Summary
Diese Studie verwendet eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, deutlichen Erhöhung des Durchzellroll Studien unter physiologisch relevanten Scherströmung. Angesichts der Bedeutung der Zellvoll in der Mehrschrittzellen Homing Kaskade und die Bedeutung der Referenzzelle nach systemischer Abgabe exogener Populationen von Zellen in Patienten, bietet dieses System als Screening-Plattform zellbasierte Therapie verbessern Potential.
Abstract
Eine große Herausforderung für zellbasierte Therapie ist die Unfähigkeit, systemisch Ziel, eine große Menge von lebensfähigen Zellen mit hoher Effizienz zu Geweben von Interesse nach intravenöser oder intraarterieller Infusion. Folglich erhöht Zelle Homing wird derzeit als eine Strategie, um die Zelltherapie zu verbessern sucht. Zell Rollen auf dem vaskulären Endothel ist ein wichtiger Schritt im Prozess der Zell Homing und kann in-vitro unter Verwendung eines Parallelplattenlaufkammer (PPFC) untersucht werden. Dies ist jedoch ein extrem mühsam, niedrige Durchsatz-Assay, mit schlecht eingestellten Strömungsbedingungen. Stattdessen haben wir eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, das Studium der Zellrolleigenschaften unter genau kontrollierten, physiologisch relevanten Scherströmung 1,2 ermöglicht einen höheren Durchsatz. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie die Rolleigenschaften von HL-60 (menschliche Promyelozytenleukämie-Zellen) auf P-und E-Selectin beschichteten Oberflächen sowie auf Zellmonoschicht-beschichteten Oberflächen werden readily sucht. Um besser zu simulieren entzündlichen Bedingungen wurde die mikrofluidische Kanaloberfläche mit Endothelzellen (ECs), die dann mit Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) aktiviert wurden, signifikant erhöht Wechselwirkungen mit HL-60-Zellen unter dynamischen Bedingungen beschichtet. Die verbesserte Durchsatz und integrierter Multi-Parameter-Analyse-Software-Plattform, die eine schnelle Analyse von Parametern wie Walzgeschwindigkeiten und Rollbahn ermöglicht, sind wichtige Vorteile für die Beurteilung der Zellrollverhalten in-vitro. Die eine schnelle und genaue Analyse von technischen Konzepten, die auf Zell Walz-und Referenz auswirken, kann diese Plattform Voraus exogene zellbasierte Therapie helfen.
Introduction
Eine der großen Herausforderungen bei der erfolgreichen klinischen Übersetzung von Zell-basierten Therapie ist die ineffiziente Lieferung oder Targeting von systemisch infundiert Zellen an gewünschten Stellen 3,4. Folglich gibt es eine ständige Suche nach Ansätzen zur Zelle Homing zu verbessern, und zwar Zelle Rollen, als eine Strategie, um die Zelltherapie zu verbessern. Zellroll auf die Blutgefäße ist ein wichtiger Schritt in der Zelle Homing Kaskade, klassisch für Leukozyten, die zu Krankheit Stellen 5 rekrutiert werden, definiert. Dieser Schritt wird durch spezifische Interaktionen zwischen Endothelzellen Selektine geregelt, dh P-und E-Selektin (P-und E-sel) und ihre Gegenliganden auf der Oberfläche von Leukozyten 5,6. Ein besseres Verständnis und eine verbesserte Effizienz der Zell Homing und insbesondere der Walzschritt, sind von großer Bedeutung bei der Suche nach neuen Plattformen, um zellbasierte Therapie zu verbessern. Bisher ist dies durch die Verwendung parallel Platte Strömungskammern (PPFCs), bestehend aus zwei flachen Plattform erreichtes mit einer Dichtung dazwischen, mit einem Zulauf-und Ablauföffnung auf der oberen Platte angeordnet ist, durch welche eine Zellsuspension wird unter Verwendung einer Spritzenpumpe 7,8, 9 perfundiert. Die Oberfläche der Bodenplatte kann mit einer entsprechenden Zellmonolayer / Substrate beschichtet werden und die Interaktion zwischen Zellen durchblutet und der Oberfläche unter Scherströmung ist dann 7 erkundet. Allerdings ist PPFC ein niedriger Durchsatz, Reagenz aufwendig und ziemlich langweilig Methode, mit Blasenbildung, Leckage, und schlecht kontrollierten Fluss präsentiert große Nachteile.
Eine alternative Technik zur herkömmlichen PPFC ist ein Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, ermöglicht höhere Durchsatzleistung der zellulären Assays (bis zu 10 mal höher als PPFCs) unter genauer, computergesteuerten Scherströmung mit geringen Reagenzienverbrauch 1,10. Zellrollversuche sind in den mikrofluidischen Kanälen durchgeführt, die mit Zellmonoschichten oder gentechnisch Substrate beschichtet werden können und abgebildet using ein Mikroskop, mit Rolleigenschaften analysiert leicht mit einer geeigneten Software. In dieser Studie zeigen wir die Fähigkeiten dieser Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, indem man die Rolleigenschaften des menschlichen Promyelozyten-Leukämie (HL-60)-Zellen auf verschiedenen Oberflächen. HL-60 rollen auf Substraten wie P-und E-sel als auch auf Zellmonoschichten, die verschiedene Walz Rezeptoren analysiert. Zusätzlich Antikörper (Ab) wurde verwendet, um die Blockierung direkte Beteiligung von spezifischen Selectine bei der Vermittlung der Rollbewegung des HL-60 auf diesen Oberflächen zu demonstrieren. Roll Experimente wurden mit erhöhten Durchsatz unter stabilen Scherströmung durchgeführt wird, mit minimalen Reagenz / Zelle Verbrauch, die eine effiziente Analyse der wichtigsten Parameter wie Rollwalzgeschwindigkeit, die Anzahl der rollenden Zellen und Rollweg Eigenschaften.
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Protocol
1. Zellkultur
- Menschlichen Promyelozytenleukämie (HL-60-Zellen)
- Kultur HL-60-Zellen in 75 cm 2-Kolben mit 15 ml Iscove-modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 20% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS), 1% (v / v) L-Glutamin und 1 ergänzt % (v / v) Penicillin-Streptomycin.
- Ändern Medien alle 3 Tage durch Absaugen Hälfte der Zellsuspension Volumen und mit komplettem IMDM Medien zu ersetzen.
- Für Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFSE) Färbung Zentrifuge HL-60-Zellsuspension (400 × g, 5 min), Resuspendieren in einer 1 &mgr; M CFSE-Lösung (in vorgewärmtem PBS) und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. Dann Zentrifuge Zellen absaugen Stand und resuspendieren Zellen in frischem vorgewärmten Medium für 30 min. Waschen der Zellen in PBS und dann zum Walzversuche (siehe 1B für repräsentative Bild von CFSE-gefärbten HL-60-Zellen auf P-sel-beschichtete Oberfläche).
- Lung mikrovaskulären Endothelzellen (LMVECs)
- Mantel 100 mm Petrischalen mit 0,1% Gelatine-Lösung (v / v in PBS) und bei 37 ° C für mindestens 30 min.
- Kultur LMVECs auf mit Gelatine beschichteten 100 mm Petrischalen in völliger endothelialen Wachstumsmedium (Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)), mit einer spezifischen Wachstums Ergänzung Kit ergänzt, siehe Reagenzien). Ändern Medien jeden zweiten Tag und Sub-Kultur-Zellen bei Erreichen von 80-90% Konfluenz.
- Für Sub-Kultur, waschen Sie die Zellen mit PBS und dann lösen die Zellen mit 4 ml 1x Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° C und neutralisieren in einem gleichen Volumen von kompletten EBM-2-Medien. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen und SchleuderE (400 × g, 5 min). Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml komplette Medien-und Endothelzellen zählen Zellen mit einer Zählkammer. Nicht über-Durchgang der Zellen, da dies Auswirkungen auf ihre Morphologie und Funktion-Nutzung nur Zellen unter Kanal 7 für alle Experimente.
- Chinese Hamster Ovary-P-Selectin (CHO-P) Zellen
- CHO-P-Zellen, die stabil transfizierten CHO-Zellen der menschlichen P-sel auszudrücken sind, wurden von Mitarbeitern (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) 11,12 vorgesehen.
- Kultur CHO-P-Zellen in T175-cm 2-Kolben in 25 ml F-12-Medium.
- Zur Passagierung waschen Zellen mit 10 ml PBS für 4-5 sec und dann in 10 ml 1 × Trypsin-EDTA trypsinize für 3 min bei 37 ° C, gefolgt von Neutralisation in Vollmedien.
- Centrifuge die Zellsuspension (400 × g, 5 min), vorsichtig den Überstand aspirieren, Zellpellet in 1 ml Voll Medien und zählen Sie die Zellen miteine Zählkammer.
2. Der Betrieb der integrierten Multi-Well-Platte mikrofluidischen System
- Achten Sie darauf, alle Geräte richtig angeschlossen ist, und schalten Sie die verschiedenen Module: Computer, Controller, invertierten Mikroskop und CCD-Kamera.
- Öffnen Sie die Imaging-Software, stellen Sie sicher, dass der Multi-Well-Platte-Modul und das Abbildungsmodul richtig auf dem Bildschirm dargestellt.
- Verbinden Sie die Rohre der Dampffalle (an den Controller angeschlossen), und schließen Sie sie auch auf die Druckschnittstelle.
- Legen Sie die Multi-Well-Platte in der Plattenheizung /-Adapter. Hinzufügen Reagenzien in die Vertiefungen (unten beschrieben) und legen Schnittstelle auf der Oberseite der Platte. Zeigen Platte für die Bildgebung auf automatisierten Bühne.
- Die Schnittstelle wird an der Oberseite der Platte und wendet einen pneumatischen Druck von der Steuerung an der Oberseite der Vertiefungen, die Antriebsfluid durch die Mikrofluidkanäle mit der festgelegten Durchflussrate leicht gesteuert unter Verwendung der Multi-Well-PlatteModul-Bildschirm unter Handbetrieb.
- Reagenzien in der Kanalströmung über einem Beobachtungsraum, zwischen den Brunnen entfernt. Mikrofluidik-Kanal Abmessungen sind 350 um breit x 70 um groß. Die Länge des linearen Kanals beträgt 1 mm und der Boden der Kanäle weist eine 180 um Deckglas, das mit Hellfeld, Phasen, Fluoreszenz-und konfokale Mikroskopie kompatibel ist.
- Erwerben Sie Videos mit einer CCD-Kamera (Strom Erwerb, 11 Bilder / s) und über kompatible Software zu analysieren.
3. Beschichtung von Mikrofluidik-Kanäle mit einem Protein-Substrat oder eine Zellschicht
- Die Beschichtung mikrofluidischen Kanal mit Fibronektin oder P-/E-selectin
- Herstellung von 1 ml von 20 ug / ml Fibronektin-Lösung in PBS. Volumen ändern, basierend auf der Anzahl von Kanälen zu beschichtende (25-50 verwenden ul Fibronectin pro Kanal).
- In 25-50 ul von Fibronektin-Lösung zu jeder Eintritts gut. Bewerben Scherkraft von 2 dyn / cm 2für 5 Minuten, um den Kanal zu durchströmen. Bitte beachten Sie die Perle der Flüssigkeit, die in der Steckdose auch. Inkubation für 30-45 min bei RT
- Saugen Sie die Lösung aus Brunnen (nicht direkt aus dem Mittelkreis, die den Kanal speist nicht absaugen) 1,13. In 200 bis 500 ul PBS in die Steckdose und gut waschen Kanal mit PBS, indem Scherströmung von 2 dyn / cm 2 für 5 min. Der Kanal wird nun korrekt mit Fibronektin und einsatzbereit beschichtet.
- Zur Beschichtung mit P-oder E-sel, bereiten eine 5 ug / ml Lösung des gewünschten humanen rekombinanten Protein in PBS, und die Mantel-Kanäle, wie oben bei 37 ° C beschrieben, wobei 1 h Inkubation, um die Oberflächenbeschichtung zu ermöglichen.
- Erstellung von CHO-P oder LMVEC Monoschicht innerhalb der mikrofluidischen Kanal
- Sanft trypsinize Zellen aus den Kulturschalen für 3 min, löschen mit einem 2-fachen Volumen der Voll Medien und Zentrifuge (5 min bei 400 x g). Die Zellen mit 10 ml Voll Medien und Zentrifuge (5 min bei 400 x g) again.
- Zählen der Zellen, um die Zellkonzentration in der Suspension zu bestimmen. Um die Bildung einer konfluenten Monoschicht LMVEC innerhalb des Kanals sicherstellen, einen Zellkonzentration auf 15-20 Millionen Zellen / ml. Für einen konfluenten CHO-P Zellschicht, verwenden Sie 50-60000000 Zellen / ml. Verwenden 25-50 ul Zellsuspension für jeden Kanal - bestimmen Anfangszellzahl für das Experiment entsprechend verwendet.
- In 25-50 ul der Zellsuspension in der entsprechenden Konzentration an den Einlass auch. Legen Sie die Platte auf dem Mikroskoptisch und Zellen einzuführen in den Kanal (2 dyn / cm 2), bis die Zellen werden auf dem Bildschirm füllt den gesamten Kanäle beobachtet und dann den Fluss zu stoppen.
- Füllen Sie beide Auslass-und Einlass mit 200 ul entweder voll oder CHO LMVEC Medien. Lassen Sie die Zellen absetzen und sich für 3 Stunden in den Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
- Nach 3 Stunden Inkubation, waschen Sie den Kanal mit Vollmedien (2 dyn / cm 2, 10-15 min) zu entfernen ungebundenZellen. Zellen sollte nun erscheinen vollständig konfluenten und der Kanal ist jetzt einsatzbereit. Je nach Anfangszellaussaatdichte, können zusätzliche 2-3 Stunden Absetzzeit erforderlich sein, um eine vollständige Bedeckung der Oberfläche mit den Zellen zu gewährleisten.
4. LMVEC Pro-inflammatorische Aktivierung und Blockierung der Antikörper P-/E-selectin
- Bereiten Sie eine TNF-α-Lösung (10 ng / ml) in LMVEC Grundmedien.
- Entzündliche Aktivierung LMVEC in den Kanälen zu induzieren, werden 100 &mgr; l der TNF-α-Lösung zu dem Einlaß und auch die Lösung in den Kanal einzuführen, indem Scherströmung von 2 dyn / cm 2 für 5 min. Für Steuerkanäle (nicht aktivierten ECs), 100 l LMVEC Grundmedien mit dem Einlass gut und in den Kanal (2 dyn / cm 2, 5 min) einzuführen. Channel ist nun bereit für ein Walztest.
- Um P-sel und E-sel auf LMVECs und CHO-P-Zellen zu blockieren, führen zu neutralisieren P-sel (Klon AK4, 5 pg / ml in basal Medien) oder E-sel (Klon P2H3, 5 ug / ml in Basalmedium)-Antikörper in den Kanal und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Weiter, Waschkanälen mit Basalmedium (2 dyn / cm 2 für 5 min). Kanäle sind nun bereit für ein Walztest.
5. HL-60-Rollen-Assay auf Substrat / Zellmonolayer-Coated mikrofluidischen Kanälen
- Sorgfältig die Kanäle unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Kanäle richtig beschichtet (im Fall der Beschichtung mit Zellen sollten bei einer vollständig konfluenten Zellmonoschicht beobachtet werden.)
- Um HL-60-Zellsuspension für die Rollversuche, Zentrifuge HL-60-Zellsuspension (5 min bei 400 x g) vorbereiten und einmal mit Grundmedien waschen. Zählen der Zellen und Resuspension in IMDM (Grundmedium, enthaltend Ca 2 + und Mg 2 +), um eine HL-60-Zellsuspension mit 5 Millionen Zellen / ml zu erstellen. Verwenden 25-50 ul Zellsuspension für jeden Kanal, den Rolltest durchzuführen.
- In 25-50 ul der Zell UntBrnsion, um gut in der temperaturgesteuerten Halteplatte (37 ° C) und auf den Mikroskoptisch Entnahmestelle, Ort Platte. Nächstes vorstellen Zellen in den Kanal, indem Scherkraft von 2 dyn / cm 2 (Zellen sollten innerhalb von 10-15 sec aus der Steckdose zum Einlass fließt beachten).
- Um die Roll Reaktion als Funktion der Scherbeanspruchung zu untersuchen, reduzieren Scher bis 0,25 dyn / cm 2 und in jeder gewünschten Scher erwerben 20-30 sec-Videos (mit Hilfe der Funktion "Strom Erwerb") (Scher erhöhen allmählich von 0,25 bis 5 dyn / cm 2. Es ist auch möglich, höhere Schere verwenden).
- Erwerben Sie Videos mit einer CCD-Kamera (Strom Erwerb, 11 Frames / s) und zu analysieren, Rollwege und Rollgeschwindigkeiten über kompatible Software.
6. Durchflusszytometrie zur Expression von Oberflächenmolekülen erkennen
- Nach Trypsinierung, bereiten eine Zellsuspension (mit 1-2 x 10 5 Zellen / Probe) des gewünschten Zelltyp (HL-60, CHO-P oder LMVECs) in PBS (- / -), mit 2% FBS. Waschen der Zellen zweimal und bringen Probenvolumen 50 ul (unter Verwendung des gleichen Puffers).
- Inkubation jeder Probe mit dem gewünschten fluorophorkonjugierten Ab (siehe beigefügte Tabelle für detaillierte Informationen) bei 4 ° C für 20 min (mit Alufolie abdecken).
- Waschen Sie die Zellen (gleichen Puffer) und bringen endgültige Volumen von gefärbten Zellsuspension zu 200 ul. Analyse Proben unter Verwendung eines Durchflusszytometers, um die Expression von Oberflächenmolekülen zu detektieren.
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Representative Results
HL-60-Zellen rollen auf P-und E-Selektin-Oberflächen, aber nicht auf Fibronektin
HL-60-Zellen gelten als Goldstandard "Rollen", wie sie eine Vielzahl von Homing-Liganden, einschließlich der rollenden Liganden P-Glykoprotein-sel-Liganden-1 (PSGL-1) und Sialyl-Lewis-X (SLeX) 5,14 (Abbildung 1A ausdrücken ). Die Oberflächenprotein PSGL-1 wirkt als ein Gerüst für das Tetrasaccharid SLeX, Vermittlung spezifische Wechselwirkung mit P-und E-sel, der auf dem Endothel während der Entzündung 5,6,15 hochreguliert sind. Um die Fähigkeiten des Multi-Well-Platte mikrofluidische System zu testen, wurden zahlreiche mikrofluidischen Kanälen gleichzeitig mit verschiedenen Substraten und Walz Wechselwirkungen von HL-60-Zellen, die mit diesen Oberflächen beschichtet wurden analysiert. HL-60-Zellen zeigten eine robuste Rollverhalten auf P-sel-beschichtete Oberfläche, die mit Zellen aus ersten Strömungs erfasst, gefolgt von einem deutlichen Rollbewegung. Wie in 1C gezeigt ist, und ausHNO mit der Literatur, HL-60-Zellen eine ähnliche Rollverhalten auf E-sel Flächen noch nicht auf Fibronektin-beschichteten Substrate 14,16-19. Zellgeschwindigkeit über kompatible Software analysiert wurde, wurde gegen Schubspannung aufgetragen, die eine robuste Roll Reaktion von Zellen auf P-und E-sel mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit zwischen 1-12 um / sec.
HL-60-Zellen rollen auf CHO-P Monolayer Beschichtung der mikrofluidischen Kanal
Als nächstes wollten wir die Möglichkeit der Verwendung dieser Mikrofluidsystem effizient testen Wechselwirkungen zwischen Zellen von Interesse und einer Zellmonoschicht die Oberfläche zu beurteilen. Um die Wechselwirkung von HL-60-Zellen mit einer Zellmonoschicht, die den Roll Marker exprimiert erkunden, haben wir CHO-P-Zellen, die transfiziert sind, um stabil exprimieren P-, jedoch nicht E-, SEL (Fig. 2A. Siehe auch Fig. 2B für repräsentative Bild von HL-60 Zellen auf der CHO-P-Monoschicht Beschichten des Mikrofluidkanals) 11,12. HL-60-Zellen zeigten eine starke Reaktion auf Roll CHO-P-Zellen (Fig. 2C). Um zu testen, ob diese Rollbewegung wird in der Tat von P-SEL vermittelt wurde der CHO-P-Monoschicht mit blockierenden Antikörpern vorinkubiert für entweder P-oder E-sel vor Perfusion von HL-60-Zellen in den Kanal. Wie in 2C gezeigt, die Blockierung der CHO-P-Monoschicht mit einem P-sel Ab führte zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl von Roll HL-60-Zellen auf der Oberfläche, die zeigen, dass P-sel tatsächlich vermittelt HL-60-Walzen, wie zuvor beschrieben 14,18. Durchführung des Tests in einer Mikrofluidkanal ermöglicht ein schnelles Screening von verschiedenen Bedingungen und effiziente Blockierung der Rezeptoren unter Verwendung von nur geringen Mengen, so wenig wie 25 ul. Isotypkontrollreagenzien oder Ab Blockierung E-sel (die nicht auf CHO-Zellen exprimiert wird P) hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der rollenden Zellen auf CHO-P-Zellen, was die Stärke dieses Tests in genau Stift weis die direkte Beteiligung von spezifischen surfacE Marker der zellulären Interaktionen Roll.
Walzen von HL-60-Zellen auf die TNF-a-aktivierten LMVECs durch E-Selectin-vermittelte
Endothelzellen werden bis zu regulieren Haftung Oberflächenmarker, wie P-und E-sel bekannt, während der Entzündung, die Unterstützung bei der Rekrutierung von Leukozyten zu Entzündungsherden 5,6. Während jedoch murinen Endothelzellen exprimieren sowohl P-und E-sel in Antwort auf entzündliche Reize wie Interleukin-1 (IL-1) und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), menschliche Endothelzellen nur E-sel auszudrücken als Reaktion auf diese Zytokine 20,21. Dies hat sich in der Durchflusszytometrie-Assay bestätigt, die die Expression von E-sel, aber nicht P-sel, Lungenmikrovaskuläre Endothelzellen (LMVEC) als Reaktion auf TNF-α-Stimulation (Fig. 3A),. Die Multi-Well-Mikrofluid-Platte besteht aus zahlreichen Einzel mikrofluidischen Kanälen, so dass höhere Durchsatzprüfung von mehreren verschiedenen Bedingungen. Wir haben dieses vorteilhafte Gestaltungum LMVECs innerhalb der mikrofluidischen Kanälen (3B) zur schnellen Analyse der Interaktionen von HL-60-Zellen mit ECs unter mehreren Bedingungen zu plattieren. Entzündliche Einstellungen zu simulieren, wurden LMVECs mit proinflammatorischen Zytokins TNF-α vorbehandelt. Interessant ist, dass HL-60-Zellen, die nicht mit nicht-aktivierten LMVECs interagieren, und die Zellen wurden nicht beobachtet, um auf dieser Fläche rollt. Im Gegenteil angezeigt HL-60-Zellen eine starke Rollverhalten auf TNF-α-aktivierte LMVECs, mit Durchschnittsgeschwindigkeit von 5-15 um / sec (Fig. 3C).
Dann richtet die Beteiligung von P-sel-oder E-sel in der Walz Wechselwirkung zwischen den HL-60-Zellen und aktivierten LMVECs erkunden. Hierzu wurden die TNF-α-aktivierte ECs mit P-sel-oder E-sel-blockierende Antikörper vorinkubiert, und das Rollen der HL-60-Zellen wurde analysiert. Wie in 4A gezeigt, die Blockierung E-SEL, die auf TNF-α-aktivierte LMVECs hochreguliert war, führte zu einem significant Rückgang in der Anzahl der Zellen auf der Roll aktivierten Endothelzellen Monoschicht. Im Gegensatz dazu unter Verwendung eines Isotyp-Kontrolle oder eine Ak gegen P-sel, der nicht auf der aktivierten Endothelzellen exprimiert wurde, hatte keine signifikante Wirkung auf die HL-60 rollen auf dem aktivierten Endothel. Diese Daten zeigen die direkte Einbindung der E-sel in HL-60-Rollen auf TNF-α-aktivierten ECs, im Einklang mit früheren Berichten 20,21. Aus den erfassten Videos, gestattet einem die Analysesoftware, die Pfade von einzelnen Zellen in Wechselwirkung mit dem Substrat zu verfolgen. Wir haben diese Fähigkeit gezielt verfolgen den Weg einzelner Zellen, die mit TNF-α-aktivierten ECs mit / ohne E-sel Sperrinteragiert. Wie in 4B gezeigt, war die Anzahl der Rollen auf nicht blockierte Zellen aktiviert LMVECs signifikant höher als bei E-sel-aktivierten Endothelzellen blockiert. Ferner zeigte sich, dass die Rollbewegung der HL-60 blockierte LMVECs kontinuierlich und stabil, während die Rollbahnen der Zellenauf E-sel-ECs blockiert wurde fragmentiert (jede Farbe steht für eine andere Zelle, siehe zum Beispiel Zellen af vs gl in Abbildung 4B). In Konsistenz mit dieser Feststellung, die Rollgeschwindigkeit der HL-60-Zellen, die auf TNF-α freigegeben aktivierten ECs war signifikant niedriger als die Rollgeschwindigkeit auf E-sel-ECs blockiert (4C).
Fig. 1 ist. HL-60-Zellen rollen P-und E-Selectin beschichtete Oberflächen. (A) HL-60-Zellen exprimieren die rollenden Liganden PSGL-1 und SLeX (Iso ctr - Isotyp-Kontrolle, keine Ab - keine Antikörper). (B) Vertreter Momentaufnahme Bild von CFSE-gefärbten HL-60-Zellen auf P-sel unter Fluss beschichtete Oberfläche. (C) HL-60-Zellen kräftig rollen P-und E-sel-beschichteten Oberflächen, aber nicht auf Fibronectin-beschichtete Oberfläche. Rollgeschwindigkeit gegen Scherbeanspruchung 10-1 aufgetragen (n =5 Zellen pro Datenpunkt wurden Geschwindigkeiten von kompatibler Software analysiert). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
2. HL-60 rollen auf CHO-P-Zellmonoschicht wird direkt vom P-sel vermittelt. (A) CHO-P-Zellen exprimieren P-sel, jedoch nicht E-sel. (B) Repräsentatives Bild von HL-60 Zellen auf der CHO-P-Monoschicht die Oberfläche des Mikrofluidkanals (10-fache Vergrößerung). (C) HL -60 Zell Rollen auf CHO-P-Monoschicht wird direkt vom P-sel vermittelt durch Ab Blockierungstest (entsperrt gezeigt - CHO-P-Monoschicht wurde mit einem Antikörper-Isotyp CTR-CHO-P-Monoschicht mit einer Isotyp-Kontrolle inkubiert; * p <0,05, one-way ANOVA mit Tukey HSD Post-hoc-Test verwendet, stellen die FehlerbalkenSEM, n = 3 ist.
3. HL-60-Zellen rollen auf die TNF-α-LMVECs aktiviert. (A) TNF-α-Aktivierung von LMVECs induzieren Oberflächenexpression von E-sel, aber nicht P-sel. (B) Repräsentatives Bild konfluenten Monoschicht in LMVEC zwei mikrofluidische Kanäle (4-fache Vergrößerung). (C) HL-60 Zellen zeigen eine robuste Roll Antwort auf die TNF-α-LMVECs aktiviert, aber nicht auf un-LMVECs aktiviert. Iso ctr - Isotypenkontrolle, unact ECs - nicht aktivierten Endothelzellen, die TNF-α-act ECs -. TNF-α-aktivierten Endothelzellen Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
< br /> Abbildung 4. HL-60 rollen auf TNF-α-aktivierte LMVECs durch E-Selectin vermittelt wird. (A) HL-60 rollen auf TNF-α-aktivierte LMVECs durch E-sel vermittelt, anstatt P-sel, wie durch Ab Blockierung demonstrierte Test (Isotyp ctr-EG-Monolayer mit einer Isotyp-Kontrolle inkubiert; * p <0,05, one-way ANOVA mit Tukey HSD Post-hoc-Test verwendet, Fehlerbalken stellen SEM, n = 3) (B) Zellpfad-Analyse zeigt kontinuierlich. und robuste Rollen von HL-60-Zellen, die auf blockierte aktiviert ECs Vergleich zu fragmentiert, auf E-sel-ECs blockiert aktiviert beobachtet schwachen Roll (jede Farbe steht für eine andere Zelle. Analyse wurde mittels geeigneter Software durchgeführt). (C) HL-60-Roll Geschwindigkeit auf die TNF-α-aktivierten ECs ist langsamer freigegeben aktiviert ECs im Vergleich zu E-sel-blockierten aktiviert ECs (Schubspannung verwendet:. 2 dyn / cm 2 * p <0,05, ungepaarten zweiseitigen t-Test, Fehlerbalken stellen SEM, n = 17 bis 36 Zellen pro Gruppe).www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
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Discussion
Eine der großen Herausforderungen in der erfolgreichen Übersetzung von exogenen zellbasierte Therapie ist die Unfähigkeit, effizient liefern Zellen zu Websites von Verletzungen und Entzündungen, die mit hoher Effizienz engraftment 3. Zellroll stellt einen entscheidenden Schritt in den Prozess der Zell Homing, die Erleichterung der Verzögerung der Zellen an den Wänden der Blutgefäße, was schließlich zu ihrem festen Adhäsion und Trans durch das Endothel in das Gewebe 5 führt. Besseres Verständnis des Walzprozesses für die Kandidatenzelltypen kann zur Entwicklung von Techniken führen zu Zell Homing verbessern und tragen wesentlich zur Verbesserung der Zell-basierten Therapie.
PPFC ist ein weit verbreitetes Werkzeug zur Zellroll sowie anderen Zellverhalten unter Scherströmung zu erkunden. Die Anwendung für die Prüfung PPFC Adhäsion von Neutrophilen an das Endothel wurde von Lawrence et al. Im Jahre 1987, und seitdem kommerziell erhältlichen Produktionsts entwickelt worden, 8,9. PPFCs bestehen aus zwei flachen Platten durch eine Dichtung, die die Abmessungen der Kammer 7 steuert getrennt. Die obere Platte enthält ein Zulauf-und Auslauföffnung, die durch die Verwendung einer Spritzenpumpe ermöglicht die Perfusion der Zellsuspension durch die Kammer 7,8. Es gibt auch eine zusätzliche Öffnung, die Unterdruck (Vakuum), um die Platten zu halten gilt zusammengepreßt 7. Obwohl Parallelplattenströmungskammern tatsächlich genutzt wurden, um zelluläre Reaktionen, einschließlich Zell Rollen, unter Scherströmung Bedingungen zu untersuchen, gibt es zahlreiche Einschränkungen, die ihre Wirksamkeit reduzieren. Eine wesentliche Einschränkung der Strömungskammern ist die hohe Anzahl von Zellen und große Mengen an Reagenzien, die aufgrund der großen Totvolumen in dem Strömungssystem 7 erforderlich sind. Ein weiterer kritischer Punkt ist das Vorhandensein von Luftblasen, die während der Durchflusskammer Montage leicht entstehen können, möglicherweise behindern die Zellschicht und dem SubstratBeschichtung auf der Bodenplatte 22. Jedoch sind weitere Modifikationen zu herkömmlichen PPCFs gemacht worden, um einen zusätzlichen Port an der oberen Platte als eine Blasenfalle wirken, um die Entfernung von Luftblasen 23 zu erleichtern nehmen. Einrichten des PPFC Experiment ist auch mühsam, und die Durchflusszelle ist anfällig für Leckage, wenn die Dichtung beschädigt wird oder nicht sorgfältig zusammengebaut. Schließlich gibt es einen Unterschied zwischen den gewünschten und experimentell angewendet Scherraten, die in einem engen Bereich der einheitlichen Strömungsraten führt. Vergleichen von theoretisch vier PPFCs mit unterschiedlichen Eintritts-und Austrittspositionen, wurde gefunden, dass zwei der Konfigurationen modelliert Scherraten, die aus den berechneten Scherraten um bis zu 75% und 24 abweicht. Um die gleiche Kammer Wiederverwendung erfordert zeitaufwendige Wasch-Schritten, in Kombination mit den oben beschriebenen Herausforderungen, macht dies die PPFCs ziemlich mühsam und geringem Durchsatz.
In unserer Studie haben wir eine voll integrierte Multi-Well-pEnde mikrofluidischen System, die sich auf genau kontrolliert Scherströmung 1,2,13. Dieser 48-Loch-Platte umfasst 24 mikrofluidischen mikrofluidischen Kanälen, mit jeweils zwei benachbarten Vertiefungen, die mit einem mikrofluidischen Kanal 1,25 verbunden. 10-12 Walz Assays können in 1 Stunde durchgeführt werden, was ein schnelles Screening von mehreren Dutzend Bedingungen in einem einzigen Tag. Die mikrofluidischen Kanäle können mit einem Proteinsubstrat oder Zellmonoschichten beschichtet werden, und die Wechselwirkung zwischen Zellen von Interesse, und die Oberfläche kann mit einem Mikroskop mit einer CCD-Kamera erfasst und durch kompatible Software analysiert abgebildet werden. Wichtige Parameter wie Zell Quantifizierung, Berechnung der Walzgeschwindigkeit und bestimmte Spur Pfadanalyse leicht erhalten werden kann, um Rollverhalten effizient analysieren auf mehreren Substraten 13. In dieser Studie untersuchten wir die Effizienz dieses Systems bei der Untersuchung von Zellroll mit HL-60 Promyelozyten-Leukämie-Zelllinie, gut etabliert "Rollen"-Taste, die zum Ausdruck bringenRollliganden, wie PSGL-1 und SLeX, die zusammen als Gegenliganden für P-und E-sel 15,26 wirken. In Korrelation mit früheren Berichten, HL60-Zellen in der Tat zeigte eine robuste Rollverhalten auf P-und E-sel-beschichteten mikrofluidischen Kanälen, mit langsamen Rollgeschwindigkeiten von 1-12 um / s 14,17-19. HL-60-Zellen nicht auf Fibronektin-Oberfläche rollen, im Einklang mit früheren Berichten, die zeigen, dass undifferenzierte HL-60-Zellen nicht aufweisen adhäsive Wechselwirkungen mit Fibronektin-16. Das Design der Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, so dass bis zu 10-12 Assays / h im Vergleich zu nur 1-2 Assays / h, die mit PPFCs getestet werden kann, um mindestens 5-mal erhöht den Durchsatz. Darüber hinaus müssen PPFCs um wieder zusammengesetzt und gewaschen werden, vor jeder Wiederverwendung, weitere Verlangsamung Leistungsgrad. Darüber hinaus ermöglicht die einfache kontrollierte Strömung schnelle Durchführung der scherabhängige Experimente, die dann leicht mittels geeigneter Software analysiert werden können.
Als nächstes testeten wir dieses Multi-Well-Platte-System durch die Analyse von Wechselwirkungen zwischen HL-60-Zellen und ECs Beschichtung der mikrofluidischen Kanal. ECs sind bekannt, um auszudrücken, P-und E-sel während des Entzündungsprozesses 5. Um ECs mit einer entzündlichen Reiz bieten, sie vorbehandelt wir mit TNF-α. Während E-sel war hochreguliert war P-SEL nicht im Einklang mit der Literatur zeigt, daß menschliche Endothelzellen exprimieren E-sel, aber nicht P-sel, in Reaktion auf TNF-α-Aktivierung, da die Primaten P-sel-Promotor fehlt TNF α-Response-Elemente, resulting in Transkriptionsinduktion von nur 20,21 E-sel. Entzündlichen Erkrankungen wurden dann innerhalb des Kanals durch Inkubation der EC-Monoschicht mit TNF-α simuliert, gefolgt von Perfusion von HL-60-Zellen auf seine Wechselwirkungen mit der Oberfläche EG erkunden. Während HL-60 nicht mit nicht-aktivierten Endothelzellen interagieren, haben sie zeigen eine robuste Walz Reaktion auf TNF-α-aktivierte Endothelzellen (Fig. 3C) mit ihren berichtet Reaktion in der Literatur 22 korreliert. Blockierungsexperimente ab (4A) zeigte dann, dass E-sel, aber nicht P-sel, Sperrung in einer signifikanten Reduktion der HL-60 rollen auf aktivierten Endothelzellen. Diese Daten zeigen die direkte Einbindung der E-sel, und nicht die P-sel, bei der Vermittlung der Walzen von HL-60 auf die TNF-α-aktivierten menschlichen ECs 20,21. Die Ab Blockierungsexperimente, umgekehrt, die E-sel-vermittelte Roll auf aktivierten ECs vs P-sel-vermittelte Rollen auf CHO-P, eine weitere Bestätigung der Durchführbarkeit und Relevanz von Ab Blocking Experimente schnell in dieser Mikrofluidik-System durchgeführt. Interessanterweise Hemmung des Walz nicht vollständig war (etwa 70% Verringerung) nahelegt, daß andere Oberflächenrezeptoren, wie VCAM-1, auch in HL-60 beteiligen Walzen auf Aktiv ECs 27. Spur Pfad-Analyse ergab weiter, ein weiteres interessantes Phänomen - während die Walzen von HL-60 auf blockierten aktiviert ECs war kontinuierlich und robust, blockiert die geringe Anzahl von Zellen, die noch auf E-sel gerollt aktiviert angezeigt ECs eine fragmentierte Rollbahn auf der blockierten ECs ( Fig. 4B). Dieses Phänomen wurde in ECs mit P-sel Blockieren oder Isotyp-Kontrolle (Daten nicht gezeigt) inkubiert wurden. Dies spricht stark, dass, während eine Roll Antwort ist über andere Marker möglich, wenn EG-E-sel blockiert ist, stützt sich diese Rollen auf schwach, teilweise HL-60-EG-Wechselwirkungen, die Unterstützung nur eine lockere, teilweise Roll Reaktion mit dem aktivierten ECs 5,22 ,27-29. Dies wird in Fig. 4C gezeigt, Daten gestützt 30-33, und die Verbesserung der Durchsatz von Mikrofluidik über die Multi-Well-Platte-System hier vorgestellten, weitere Highlights das Potenzial dieser Technologie für effiziente und präzise Analyse der wichtigsten Rolleigenschaften zur Verbesserung der therapeutischen Anwendungen .
Diese Studie auf Prüfung von HL-60-Zell Rollen auf Proteinsubstraten und Zellmonoschichten unter physiologisch relevanten und genau kontrollierten Scherströmung miteine Multiwell-Platte mikrofluidischen System. Ebenso können die anderen Zelltypen und andere Substrate / Zellmonoschichten ohne weiteres verwendet werden, um die Rolleigenschaften zu untersuchen. Benutzerfreundlichkeit und einfache Analyse ermöglicht eine genaue Analyse wichtiger Rolleigenschaften und Ab Sperrung oder Aktivierung mit verschiedenen Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren können verwendet werden, um mögliche Beteiligung von molekularen Markern in der Walz Antwort zu erkunden. Dies kann besonders nützlich zum Studium Stammzellen Walzen und Homing, die entwickelt werden können, um Stammzellen-basierten Therapie 34-36 zu verbessern. Wichtig ist, können mehrere Bedingungen mit verbesserten Durchsatz (5-10 mal höher vs PPFCs) getestet werden, die eine schnelle und effiziente Untersuchung von Walz Eigenschaften aufgrund der Plattendesign. Andere Assays für Zell Homing relevant, wie Zelladhäsion, Chemotaxis und Transmigration kann auch unter Verwendung dieses Systems 1,10,13 sucht werden. Insgesamt ergibt dies mikrofluidische System als leistungsfähige Technik zur Zellroll und s studierenhould als nützliches Werkzeug, um in die klinische Umsetzung von exogenen zellbasierte Therapie unterstützen zu dienen.
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Disclosures
Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
CHO-P-Zellen waren eine Art Geschenk von Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health HL095722 Zuschuss unterstützt, um JMK Diese Arbeit wurde zum Teil auch von einem Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award zu JMK unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
References
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