluorescent) כמו בשלב 5.1.
- מורחים 50 μl של דילול 5 x 10 5 CFU / מיליליטר על צלחות דשא (או דילולים מותאמים אחרים) באמצעות חרוזים סטרילית כמו בשלב 6.4.
- בואו צלחות יבשות.
- תיקון או לזהות משוער גרימת אורגניזמים:
- בחר תיקון אם גישה קלה ומהירה יותר היא רצויה, וזה מקובל יש מספר פחות מדויק של תאים שהופקדו. תיקון:
- לגעת קיסם סטרילי למושבה למבחן - לא להרים את כל התאים.
- תיקון (לעשות פס קטן) על גבי הצלחת הריקה.
- חזור על תיקון עם קיסם טרי על צלחת כתב.
- חזור על תיקון עם קיסם טרי על צלחת בקרה.
- בחר אכון אם גישה כמותית ושחזור היא רצויה. תצפית מאפשרת למספר תאים שהופקדו להיות מנורמל (ראה התייחסות 5 לפרטים מלאים), ומאפשרת את העוצמה היחסית של אורגניזמים השונים לגרימה להשוות. לאתר:
- Resuspend המשוערת גרימת אורגניזמים ב 1 מיליליטר של נוזל תקשורת בקובט פלסטיק סטרילית.
- קח OD 600 של resuspensions.
- שימוש בנוסחה X = 250 ÷ (OD 600-0.5), להוסיף נפח X עבור כל resuspension 500 μl של מדיום נוזלי כדי לקבל פתרון עם OD 600 של 0.5. שיטה זו מפשטת את צעדי pipetting הנדרשים בעת ביצוע דילולים מרובים כדי לנרמל OD של, כי אתה יכול להשתמש באותו הנפח (500 μl) עבור כל dilutants שלך.
- μl מקום 1 של כל resuspension OD-מנורמל לכל אחת משלוש הצלחות.
- בחר תיקון אם גישה קלה ומהירה יותר היא רצויה, וזה מקובל יש מספר פחות מדויק של תאים שהופקדו. תיקון:
- תן לגדול ב24 מעלות צלזיוס במשך שעה 24-28 (או כפי שמתאים לכתב / assay שלך).
- השתמש במיקרוסקופ לנתח הניאון כדי לזהות אורגניזמים גרימת משוערים המפעילים מתח שלך ניאון הכתב אך לא מתח בקרת ההורים שלך. מבודדים אלו הם הלהיטים החיוביים שלך - החיידקים הסביבתיים שמפרישים תרכובות לגרום הפנוטיפ של עניין שלך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מסך זה משמש לזיהוי אורגניזמים אדמה מפריש תרכובות המשנות את הפיסיולוגיה של B. subtilis. התוצאות המתוארות כאן יתמקדו בסוג התא שמייצר מטריצה של B. subtilis, אשר מייצר את החלבון וexopolysaccharide הנדרשים ליצירת biofilm חזקה בחיידק זה. אנחנו בחרנו את האמרגן של אופרון טאפה-sipW-טסה למבנה שלנו ניאון כתב (P טאפה-YFP). אופרון זה מקודד את המרכיב המבני החלבון של מטריקס, והוא שהוגברו במהלך ייצור מטריצת biofilm 23. כתב המטריצה שלנו (איור 1) נבנה כמתואר 19 בעבר.
עבודות קודמות הראו כי ב subtilis מייצר מטריצה בתגובה ל- מניין כמו חישה-surfactin בהפקה העצמית המולקולה, כמו גם מטבוליטים מטוהרים המיוצרים על ידי חיידקי קרקע אחרים 20. היינו מעוניינים בהרחבהמחקרי se לחקור באופן רחב יותר שחיידקי אדמה להפוך מטבוליטים מסוגלים גרימת ייצור מטריצה בB. subtilis. אנחנו בחרנו להשתמש לדלל LB לצמיחה, שכן המדיום הזה כבר היה ידוע להביא לייצור מטריצת עניי 20, לתת לנו מצב שבו צמיחת זן הכתב שלנו היה nonfluorescent. לאחר מכן, אנו מותאמים מספר המושבות מתאימות להקרנה בתנאי גידול אלה. על מנת לייעל את כל צלחת מסך, יש צורך לקבוע כמה מושבות לגדול מ aliquots הקרקע והכתב הקפואים ומה הריכוז המתאים של מושבות ותנאים תזונתיים הם. באופן אידיאלי אנחנו רוצים כל צלחת coculture להכיל מספר שווה של מושבות קרקע וכתב (כלומר יחס של 1:1 מכתב: אדמה) ולהיות צפופות, מושבות בודדות. יחס גבוה זה של מושבות כתב מגביר את הסבירות כי משדל יפעיל מושבות כתב סביבה מרובות. לאחר ac מרובהמושבות inducer tivated שמסביב ביטחון עליות המושבה inducer המשוערת באיכון האורגניזם הגרימה בפועל (איור 2). התוכן התזונתי שולט במידה של היווצרות גידול / מושבה תוך הדילול של הבידוד קובע אם המושבות וכתוצאה מכך הם התפזרו כראוי. על צלחת פטרי סטנדרטית 10 קוטר סנטימטר עם מדיום תזונתי נמוך, מצאנו כי כ 25,000 מושבות בסך הכל לכל צלחת (50 μl של 5 x 10 5 CFU / דילול מיליליטר) סיפק את ההפרדה הטובה ביותר של B. מושבות subtilis על מדיום מגבים LB 0.1x (איור 4).
למרות מחושב CFU / מיליליטר מהדילולים סדרתי מספק ריכוז משוער של חיידקים בaliquots, יש צורך להבטיח כי הריכוז של המושבות וכתוצאה מכך הוא מתאים כאשר כל צלחת היא התפשטה עם תאים. CFU / הצלחת מחושבת וCFU / הצלחת בפועל הם לא תמיד זהים (איור 4
לאחר הכנת aliquots של הכתב והאדמה, אנחנו ערבבנו אותם על צלחות מסך coculture ובחנו אותם לקרינה באמצעות stereoscope (איור 5). אנחנו גם מצופים פקדים שהיו מחוסן רק עם או אדמה או B. subtilis P זן כתב טאפה-YFP. B. subtilis מייצר מטריצת biofilm (הקרינה) בתגובה למספר רב של חיידקים מהקרקע כפי שניתן לראות על ידי מושבות ניאון בתמונה coculture באיור 5. לקרקעות שבדקנו, היו לנו שיעורי להיט גבוהים לכתב P טאפה-YFP. כפי שתואר בהתייחסות 5, בין 12-67% מהבידודים (מתוך שש דגימות קרקע שונות) הייתה יכולת induהקרינה ce בזן כתב P טאפה-YFP. זאת בניגוד לתוצאות שלא פורסמו שלנו ממסכים מקבילים באמצעות נביגה (P sspB-YFP) והיכולת לכתבים (P comG-YFP). לאחר הקרנה נרחבת (> 200,000 מושבות לכל כתב), רק שני אורגניזמים זוהו כי לגרום נביגה, בעוד שאף אחד מהם זיהו כי לגרום ליכולת. לפיכך, שיעורי הלהיט לתאים מסוגים שונים הם יהיו משתנים מאוד ועלולים להיות קשים לחיזוי מראש.
לאחר מכן, אנו הרמנו מושבות גרימה המשוערות בודדות. המושבות על צלחות מסך coculture הן די קטנות על המדיום הנמוך התזונתי מומלץ (קוטר submillimeter). אף על פי כן, זה אפשרי לבחור בצורה מדויקת ובודד מושבות קטנות מאוד ביד (איור 6) מתוך צלחת מסך coculture מסובכת. השיטה הידנית שאנו משתמשים היא פשוטה ולא דורשת כלים מיוחדים ולא עיקור להבה. לאחר מכן מושבות inducer המשוערות אלה restruck לבידוד. בגלל צלחות coculture עמוסות במושבות, אין זה יוצא דופן - אפילו עם טכניקת קטיף זהירה מאוד - יש אורגניזם אחד או יותר הולך וגדל מכל מדגם inducer משוער. בחינה מדוקדקת צריכה לאפשר בידוד של מושבות מורפולוגית שונות. אז כל יצורי גרימת המשוערים נבדקים במסך המשני. תוצאות חיוביות ושליליות משני התיקון ושיטת נקודה מוצגות באיור 3. בהתחשב בצמיחה הצפופה שלהם, היכולת שלנו לאסוף פיזי גרימת מושבות מצלחות coculture היה טובים למדי, עם כ 50% מהמושבות שנבדקו במסך המשני שלנו להיות חיובי אמיתי. תוצאות נוספות מהמסך הזה, כמו גם עבודת מעקב המתעוררות ממנה כבר תוארו בעבר 5.
/ Ftp_upload/50863/50863fig1.jpg "/>
איור 1. כתב תעתיק ניאון לבנות. האליפסה הכחולה מייצגת תא חיידק והקו המקווקו מייצג כרומוזום שלה. דוגמא זו מראה כתב תעתיק ניאון לייצור של מטריקס. מוקד הילידים נותר בשלמותה (מטריצת מטריצת P, שבו "P" והחץ מציין את האזור המקדם), ואילו לבנות הכתב (מטריצה-YFP P) מוכנס במקומות אחרים בכרומוזום בלוקוס ניטראלי.
איור 2. דוגמאות אידיאליות של תוצאות הקרנת coculture עם יחס שונה של הכתב: חיידקים סביבתיים. א) שימוש בכתב נמוך: יחס חיידק סביבתי מוביל ליותר עמימות בזיהוי אורגניזמים גרימת משוערת מאשר כאשר B) כתב גבוה: יחס חיידק סביבתי משמש. העיגולים החומים מייצגים אורגניזמים אדמה, העיגולים האדומים מייצגים אורגניזמים אדמה וישכנע, העיגולים הכחולים מייצגים מושבות כתב uninduced, והמושבות הירוקות מייצגות מושבות כתב מושרה. הקווים האדומים המקווקו מציינים את רדיוס הפעולה של המטבוליט התרמה. כוכבים מצביעים על מושבות nonfluorescent ש-- המבוססות על קרבתם למושבות ניאון - הן אורגניזמים גרימת משוערים וצריכה להיות הרים והערכה מחדש במסך המשני.
איור 3. מסך המשני. A ו-B) שרטוטים של איך לחלק תוקנו או הבחין מבודד על צלחות מסך משניים, בהתאמה, עבור ב ' כתב מטריצת subtilis. מרווח נדיב יותר עשוי להידרש לכתבים אחרים או מבודד וישכנע, depהמסתיים בdiffusibility של מטבוליטים שלהם הפעילים.) נציג תוצאות C ו-D מאדמה תוקנו מבודדים כי הם שליליים וחיוביים, בהתאמה, לגרימת B. subtilis P טאפה-YFP-כתב. לוחות העליונים הם תמונות brightfield; פנלים התחתונים הם תמונות הקרינה. סרגל קנה מידה הוא 1 מ"מ. ה) שלילי ותוצאות חיוביות מאדמה מנומרת מבודדת לאותו כתב. סרגל קנה מידה הוא 2 מ"מ.
איור 4. קביעת ריכוז microcolony. ההפצה והגודל של המושבות שלך תהיה תלוי גם בריכוזי חומרי מזון ותא) הבדלים. בצמיחה של ב ' subtilis על 0.01x LB (בשורה העליונה) לעומת 0.08x LB (בשורה תחתונה). על תאים ב0.01x LB לא יוצרים לmicrocolonies, ואילו לא צינור על 0.08x LB לעשות. (שים לב שעבור המסכים שלנו הגדלנו את רמות חומרים המזינים במקצת מאלה המוצגים כאן:. מ0.08x LB ל0.1x LB) תמונות אלה הן מכתמי μl 1 של 01:05 דילולים רציפים בידוע CFU / מיליליטר. השלכה מריכוזים אלה, כדי לקבל הפצות דומות של מושבות על פני צלחת פטרי 10 סנטימטר תדרוש ציפוי (משמאל): 3,200,000; 640,000; ו128,000 בסך הכל CFU לכל צלחת. עם זאת, תוצאות תצפית בחלוקה לא שווה של תאים (הם מרוכזים בקצות הכתם) בהשוואה להפצת תאים על פני כל הצלחת. וכך, ברגע שריכוז חומרי תזונה נבחר, חשוב לבחון צלחות התפשטו עם מגוון רחב של ריכוזים. בר סולם הוא 0.1 מ"מ B) לוחות אלו מראים את התוצאות של הפצה (משמאל) 50,000;. 25,000; ו5,000 CFU סך הכל לכל צלחת על צלחות 0.08x LB. מתמונות אלה, בחרנו 25,000 כמספר היעד שלנו של CFU / צלחת. בר סולם הוא 0.1 מ"מ.
= "תמיד"> בעמודים 
איור 5. Coculture של B. subtilis P טאפה-YFP מעורבב עם אורגניזמים אדמה. כיסוי של brightfield ותמונת הקרינה מצלחת מסך coculture מכילה B. כתב subtilis P טאפה-YFP מטריצה מעורב עם אורגניזמים אדמה. ראש חץ מצביע על משדל משוער המוקף microcolonies כתב הקרינה. סרגל קנה מידה הוא 1 מ"מ.
איור 6. הפגנה של היתכנות של בידוד מושבות חיידקים זעירים מצלחות coculture. A ו-B) לוחות אלו מראים שני שדות מבט של צלחות אגר המכילות קהילות חיידקים מורכבות מאדמה. מושבות קטנות כמו 0.1 מ"מ ניתן לבודד באמצעות טכניקת הקטיף תיארהכאן. לוחות העליונים הם שדה הראייה לפני קטיף מושבה, ופנל תחתון הם אותם שדות הראייה לאחר קטיף מושבה. ראשי חץ אדומים מצביעים בו תאים הוסרו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחת המגבלות הטבועות של הפרוטוקול הזה הוא שהוא מסתמך על cultivability של אורגניזמים מיקרוביאלי. כפי שכבר תעד 24 היטב, רוב החיים מיקרוביאליים על פני כדור הארץ לא יכולים (עדיין) להיות מבוגרים בתנאי culturing נחקרו עד כה. לפיכך, מספר עצום של יחסי גומלין בין מינים של חיידקים המתרחשים בסביבה טבעית יהיה ללכת מבלי שיבחינו באמצעות גישה זו. עם זאת, מאחר שהרצון שלנו הוא לזהות לא רק את קיומה של אינטראקציות כאלה, אבל אז גם ללמוד את המנגנונים ומולקולות מעורבים בתיווכם, את היכולת לעבד את החיידקים האלה היא הכרח. אפילו בתוך מינים לעיבוד, באזור זה נחקר בצורה גרועה, מה שהופך את הגישה שתוארה כאן תרומה משמעותית כשיטת לזיהוי אינטראקציות בתיווך כימי בין חיידקים. בנוסף, למרות שפרוטוקול זה כבר מותאם למסך עבור מטריצת אינדוקציה של Bacillus subtilis, הוא יכול באופן תיאורטי להיות מיושםכתב y תעתיק ניאון בכל מיני חיידקים אחרים.
מגבלה נוספת הקשורים לגישה זו היא שהמסך הזה (על פי הגדרה) דורש coculture. בסביבה טבעית, חיידקים עם שיעורי צמיחה שונים עשויים לדור בכפיפה אחת עדיין בקרבת מרחבי תוך ניצול נישות סביבתיות שונות. אינטראקציות של חיידקים כאלה היו שלא להתגלות על ידי מסך coculture שלנו, לעומת זאת, שרק תאפשר את הצמיחה של חיידקים סביבתיים עם דרישות וצמיחה בשיעורים דומים לאלה של מיני הכתב תזונתיים. שינויים שיפרידו בין הצמיחה של אורגניזמים גרימה הפוטנציאליים מהצמיחה של זן הכתב הם בהחלט אפשריים. כמו כן, אנו צפויים כי צמיחת hyphal של פטריות - נפוצות באדמה - עלולה לגרום לקשיים במסך שיתוף התרבות. בעוד לוח הזמנים הקצר של המסך שלנו עם ב ' subtilis גרם לכך שכמה פטריות אותרו, והוסיף תרכובות נגד פטריות למדיום הגידול יכול מ 'inimize חשש זה.
היכולת לבחור הפנוטיפ מתאים וגן למבנה כתב הניאון לא אמורה להיות קשה, בהתחשב בעושר של רצף ונתונים תעתיק אחד כבר זמין או השגה בקלות למינים רבים של חיידקים. עם זאת, קושי אחד עם הגישה המתוארת כאן הוא הצורך לזהות תנאי גידול שלמזער את הקרינה הרקע של מתח הכתב שלך, המאפשר זיהוי של אינדוקציה הקרינה. זיהוי של תנאים אלה חייבים להיות לעתים קרובות נעשה באופן אמפירי, למרות שנתוני תעתיק יכולים לסייע חיפוש זה (נתוני microarray הריצוף זמינים לצמיחה של 'subtilis למשל מאפשר זיהוי של תנאים שבם גנים של העניין באים לידי ביטוי 10 גרוע). עבור חלק מכתבים חיפוש אמפירי זה יכול להיות מאתגר, בין שאר משום שהביטוי של רבים פנוטיפים חיידקים הוא הטרוגנית. במילים אחרות, זה נדיר למצוא גonditions בהם לא תאים בתוך האוכלוסייה מביעים הפנוטיפ X. לכן, תלוי במספר של תאים בתוך שsubpopulation ואת כוחו של ביטוי גנים, זה עלול להיות קשה לזהות תנאים המספקים מספיק הקרינה רקע נמוכה כדי לאפשר אינדוקציה כדי להתגלות . אלטרנטיבה לחיפוש אמפירי זה לתנאי הקרנה אידיאליים עשויה להיות "מנגינה" רמות הביטוי של הכתב באמצעות mutagenesis המכוון. על ידי שינוי האזור המקדם ו / או אתר מחייב ריבוזומלי של הכתב לבנות, רמות הקרינה הרקע יכולים להיות ירידה. זה יכול להרחיב את השימושיות של מסך כך שהוא מאפשר אפילו גנים עם כמה הפעלה מכוננת כדי להיבחן לזירוז.
אורגניזמים ברגע שישכנעו זוהו ואישרו במסך משני, הם יכולים להיות מזוהים על ידי רצף פילוגנטית גן 16S rRNA שלהם. כמו כן, ניתן לכמת את המידה של נורותcence באמצעות נקודת 600 מנורמלת OD במסך המשני 5. זה יכול לספק מידע על שחברי הקהילה לייצר תרכובות המשפיעות על מתח הכתב שלך ובאיזו מידה. כתוצאה מכך, זה יכול להוביל להשערות על שאינטראקציות של חיידקים עשויות להיות התרחשות בסביבה טבעית ואת היכולת לחקור את האבולוציה משותפת הפוטנציאל של אורגניזמים ייצור ולהגיב אלה. כיוונים עתידיים נוספים כוללים הבהרת המבנה של המולקולה המופרשת עצמו, קביעת המנגנון (ים) שבו האורגניזם להגיב חושים המתחם הזה, ולהשתמש בו ככלי כימי לווסת פנוטיפים חיידקים.
אפילו עם השיקולים שתוארו לעיל, בשיטה המתוארת כאן היא תרומה משמעותית. זה ימנע את העבודה מעורבת בהרכבת ספרייה של חיידקים סביבתיים, אך מאפשר הפרדה הפיסית שלהם ובידוד באמצעות תקשורת מוצקה. כוחו של מסך coculture זו הוא כיזה מספק שיטה פשוטה קונספטואלית וטכנית למסך דרך אלפי מינים של חיידקים כדי לזהות את אלו שמפרישים תרכובות ביו של עניין בעת היותו החלים על מינים רבים ופנוטיפים חיידקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחבר מודה רוברטו Kolter (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד) לקבלת הייעוץ לא יסולא בפזו וסיוע במהלך הפיתוח של מסך coculture זה. היא גם הודות מתיו פאוורס לקריאת כתב היד לבהירות, וChia-יי נג לקבלת סיוע בקבלת איור 6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrophotometer | Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values. | ||
| Luria broth, Lennox | VWR | 80017-484 | Alternative media sources may be necessary. |
| Glass beads, 3 mm | VWR | 26396-508 | |
| Gel loading tips, round | VWR | 29442-666 | |
| Glass rods | VWR | 59060-069 | |
| Fluorescence dissecting stereoscope | Zeiss | N/A | The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary. |
References
- Berdy, J.
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
- Shank, E. A., et al. Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).
- Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
- Nicolas, P., et al. Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science. 335, 1103-1106 (2012).
- Middleton, R., Hofmeister, A. New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis. Plasmid. 51, 238-245 (2004).
- Shimotsu, H., Henner, D. J. Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis. Gene. 43, 85-94 (1986).
- Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis. Gene. 180, 57-61 (1996).
- Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera. J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).
- Charpentier, E., et al. Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).
- Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1. J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).
- Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).
- Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
- Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. Strategies for culture of 'unculturable' bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).
- Romano, J. D., Kolter, R. Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival. J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Zengler, K., et al.
