Använda Coculture att upptäcka Kemiskt medierade mellan arter Interaktioner

Summary

Bakterier producerar utsöndrade föreningar som har potential att påverka fysiologi deras mikrobiella grannar. Här beskriver vi en coculture skärm som tillåter detektion av sådana kemiskt medierade mellan arter interaktioner genom att blanda jordmikrober med fluorescerande transkriptions reporter stammar av Bacillus subtilis på fasta medier.

Abstract

I naturen, bakterier förekommer sällan isolerat, de är istället omges av en mångfald av andra mikroorganismer som förändrar den lokala miljön genom att utsöndra metaboliter. Dessa metaboliter har potential att modulera fysiologi och differentiering av deras mikrobiella grannar och är sannolikt viktiga faktorer för upprättande och underhåll av komplexa mikrobiella samhällen. Vi har utvecklat en fluorescens-baserade coculture skärmen för att identifiera sådana kemiskt medierade mikrobiella interaktioner. Skärmen innebär en kombination av ett fluorescerande transkriptionell reporter stam med miljö mikrober på fasta medier och låta kolonierna att växa i samodling. Den fluorescerande transkriptionell reportern är utformad så att den valda bakteriestammen fluorescerar när den uttrycker en speciell fenotyp av intresse (dvs. bildning av biofilm, sporulering, virulensfaktor produktion etc.) Screening utförs under tillväxtbetingelser where denna fenotyp uttrycks inte (och därför reportern stam är vanligtvis icke-fluorescerande). När en miljö mikrob utsöndrar en metabolit som aktiverar denna fenotyp, diffunderar det genom agar och aktiverar den fluorescerande reporterkonstruktionen. Detta gör att förmå-metaboliten producerande mikrob som ska detekteras: de är de icke-fluorescerande kolonier mest proximala till de fluorescerande kolonier. Således gör denna skärm identifiering av miljö mikrober som producerar diffunderbara metaboliter som aktiverar en viss fysiologisk reaktion på en reporter stam. Denna publikation beskriver hur du: a) välja lämpliga coculture screening förhållanden, b) förbereda reporter och miljö mikrober för screening, c) utföra coculture skärmen, d) isolera förmodade framkallande organismer, och e) bekräftar sin verksamhet i en sekundär skärm. Vi utvecklade denna metod för att screena för markorganismer som aktiverar biofilm matrix-produktion i Bacillus subtilis

Introduction

Vi är intresserade av att förstå hur de metaboliter som bakterierna utsöndrar påverkar fysiologi och utveckling av grann mikrober. Många metaboliter har karakteriserats för sina bioaktiva effekter på andra mikrober. Två väl beskrivna exempel innefattar antibiotika, vilka inhiberar tillväxten av andra mikroorganismer och quorum sensing molekyler, vilka ändrar det globala genuttrycket av andra mikrober. Men bakterier producerar många andra små molekyler naturliga produkter som inte har några kända bioaktiviteter ^1. Vår hypotes är att bakterier har utvecklats och bevarat förmågan att producera några av dessa metaboliter eftersom de tillåter dem att modulera cellulär fysiologi för sina mikrobiella grannar i de komplexa mikrobiella samhällen inom vilka de flesta bakterier finns.

Typer Bacillus subtilis cell

Vi har fokuserat våra studier på kemiskt medierade mikrobiella interaktioner som involverar bacillus subtilis. Detta är inte bara på grund av sin status som grampositiva modell bakterie och de resulterande genetiska verktyg som finns för dess manipulation, utan också på grund av dess förmåga att differentiera till karakteriseras celltyper. Exempel är celler som är: simning, som producerar den extracellulära matrisen som krävs för robust biofilmsbildning, som är behöriga att ta upp DNA från omgivningen, och sporbildande, bland annat ^2. Var och en av dessa celltyper uttrycker en karakteristisk transkription regulon som gör dem fysiologiskt och / eller fysiskt skilda från sina genetiskt identiska syskon. Under många tillväxtförhållanden, flera celltyper samexistera så olika subpopulationer i en enda koloni av B. subtilis-celler ^3. Även om många arter av bakterier kan uppvisa motsvarande celltyp heterogenitet, detta fenomen har särskilt studerats i B. subtilis.

I synnerhet kan gener som är UPRegulated inom var och en av dessa specifika B. subtilis celltyper har identifierats. Identifiera sådana uppreglerade gener är avgörande för det arbete som beskrivs här eftersom många av dessa mikrobiella fenotyper av intresse är svåra eller omöjliga att observera direkt. Till exempel kan vi inte visuellt upptäcka en egenskap såsom simning på fasta (1,5%) agarplattor, trots att en subpopulation av B. subtilis celler producerar flag under dessa förhållanden ^3. Ett annat exempel är biofilm matrix-produktion. Matrix produktion kan visualiseras genom kolonimorfologi (eftersom det resulterar i makroskopiskt rynkig kolonier), men bara på vissa tillväxtmedium, och först efter flera dagar av tillväxt ^4. Men genom att veta vilka gener som uppregleras under differentiering, kan vi konstruera transkriptions reportrar som fungerar som markörer för celldifferentiering i dessa celltyper.

Reporterkonstruktioner

Dessa fluorescerande transcriptional reportrar består av promotorerna för cell-typ specifika gener som driver produktion av en reportergen, t ex ett fluorescerande protein. Exempel innefattar P _hag-YFP (för att bada celler), P _TAPA-YFP (för biofilm matrix-producerande celler), och P _SSPB-YFP (till sporbildande celler), där P _{^ anger} promotorregionen för genen x. Dessa reporterkonstruktioner är integrerade i en neutral-lokuset på kromosomen (Figur 1 och se nedan), så att den naturliga regleringen av fenotypen lämnas intakt. Men nu, när en cell uttrycker denna fenotyp uttrycker det också ett fluorescerande protein. Detta ger en lätt visualiseras avläsning av aktiveringen av särskild fenotypisk beteende, vilket tillåter oss att screena för mikrober som aktiverar denna fysiologisk respons. Även om sådana reportrar är vanliga i mikrobiologi, de har inte varit i stort sett tillämpas på skärmar till identify metaboliska interaktioner mellan mikrober innan denna metod beskrivs ^5.

Det finns ett antal viktiga överväganden vid konstruktion och tillverkning av cell-typspecifika reporter stammar. Vi har använt uteslutande transkriptions fluorescerande reportrar, även om andra typer av konstruktioner är säkert möjligt. Vi motverka användning av translationella fusioner som markörer för celltyp differentiering i vår skärm, men av två skäl: 1) en önskan att lämna den infödda cell-typ-specifikt protein oberörd, och 2) det erkännande som en diffus, cell- breda fluorescens blir lättare att upptäcka än lokaliserad puncta inom celler (gemensamt med translationella fusioner).

Reporter selektionsgenen

Efter att ha beslutat att använda transkription som en avläsning, måste reportergenen väljas (t.ex. LacZ, fluorescens, eller luciferas). LacZ har fördelen av att behöva den minst speciellaized utrustning för att upptäcka, men det finns en mycket högre sannolikhet för falska positiva bland miljö mikrober. I våra händer, bakgrundsnivån av Lac ⁺ organismer bland jordmikrober var oöverkomligt hög (>> 10% av jordmikrober var blå (Lac ⁺⁾ på X-gal-plattor, data ej visade). Det är möjligt att genom att titrera den koncentration av X-gal i mediet, kan detta optimeras för att tillåta användning av en X-gal-reportern, även om vi inte försöka detta. Luciferas ger hög känslighet för upptäckt och är den ortogonala reporter: det finns nästan ingen chans att miljö mikrober är till sin natur självlysande. Men vi fann det svårt att identifiera instrumentering vid vår institution som tillät luminiscens upptäckt över hela Petri plattor, eftersom de flesta var utformade för att skanna endast lokala områden i flerbrunnsplattor. Det kan också finnas komplikationer i visualisera självlysande kolonier på ett sätt som också tillät samtidigt är fysiskt ärolation inducera organismer. När du använder förvaltare kan ha gjort detta möjligt, vi istället valt att använda fluorescerande transkriptions reportrar, som visat sig fungera i B. subtilis, förutsatt tillräcklig känslighet för detektering och låga falska positiva värden bland jordorganismer, och tillåts använda av lätt tillgänglig instrumentering för både visualisering och isoleringsförfaranden.

Fluorofor urval

Den specifika fluoroforen väljs beror på dina bakteriearter, den agar odlingsmedium som används, och den särskilda fluorescensfiltret sätter du har tillgängligt. Med vår instrumentering, fann vi att både B. subtilis kolonier själva och ägarn de odlades på uppvisade mindre bakgrundsfluorescens när YFP (yellow fluorescent protein) filter användes, vilket gör att reportern överlägsen till GFP (grönt fluorescerande protein) i våra händer. Den kodonanvändning av fluorescerande proteiner ärofta optimerade för eukaryoter, vilket gör det viktigt att välja en fluorofor antingen känd från litteraturen för att arbeta i din bakteriearter, eller för att testa den explicit med hjälp av en konstitutiv promotor. Ett stort antal ständigt föränderliga fluorescerande proteinvarianter finns idag ^6, som har granskats i ett antal källor ^7,8, varav en del ger explicit vägledning om att välja en lämplig fluorescerande protein för experimentet ^9.

Promoter urval

Valet av en promotor kommer till stor del att bero på din celltyp eller fenotyp av intresse. För sådana organismer som B. subtilis har vissa cell-typspecifika reportergener visats i litteraturen. För andra bakteriestammar, kommer att undersöka microarray eller transkriptions uppgifter vara nödvändiga för att ge information om vilka gener som är högt uppregleras under de förhållanden där din cell typ av intresse is manifesterade. En nyligen genomförd studie katalogis transkriptionen av B. subtilis inom 104 olika tillväxtförhållanden med hjälp av kakel microarrays ^10. Detta dokument ger omfattande information om vilka gener som är mycket uppregleras under olika förhållanden, vilket är ovärderligt för mindre väl karakteriserade fenotyper.

Hellre än att kartlägga exakta promotorregionerna för varje gen av intresse, vi typiskt helt enkelt använda sekvensen 200 till 500 bp uppströms om genen som promotorn. Den exakta sekvenslängden beror på den genomiska sammanhang: kortare regioner används vid behov för att undvika att även uppströms kodande regioner från angränsande öppna läsramar.

Neutral loci och integration

Hur att upprätthålla reporterkonstruktionen i din bakteriestam blir den sista frågan i utformningen av ett fluorescerande transkriptions reporter stam. I bakterier har gener av intresse ofta bibehållaspå plasmider med användning av antibiotikaselektion. Dock kan det inte vara möjligt att använda antibiotika under coculture utan att döda miljö mikrober. Om plasmider stabilt bibehålls i din bakteriearter, kan det vara möjligt odla dina bakterier som innehåller en plasmid burna reporter i närvaro av antibiotika för att förbereda din reporter för screening, och sedan eliminera antibiotika under samodlingen sig i hopp om att plasmiden kommer i tillräcklig utsträckning kan bibehållas för att medge fluorescens. Men om plasmider lätt vilse i din bakterie, eller försvinner under stressförhållanden, detta kommer inte att vara ett hållbart alternativ. I många fall är den bästa lösningen vara att integrera den reporterkonstruktion på den bakteriella kromosomen, som möjliggör stabilt upprätthållande av reporter även i avsaknad av selektion. För att integrationen att inte störa den normala uttryck eller reglering av din gen av intresse, rekommenderar vi att integreras i en ektopisk plats på kromosomen som can fungera som en "neutral locus." I B. subtilis dessa integrations platser är gener som - när muterat - förmedla en fenotyp i viss minimal media (vilket gör integranter identifieras utan antibiotikaselektion), men ändå inte ändrar tillväxt eller sporulering priser i rika medier, och inkludera sådana gener som amyE, Laca, thrC, pyrD, gltA och SACA (transport förmågan att använda stärkelse, β-galaktosider, treonin, uracil, glutamat, och sackaros, respektive) ^11-13.

Även om integrationen i dessa gener har använts på ett tillförlitligt sätt under många år i B. subtilis (särskilt i amyE och Laca), kan motsvarande kunskaper inte är tillgänglig för gener i många andra bakteriearter. Användningen av fag bindningsställen är bra alternativ för neutrala kromosomplatser integrations: många artspecifika ^14-16, samt allmänna platser integrations såsom fäst webbplatsen Tn7 (ATT Tn7) haridentifierats och använts för geninsertioner i många bakteriearter ^17,18.

Miljö mikrober

Vi använder marken som en direkt källa till miljö mikrober för vår coculture skärmen. Den jord som innehåller en stor mångfald av mikrober, och många av dessa organismer är rik källa av naturliga produkter. Genom att använda flytande suspensioner av jord placeras direkt på plåtar med vår fluorescerande transkription reporter stam (utan föregående isolering av bakterier från jorden), vi förenkla den experimentella tillvägagångssätt. Marken kan antingen användas direkt efter skörd, eller frysas vid -80 ° C för framtida bruk. Omedelbar användning har fördelen att en större mångfald av mikrober kan potentiellt odlas, inklusive de som inte överlever frysning bra. Den har den nackdelen att koncentrationen av odlingsmarkorganismer från dessa prover är okänd, vilket ökar antalet skärmplåtar som måste användas. DelAyed användning har den fördelen att de cfu / ml för varje jordkälla kan fastställas i förväg, så att en optimerad antal kolonier som odlas på varje skärm platta. Det kräver dock att markorganismerna kunna överleva frysning.

Observera att diversifiera inducerare poolen som undersöks (dvs. markens källor) tycks vara mer effektiva på att identifiera nya mellan arter interaktioner än fördjupad undersökning på samma mark: ökad fylogenetiska mångfalden observerades i de träffar som identifierats i vår matris-induktions skärmen som ytterligare markkällor undersöktes snarare än screening samma jordkällorna mer noggrant (EA Shank och R. Kolter, Harvard Medical School, opublicerade resultat).

Översikt

Den metod vi beskriver här är okomplicerad när det gäller de tekniska kraven. Det handlar om: 1) konstruktion av en fluorescerande transkriptions reporter i B. subtilis eller enandra bakteriearter av intresse, 2) identifiera vilka villkor denna reporter inte är aktiverad, 3) förbereda alikvoter av denna reporter stam och organismer som ska screenas (i vårt fall jord, men andra källor skulle kunna användas i stället), 4) att blanda dessa två uppsättningar av mikrober på fasta medier, 5) identifiera och isolera förmodade framkallande organismer, och 6) som bekräftar att dessa organismer verkligen aktiverar denna fenotyp i en sekundär skärm. När detta har skett, dessa organismer och deras metaboliter förse oss med kemiska verktyg för att modulera bakterie beteende, för att studera bakteriell fysiologi och mikrobiella interaktioner, och att eventuellt fungera som nya ställningar för framtida terapeutiska föreningar.

Protocol

1. Välj en Reporter Gene och Konstruera en fluorescerande Transkriptionell Reporter

För B. subtilis:

1. Se JUPITER artikeln i ett protokoll som beskriver konstruktionen av fluorescerande transkriptions reportrar i Bacillus subtilis referens ^19.

För andra bakteriearter:

1. Identifiera en gen, som uppregleras under den fysiologiska responsen av intresse. Detta kan baseras på befintlig litteratur eller transkriptionsanalys av mikroben under vissa förhållanden.
2. Konstruera en fluorescerande transkriptionell reporter för denna gen att fungera som en proxy för förändringen i fenotyp. Detta konstrukt bör innefatta promotorn för denna uppregleras gen driver produktion av en lämplig fluorescerande protein (se fig 1).
3. Integrera denna konstruktion i ett neutralt ställe på kromosomen. Detta säkerställer att nativt regulation av genen av intresse inte störs, och undviker behovet av plasmiden urvalsmekanismer (t.ex. antibiotika) som kan störa tillväxten av miljö mikrober.

2. Bestäm Coculture Förhållanden

För B. subtilis P _tapa-YFP reporter:

1. Använd 0,1 x LB, Lennox (1 g trypton, 0,5 g jästextrakt, 0,5 g NaCl per liter) medium för denna reporter, eftersom B. subtilis matrix-produktion är minimal på Luria Broth ^20. Detta medium gör B. subtilis kolonier växa till submillimeter men observer storlek, samtidigt som varierande taxa från jord att växa ^5.
2. Ta med 100 mM MOPS-buffert för att minimera potentiella pH-förändringar.

För andra bakteriearter:

1. Använd publicerade transkriptions uppgifter eller empiriskt testa olika odlingsbetingelser för att identifiera en där mikroben växer men activation av det fluorescerande reporter är försumbar (att låta dess aktivering för att upptäckas när reportern stammen odlas i samodling med inducerande mikrober.)
2. Använd ett medium med lågt näringsinnehåll (i förhållande till traditionellt rika mikrobiologiska medier) vid screening miljö mikrober från näringsfattiga miljöer (t.ex. jorden), eftersom många näringsfattiga bakterier inte växer när du presenteras med hög näringsförhållanden ^21. En låg näringsmedium minskar även kolonistorleken, öka genomströmningen av skärmen.
3. Välj ett medium med låg bakgrundsfluorescens och god optisk klarhet.
4. Optimera tillväxttemperatur för att tillåta både reportern stam och miljö mikrober att växa samtidigt.
5. Betrakta tillsats av ett buffertmedel. Användningen av bufferten i plattorna minskar möjligheten att upptäcka pH-medierade förändringar i fysiologi ^22, om inte sådana interaktioner är av intresse.

3. Förbered Reporter Alikvoter

För B. subtilis P _tapa-YFP reporter:

1. Serie reporter stam från -80 ° C frusen mald på en färsk LB-platta med användning av en steril tandpetare eller applikator pinne.
2. Odla över natten vid 30 ° C.
3. Gör seriespädningar i flytande kultur att minimera bakgrundsfluorescens härrör från tillväxt på ett fast medium:
   1. Inokulera en 5 ml flytande kultur i LB och växa under skakning vid 37 ° C.
   2. När kulturen når ett OD ₆₀₀ ~ 0,6, utspädd i 5 ml färskt LB till en OD ₆₀₀ av 0,02.
   3. Väx vid 37 ° C igen med skakning tills kulturer når OD ₆₀₀ ~ 0,6.
   4. Upprepa serietillväxtspäd totalt 3x.
   5. Låt sista seriespäd kulturen växa till OD ₆₀₀ ~ 0,4.
4. Lägg glycerol till 15-20%.
5. Alikvotera 50-200 pl i 0,5 ml mikrofugrör och frys vid -80 ° C.
6. Make likvärdiga alikvoter för icke-fluorescerande moderstam av reportern (de kommer att krävas under sekundär screening).

För andra bakteriearter:

1. Använda celler som har en låg bakgrundsfluorescens (dvs. odlas under förhållanden där det finns lite uttryck från promotorn som används i reportern).
2. Gör och frysa portioner som innehåller kända cfu / ml (kolonibildande enheter per ml) av reportern stammen så att ett lämpligt antal kolonier kan odlas på varje coculture skärmplatta (se ovan för detaljer).
3. Gör motsvarande portioner för icke-fluorescerande moderstam (de kommer att krävas under sekundär screening).

4. Skaffa jordprover

1. Samla jord i sterila koniska rör eller sterila påsar med hjälp av en spatel, kasta de bästa 0,5 cm av exponerad ytjord.
2. Tillsätt steril saltlösning (0,85% NaCl) vid ett förhållande av 10 ml per 1 gav jord för att göra ett mark uppslamning.
3. Välj en metod för att få bort bakterier från jordpartiklar: a) omedelbar användning av nytt prov eller b) fördröjd användning efter frysning av provet.
   1. För omedelbar användning, virvel slam i 1 min.
   2. För fördröjd användning, blanda jord slurry i mixer för tre 1 min cykler, placera bägaren på is under 1 minut vilar mellan blandningscykler.
4. Låt jord slurry nöja sig med ~ 1 min.
5. Flytta övre vattenskiktet till ett nytt rör.
6. Lägg glycerol till en slutlig koncentration av 15-20%.
7. Alikvotera 50-200 pl i 0,5 ml mikrofugrör och frys vid -80 ° C.

5. Bestäm cfu / ml Frozen Reporter and Soil Portioner

1. Tina en frusen jord och reporter delmängd. Jordmikrober kan tinas på is. Eftersom B. subtilis lyses vid 4 ° C, bör dessa portioner tinas snabbt vid rumstemperatur för att minimera tiden vid låg temperatur.
2. Gör två replikat serial spädningar (till 10 ^-8) i 0,1 x LB eller annan isoton buffert.
3. Tallrik 5 jil fläckar av varje serieutspädning på agarplattor av samma medium som kommer att användas för samodling screening.
4. Väx vid RT (eller den temperatur som kommer att använda för screening).
5. Nästa dag, räkna antalet kolonier i varje fläck och beräkna cfu / ml av var och en av de frysta alikvoter.

6. Bekräfta Alikvotera Koncentrationer för Spread silplåtar

1. Tina en frusen alikvot som i steg 5.1.
2. Späd till 1 x 10 ^5, 2,5 x 10 ^5, 5 x 10 ^5, 1 x 10 ^6, och 2,5 x 10 ⁷ CFU / ml.
3. Lägg 50 pl plats för varje utspädning till mitten av enskilda plattor. Dessa bör ge plattor med den beräknade optimala 25.000 kolonier per platta, samt 2 - och 5 - gånger mer och mindre, vilket gör den bästa verkliga utspädning som skall fastställas.
4. Lägg ca 20 sterila glas (3 mm) pärlor efterförsiktigt knacka dem på plattan. Pärlor ger en jämnare fördelning av kolonier över plattan än en böjd glasspridare gör.
5. Sprid celler genom att hålla plattorna på bänk och skaka dem fram och tillbaka, vrida dem medan du arbetar, tills vätskan har absorberats. Fortsätt inte skaka kulorna när plattan är torr, annars kommer det att börja döda bakterierna.
6. Vänd plattorna över och kasta pärlor i avfallsbägare som innehåller etanol.
7. Låt plattorna växa under tiden för din analys (t.ex. 24 timmar) vid rätt temperatur för analys (t.ex. 24 ° C / RT).
8. Med hjälp av en dissekera stereoskop, räkna antalet kolonier i två eller flera synfält.
9. Beräkna antalet kolonier per område och avgöra hur många kolonier på varje platta.
10. Justera framtida spädningar som behövs. Det faktiska antalet kolonier är inte lika viktigt som att ha samma nummer på varje jämförbar skärmplåt.

1. Tina reporter alikvot (och jord alikvot om de är frysta) som i steg 5.1.
2. Späd reporter (till koncentrationer optimerade i avsnitt 6) i 0,1 x LB eller annan låg närings, isoton lösning.
   1. För frusen mark: Späd till koncentration optimeras i avsnitt 6 i 0,1 x LB eller annan låg närings, isoton lösning.
   2. För ny jord: Gör spädningar av ny jord slurry, som baseras på prognoser om att de cfu / ml av jord slammet kan vara allt från 10 ^-4 till 10 ^-9 cfu / ml.
3. Spot 50 l av jord och reporter späd på mitten av coculture skärmplåt. Också, tallrik jord ensam och ensam som kontroller reporter.
4. Bred användning av glaspärlor såsom beskrivs i steg från 6,4 till 6,6.
5. Om det finns kända tillväxtbetingelser som aktiverar det fluorescerande reporter, strimma eller platta din reporter under dessa betingelser och växa för att använda som en positiv kontroll vid screening. Inkubera vid 24 ° C i 24 - 28 timmar (eller vad som är lämpligt för din reporter / analys)

8. Skärm coculture Plattor för fluorescens

1. Med hjälp av bright belysning, fokusera din stereoskop så att kolonierna är vassa.
2. Titta på mark bara plattor för att avgöra om din jordprov har autofluorescerande kolonier. Om så är fallet, kan detta jord resulterar i en hög frekvens av falska positiva (med en åtföljande ökning av sekundär sållning).
   1. Använd en hög andel reporter: jord i dina coculture plattor för att öka chansen att en inducerare kommer att omges av flera reporter kolonier, vilket minskar risken att de kommer att upptäckas som falskt positiva (Figur 2).
   2. Använd en annan fluorescerande protein (en som emitterar i en annan kanal).
3. Bestäm assay timing. För de flesta nya reportrar, är tidpunkten för potentiell induktion okänd och måste bestämmas empiriskt.
   1. Börja screening för fluorescens så snart samhällena blir tydligt med dissekera stereoskop (förstoring ~ 30X) och fortsätta att undersöka plattorna regelbundet tills tillväxten har upphört och / eller bakgrundsfluorescens blir för hög.
   2. När tidsfönstret av potentiell induktion bestäms för en viss reporter, bör det vara likartade för alla samodling plattor innehållande som reporter, förenkla övervakningen av silplåtar. För B. subtilis P _TAPA-YFP reporter, är en lämplig tid att undersöka plattorna mellan 24-28 timmar efter plätering cellerna, för B. subtilis P _SSPB-YFP reporter, är det mellan 26-32 timmar av tillväxt.
4. Maximera din fluorescens känslighet:
   1. Se till att din fluorescens dissekera omfattning är i ett mörkt rum eller omgiven av mörkläggningsgardiner. Induktion kommer sannolikt att vara mindre intensiv än ett konstitutivt producerade FP och kräver större känstivitet att detektera.
   2. Ge tid för fluorescens-lampa för att stabilisera och dina ögon att anpassa sig till mörkret innan du försöker att upptäcka fluorescens från dina coculture plattor (minst 1-2 min).
5. Med hjälp av en positiv kontroll (om du har någon), se till att förstoringen du använder gör att du kan upptäcka fluorescens. Förstoringen är oftast bäst om ditt synfält är ungefär 30-50x din typiska koloni diameter (200-400X).
6. Stäng av starkt ljus och öppna slutaren för fluorescens.
7. När dina ögon har anpassat sig till mörkret, sakta flytta plåten fram och tillbaka över ditt synfält, letar efter ljuspunkter.
   1. Börja från toppen av plattan och använda ett sicksackmönster för att förflytta plattan från sida till sida när du flyttar mot botten av plattan.
   2. Öva att flytta plattan i ljusfält för att få en känsla för hur långsamt att flytta till plattan, och för att vara säker på att du täcker hela suransikte område.
   3. Flytta plattan tillräckligt långsamt att kolonierna inte blir suddig. Det är bättre att oversample ytan snarare än miss områden.
   4. Efter ett helt svep, vrid plattan 90 ° och upprepa. Mänskliga ögon är anmärkningsvärt bra på att upptäcka och med svag fluorescens genom denna metod.
8. Om du upptäcker fluorescens, sluta flytta plattan och gå tillbaka och hitta det fluorescerande området.
9. Slå på ljusfält på långsamt, avgöra om fluorescens är associerad med en bakteriekoloni (och inte autofluorescent jord detritus eller mediekomponenter). Om så är fallet, de icke-fluorescerande kolonierna proximala till den fluorescerande kolonin är förmodade inducerande organismer.

9. Isolera Förmodade inducerande Organismer

1. När inducerade (fluorescerande) kolonier har identifierats, isolera de kolonier som utsöndrar de inducerande föreningar.
   1. Om en tillräckligt hög koncentration av reporter kolonier växer på plattan(> 0,5:1 reporter: jord cfu), kommer de förmodade inducerande kolonierna omges av flera fluorescerande kolonier (igen, se figur 2).
   2. I de fall där komplexiteten i coculture tillväxten gör det tvetydigt vilken koloni är inducerare, isolera flera potentiella inducerande kolonier för efterföljande testning på den sekundära skärmen.
2. Lokalisera kolonierna som du vill plocka i mitten av synfältet.
   1. Om de är nära kanten av plattan, vrider plattan så att läppen av plattan är borta från din dominanta hand (dvs om du är högerhänt, satte läppen av plattan till vänster). Detta gör det möjligt att närma kolonierna på en låg vinkel, vilket förbättrar noggrannheten i din plockning.
3. Placera färska plattor till strimma de förmodade inducerande organismer till i närheten, liksom ett slöseri bägare att förbrukade tips in.
4. Lämnar fluorescens-lampa på, vrid det starka ljuset saktapå, så att du kommer att kunna identifiera (med form och läge), fluorescerande kolonin och de omgivande förmodade inducerande organismer. Du kan behöva gå fram och tillbaka med ljuset några gånger för att kunna identifiera de kolonier som du vill plocka när det inte finns någon fluorescens och bara starkt ljus.
5. Använd en glasstav (200 mm lång x 5 mm diameter) för att plocka upp en steril, rund 200 jil gel-laddning spetsen och hålla den som en penna. Detta är plock verktyg du använder för att isolera enskilda kolonier.
6. Vila yttre handflatan mot scenen för att stabilisera det på arbetsytan. Placera den andra handen på det inre, tummen sidan av din hand för att stabilisera din plockverktyg.
7. Om det behövs, vänd åter mellan fluorescens och bright vyer för att identifiera de kolonier som du vill hämta.
8. Att hålla pipettspetsen över plåtytan, flytta den till ditt synfält och centrera den över kolonin du vill plocka. Tipset kommer att vara ur fokus.
9. Använda den yttre kanten av handen (som vilar på mikroskopställningen eller arbetsyta), svänga pipettspetsen sakta ned till kolonin som skall plockas. Rör det väldigt lätt, försöka minimera hur många andra kolonier spetskontakter.
10. Utan att rotera dyrkverktyg, strimma på en sektion av en färsk platta. Fördela med en mjuk känsla för att undvika mejsling agar. Eftersom antalet celler som överförs genom denna metod är ganska små (kolonierna är mycket mindre än vanligtvis manipuleras), kommer en enda kontinuerlig strimma resultera i isolerade kolonier.
11. Upprepa denna process med andra förmodade inducerande organismer.
12. Inkubera plattorna vid 24 ° C (eller temperaturen i din analys).

10. Streak Förmodade framkallande organismer för att erhålla isolerade enstaka kolonier

1. Med hjälp av ett stereoskop, bestämma - baserat på koloni struktur eller morfologi - om det finns olika kolonityper som finns i var och en av din förmodade plockade inducing organismer.
   1. Titta på kolonierna med en scen där man kan belysa kolonierna från både ovan och underifrån för att upptäcka eventuella koloniskillnader.
2. Restreak varje annan morphotype på en ny platta och inkubera tills vuxit.
3. Restreak en gång till och låt växa. Om olika morphotypes kvarstår, fortsätter att restreak till renhet.

11. Retest Förmodade framkallande organismer i sekundär skärm

1. Testar om alla de förmodade inducerande organismer i en sekundär skärm för att avgöra vilka aktiverar den fluorescerande transkription reporter. Den sekundära skärm består av en gräsmatta av mikrokolonier av fluorescerande transkription reporter stam, tillsammans med kontrollplattor, på vilka förmodade inducerande organismer lappat eller fläckig.
2. Sätt upp tre identiska plattor: en innehåller en microcolony gräsmatta av det fluorescerande transkription reporter stam (vid samma koncentration as användes under coculture screening), en som innehåller en microcolony gräsmatta av vildtyp moderstammen utan fluorescens reporter, och en som inte innehåller någon gräsmatta.
   1. Märk den övre delen av ryggen på varje platta för att bestämma plattorientering.
   2. Lägg positionella markörer för de patchar / fläckar, upp till tio förmodade inducerande organismer kan testas på varje uppsättning plattor (Figur 3).
   3. Tina gräsmatta alikvoter (reporter och icke-fluorescerande moderstam) som i steg 5.1.
   4. Sprid 50 pl av en 5 x 10 ⁵ cfu / ml spädning på gräsmatta plattor (eller andra optimerade utspädningar) med sterila pärlor som i steg 6.4.
   5. Låt plattorna torka.
3. Patch eller upptäcka förmodade framkallande organismer:
   1. Välj patchning om en enklare och snabbare metod är önskvärd, och det är acceptabelt att ha en mindre exakt antal celler deponerade. Patch:
      1. Tryck på en steril tandpetare till kolonin på prov - inte plocka upp alla cellerna.
      2. Patch (gör en liten strimma) på den tomma plattan.
      3. Upprepa lapp med färsk tandpetare på reporter platta.
      4. Upprepa lapp med färsk tandpetare på styrplattan.
   2. Välj spotting om en kvantitativ och reproducerbar metod önskas. Spotting gör att antalet deponerade celler som skall normaliseras (se referens 5 för fullständig information), och tillåter den relativa styrkan av de olika inducerande organismer som skall jämföras. Att upptäcka:
      1. Resuspendera putative inducerande organismer i 1 ml flytande medium i en steril plast kyvett.
      2. Ta OD ₆₀₀ av resuspensions.
      3. Med hjälp av formeln X = 250 ÷ (OD _{600 till} 0,5), till volymen X för varje resuspension till 500 l av flytande medium för att få en lösning med en OD ₆₀₀ på 0,5. Denna metod förenklar de nödvändiga pipetteringssteg när du utför flera spädningar för att normalisera OD: s eftersom du kan använda samma volym (500 l) för alla dina spädningsmedel.
      4. Ställe 1 jil av varje OD-normaliserade återsuspension till var och en av de tre plattorna.
4. Låt växa vid 24 ° C i 24-28 timmar (eller vad som är lämpligt för din reporter / analys).
5. Använd den fluorescerande dissekera mikroskop för att identifiera förmodade inducerar organismer som aktiverar din fluorescerande reporter stam men inte din föräldrakontrollstam. Dessa isolat är dina positiva hits - miljö mikrober som utsöndrar ämnen som inducerar din fenotyp av intresse.

Representative Results

Denna skärm användes för att identifiera markorganismer utsöndrar läkemedel som förändrar fysiologi B. subtilis. De resultat som beskrivs här att inriktas på matrisen producerande celltyp för B. subtilis, som producerar proteinet och exopolysackarid som krävs för robust biofilmbildande i denna bakterie. Vi valda promotorn för TAPA-sipW-tasa operonet för vår fluorescerande reporterkonstruktionen (P _TAPA-YFP). Denna operon kodar för proteinet strukturell komponent av matrisen och uppregleras under biofilmen matrisproduktion ^23. Vår matris reporter (Figur 1) konstruerades såsom beskrivits tidigare ^19.

Tidigare arbete har visat att B. subtilis producerar matris som svar på den egenproducerade quorum-sensing-liknande molekyl surfaktin, liksom renade metaboliter som produceras av andra jordbakterier ^20. Vi var intresserade av att expandera dense-studier för att undersöka mer allmänt som jordmikrober gör metaboliter förmåga att inducera matrisproduktion i B. subtilis. Vi valde att använda utspädd LB för tillväxt, eftersom detta medium redan var känd för att leda till dålig matrisproduktion ^20, ger oss en tillväxt tillstånd där vår reporter stam var icke-fluorescerande. Vi optimerade då antalet kolonier som är lämpliga för screening under dessa tillväxtbetingelser. För att optimera varje skärmplåt, är det nödvändigt att bestämma hur många kolonier växer från de frusna jord och reporter alikvoter och vilken lämplig koncentration av kolonier och näringsförhållanden är. Helst vill vi att varje coculture platta för att innehålla motsvarande antal jord-och reporter kolonier (dvs. förhållandet 1:1 av reporter: jord) och vara nära avstånd, enskilda kolonier. Denna hög andel reporter kolonier ökar sannolikheten för att en inducerare aktiverar flera omgivande reporter kolonier. Att ha flera acmotiverade inducerare kolonier kring en förmodad inducerare koloni ökar förtroendet precisera själva inducerande organismen (Figur 2). Näringsinnehållet styr omfattningen av tillväxten / kolonibildning, medan spädning av inokulat bestämmer huruvida de resulterande kolonierna på lämpligt dispergerade. På en standard 10 cm diameter Petri platta med låg näringsmedium, fann vi att ca 25.000 kolonier totalt per platta (50 pl av en 5 x 10 ⁵ cfu / ml spädning) som den bästa separationen av B. subtilis kolonier på 0,1 x LB MOPS medium (Figur 4).

Även om den beräknade cfu / ml från seriespädningarna ger en ungefärlig koncentration av bakterier i alikvoter, är det nödvändigt att säkerställa att koncentrationen av de resulterande kolonierna är lämpligt när en hel platta sprids med celler. Den beräknade cfu / platta och faktisk cfu / platta är inte alltid identiska (figur 4

Efter framställning av alikvoter av reportern och jord, blandas vi dem på samodling silplåtar och undersökt dem med avseende på fluorescens med användning av ett stereoskop (Figur 5). Vi klädd också kontroller som bara var ympade med antingen jord eller B. subtilis P _TAPA-YFP reporter stam. B. subtilis producerar biofilm matris (fluorescens) som svar på ett stort antal mikrober från jorden som ses av de fluorescerande kolonier i coculture bilden i Figur 5. För de jordar som vi granskade, hade vi en hög träff priser för P _TAPA-YFP reporter. Som beskrivs i referens 5, mellan 12 till 67% av isolaten (från sex olika jordprover) hade förmågan att induce fluorescens i P _TAPA-YFP reporter stam. Detta står i kontrast till våra opublicerade resultat från analoga skärmar använder sporbildningen (P _SSPB-YFP) och kompetens (P _comG-YFP) reportrar. Efter omfattande screening (> 200.000 kolonier för varje reporter), var bara två organismer identifierat att framkalla sporuleringen, medan ingen identifierades som inducerar kompetens. Således är träffsäkerhet för olika celltyper vara mycket varierande och kan vara svåra att förutsäga i förväg.

Vi valde då enskilda förmodade inducerande kolonier. Kolonierna på coculture silplåtar är ganska små på den låga näringsmediet som vi rekommenderar (submillimeter diameter). Icke desto mindre är det möjligt att noggrant välja och isolera mycket små kolonier för hand (Fig. 6) inifrån en komplicerad samodling silplåt. Den manuella metoden som vi använder är enkel och kräver varken specialverktyg eller flamma sterilisering. Dessa förmodade inducerare kolonier sedan restruck till isolering. Eftersom coculture plattorna trängs med kolonier, är det inte ovanligt - även med mycket noggrann plockning teknik - för att ha mer än en organism växer från varje förmodad inducerare prov. Noggrann undersökning bör tillåta isolering av morfologiskt distinkta kolonier. Alla förmodade inducerande organismer testas sedan i en sekundär skärm. Positiva och negativa resultat från både lappen och fläcken metod visas i figur 3. Med tanke på deras tät tillväxt, vår förmåga att fysiskt samla förmå kolonier från samodling plattorna var ganska bra, med ungefär 50% av de undersökta i vår sekundära skärm vara sant positiva kolonier. Ytterligare resultat från denna skärm samt uppföljning fram ur det varit tidigare beskrivits ^5.

/ Ftp_upload/50863/50863fig1.jpg "/>
Figur 1. Fluorescerande transkriptionsreporterkonstruktion. Det blå oval består av en bakteriecell och den streckade linjen representerar dess kromosom. Detta exempel visar en fluorescerande transkriptions reporter för produktion av matrisen. Den nativa locuset förblir intakt (P _{matris-matris,} där "P" och pilen indikerar promotorregionen), medan reporterkonstruktionen (P _matris-YFP) är införd på andra ställen i kromosomen i en neutral locus.

Figur 2. Idealiserade exempel på coculture screeningresultat med olika förhållanden av reportern: miljö mikrober. A) Med hjälp av en låg reporter: miljö mikrob förhållande leder till mer tvetydighet identifiera förmodade inducerande organismer än när B) En hög reporter: miljö mikrob förhållande används. De bruna cirklarna representerar jordlevande organismer, de röda cirklarna representerar inducerar jordlevande organismer, de blå cirklarna representerar oinducerade reporter kolonier, och de gröna kolonier representerar inducerade reporter kolonier. De streckade röda linjerna indikerar åtgärden radie av det inducerande metaboliten. Stjärnor indikerar icke-fluorescerande kolonier som - baserat på deras närhet till de fluorescerande kolonierna - är förmodade inducerande organismer och bör plockas och testas på nytt i den sekundära skärmen.

Figur 3. Sekundär skärm. A och B) Schema för hur du distribuerar patchas eller fläckig isolat på sekundära silplåtarna, respektive, för B. subtilis matris reporter. Mer generösa avstånd kan krävas för andra reportrar eller inducerande isolat, depslutade på diffunderbarhet av deras aktiva metaboliter. C och D) Representativa resultat från lappade jord isolat som är negativa och positiva, respektive, för att förmå B. subtilis P _{TAPA-YFP-reporter.} Sammanfattning paneler är brightfield bilder; lägre panelerna är de fluorescensbilder. Skala bar är 1 mm. E) Negativa och positiva resultat från fläckig jord isolerar för samma reporter. Skala bar är 2 mm.

Figur 4. Fastställande av microcolony koncentration. Fördelningen och storleken på dina kolonier beror både på näringsämnen och cellkoncentrationer. A) Skillnader i tillväxt av B. subtilis på 0.01x LB (övre raden) kontra 0.08x LB (nedre raden). Celler på 0.01x LB bildar inte in mikrokolonier, medan tslang på 0.08x LB gör. (Notera att för våra skärmar vi ökat näringsnivåerna något från de som visas här:. Från 0.08x LB till 0,1 x LB) Dessa bilder är från 1 pl fläckar av sekventiella 1:05 späd vid känd cfu / ml. Extrapolera från dessa koncentrationer, för att få liknande fördelningar av kolonier över en 10 cm Petri platta skulle kräva plätering (från vänster): 3,200,000, 640.000, och 128.000 cfu totalt per platta. Emellertid observation leder till ojämn fördelning av celler (de är koncentrerade på den plats kanterna) jämfört med att sprida celler över hela plattan. Således, när ett näringskoncentration väljs är det viktigt att undersöka plattor sprids med olika koncentrationer. Skala bar är 0,1 mm B) Dessa paneler visar resultaten av spridning (från vänster) 50.000,. 25.000, och 5000 totalt cfu per platta på 0.08x LB-plattor. Från dessa bilder, valde vi 25.000 som vårt mål antal cfu / platta. Skala bar är 0,1 mm.

Figur 5. Coculture av B. subtilis P _TAPA-YFP blandat med jordlevande organismer. Overlay av bright och fluorescens bild från en coculture skärmplatta innehåller B. subtilis P _TAPA-YFP matris reporter blandat med markorganismer. Arrowhead indikerar förmodade inducerare omgiven av fluorescens reporter mikrokolonier. Skala bar är 1 mm.

Figur 6. Demonstration av möjligheten att isolera små kolonier från coculture plattor. A och B) Dessa paneler visar två synfält agarplattor innehållande komplexa mikrobiella samhällen från jord. Kolonier så små som 0,1 mm kan isoleras med hjälp av plock beskrivna teknikenhär. Topp paneler är synfältet innan koloni plockning, och bottenpanelen är samma synfält efter koloni plockning. Röda pilar visar var celler har avlägsnats.

Discussion

En av de inneboende begränsningarna i detta protokoll är att det bygger på cultivability av mikrobiella organismer. Såsom är väl dokumenterade ^24, mest mikrobiellt liv på planeten kan inte (ännu) inte odlas under odlingsbetingelserna utforskas hittills. Således kommer ett stort antal interaktioner mellan mikrobiella arter som förekommer i naturliga inställningar inte upptäcks med hjälp av denna metod. Men eftersom vår önskan är att inte bara identifiera förekomsten av sådana interaktioner, men också studera mekanismer och molekyler som är inblandade i att medla dem, är förmågan att odla dessa mikrober en nödvändighet. Även inom odlingsbara arter, har detta område varit dåligt utforskade, vilket gör den metod som beskrivs här ett värdefullt bidrag som en metod för att identifiera kemiskt medierade interaktioner mellan mikrober. Dessutom, även om detta protokoll har optimerats för att screena för matris-induktion av Bacillus subtilis, kan den teoretiskt appliceras på eny transkriptions fluorescerande reporter i andra bakteriearter.

En annan relaterad begränsning med denna metod är att den här skärmen (per definition) kräver coculture. I naturliga miljöer, kan mikrober med olika tillväxttakt fortfarande samexistera i rumslig närhet samtidigt utnyttja olika miljö nischer. Sådana mikrobiella interaktioner skulle gå oupptäckt av vår coculture skärm, men som bara kommer att tillåta tillväxt av miljö mikrober med näringskrav och tillväxttakten liknar de reporter arter. Ändringar som skulle separera tillväxten av de potentiella inducerande organismer från tillväxten av reportern stammen är säkert möjligt. Vi räknar också att hyftillväxt av svampar - vanliga i jord - kan orsaka svårigheter i co-kultur-skärmen. Även den korta tidsramen för vår skärm med B. subtilis innebar att några svampar upptäcktes, lägga svampdödande föreningar till tillväxtmediet kunde minimize denna oro.

Förmågan att välja en lämplig fenotyp och genen för den fluorescerande reporterkonstruktion bör inte vara svårt, med tanke på den stora mängd av sekvensering och transkriptionella data antingen redan är tillgängliga eller lätt kan erhållas för många bakteriearter. Det är dock en svårighet med det tillvägagångssätt som beskrivs här behovet att identifiera tillväxtbetingelser som minimerar bakgrundsfluorescens av din reporter stam, möjliggör detektion av fluorescens induktion. Identifieringen av dessa villkor måste ofta göras empiriskt, även om transkriptions uppgifter kan hjälpa den här sökningen (t.ex. av plattsättning microarraydata som finns för tillväxt av B. subtilis förhindrar identifiering av förhållanden där gener av intresse är dåligt uttryckta ^10). För vissa reportrar denna empiriska sökningen kan vara utmanande, delvis på grund av uttrycket av många bakterie fenotyper är heterogen. Med andra ord, är det ovanligt att hitta cILLKOR i vilken inga celler inom populationen uttrycker Fenotyp X. Således, beroende på det antal celler inom denna underpopulation och styrkan av genexpression, kan det vara svårt att identifiera betingelser som ger tillräckligt låg bakgrundsfluorescens att medge induktion som skall detekteras . Ett alternativ till detta empirisk sökning efter ideala screening villkor kan vara att "ställa" uttrycksnivåer av reporter använder riktad mutagenes. Genom ändring av promotorregionen och / eller det ribosomala bindningsstället för reporterkonstruktion kunde bakgrundsfluorescens nivåerna minskas. Detta skulle kunna öka nyttan av den här skärmen genom att undersökas även gener med någon konstitutiv aktivering för induktion.

När inducerande organismer har identifierats och bekräftats i en sekundär skärm, kan de fylogenetiskt identifieras genom sekvense deras 16S rRNA-genen. Det är också möjligt att kvantifiera omfattningen av fluorescens använda OD _{600-normaliserad} plats i den sekundära skärmen ^5. Detta kan ge information om vilka medlemmar av gemenskapen producerar ämnen som påverkar din reporter stam och i vilken utsträckning. Följaktligen kan detta leda till hypoteser om vilka mikrobiella interaktioner kan förekommer i naturliga miljöer och möjligheten att utforska potentialen coevolution av dessa producerar och svarar organismer. Andra framtida inriktningar inkluderar belysa strukturen av utsöndrade molekylen själv, bestämma mekanism (er) genom vilka den svarande organismen känner av denna förening, och använda den som ett kemiskt verktyg för att modulera bakterie fenotyper.

Även med de överväganden som beskrivs ovan, det förfarande som beskrivs här är ett betydande bidrag. Det undviker arbetsintensivt montering ett bibliotek av miljö mikrober, men låter deras fysiska separation och isolering med hjälp av fasta medier. Styrkan i denna coculture skärm är attdet ger en begreppsmässigt och tekniskt enkel metod för att screena genom tusentals mikrobiell art för att identifiera de som utsöndrar bioaktiva föreningar av intresse samtidigt som den är tillämplig på många bakteriella arter och fenotyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.