Summary
وN-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين التي يسببها تم تطوير نموذج سرطان المثانة في الميوسين الإنسان 1 (MUC1) الفئران المعدلة وراثيا لغرض اختبار MUC1 العلاج المناعي الموجه. بعد بالإدارة لقاح الببتيد MUC1 المستهدفة، وأكد استجابة الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا لMUC1 من خلال قياس مستويات خلوى المصل ونشاط محدد تي خلية.
Abstract
وقد تم تطوير نموذج ما قبل السريرية لسرطان المثانة الغازية في الميوسين الإنسان 1 (MUC1) المعدلة وراثيا (MUC1.Tg) الفئران لغرض تقييم العلاج المناعي و / أو العلاج الكيميائي السامة للخلايا. للحث على سرطان المثانة، C57BL / 6 الفئران (نوع MUC1.Tg والبرية) وعولج شفويا مع مسرطن N-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين (OH-BBN) في 3.0 ملغ / يوم، 5 أيام / الأسبوع لمدة 12 أسبوعا. لتقييم آثار OH-BBN على ملف خلوى المصل خلال تطوير الورم، وقد تم جمع الدم كله عبر ينزف تحت الفك السفلي قبل العلاج وكل أربعة أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، كانت تدار لقاح الببتيد MUC1 استهداف وهمي لمجموعات من الفئران أسبوعي لمدة ثمانية أسابيع. أجريت متعددة immunoanalyses microbead فلوروميتريك من السيتوكينات في مصل الدم أثناء تطوير ورم والتطعيم التالي. في الإنهاء، انترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) / انترلوكين 4 (IL-4) تحليل ELISPOT لMUC1 محددة الاستجابة المناعية T-خلية والتقييمات الأنسجة من نوع الورموأجريت الصف. أظهرت النتائج ما يلي: (1) كانت نسبة حدوث سرطان المثانة في كلا MUC1.Tg والبرية نوع الفئران 67٪، (2) سرطان الخلايا الانتقالية (TCC) وضعت في نسبة 2:1 مقارنة مع سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) ، (3) زيادة السيتوكينات الالتهابية مع الوقت خلال تطوير الورم، و (4) إعطاء اللقاح الببتيد يؤدي الى TH1 الاستقطاب الشخصي خلوى المصل وMUC1 محددة استجابة خلايا T. وكانت جميع الأورام في الفئران MUC1.Tg إيجابية لMUC1 التعبير، وكانت نصف جميع الأورام في MUC1.Tg والبرية نوع الفئران الغازية. وفي الختام، وذلك باستخدام نهج الفريق من خلال تنسيق جهود الصيادلة، مناعة، علم الأمراض والأحياء الجزيئية، قمنا بتطوير نموذج سليمة الماوس المعدلة وراثيا المناعي للسرطان المثانة التي تعبر عن hMUC1.
Introduction
سرطان المثانة هو الشكل الأكثر شيوعا من سرطان الرابعة والسبب الرئيسي الثامنة لوفيات السرطان في الرجال الأمريكيين. في الولايات المتحدة، ومن المتوقع بين الرجال والنساء جنبا إلى جنب في عام 2013 ما يقدر ب 1 72،500 حالة جديدة و 15،000 حالة وفاة بسبب سرطان المثانة. حالات الإصابة بسرطان المثانة هو ما يقرب من ثلاثة أضعاف في الرجال مقارنة بالنساء. في الولايات المتحدة، سرطان الخلايا الانتقالية (TCC) تمثل أكثر من 90٪ من الحالات، في حين أن سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) لديها معدل أقل من 2٪ 2. النسبية معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات شاملة لTCC حليمي هو 91.5٪ مقارنة مع 30.9٪ فقط لSCC 2. على الرغم من أن البلدان المساهمة بقوات حليمي موسع تمثل حوالي 75٪ من الحالات في وقت التشخيص، حتى مع العلاج أكثر من 50٪ من المرضى سوف تشهد تكرار في غضون 5 سنوات، مع ما يصل إلى 30٪ من هؤلاء المرضى يتقدم إلى العضلات مرض الغازية 3،4 . نظم المعالجة النموذجية للالجرد غير العضلاتتشمل أمراض asive بتر عبر الإحليل (تركيا)، يليه العلاج الكيميائي داخل المثانة. في المرضى الذين يعانون من تا عالية الجودة أو الأورام T1، قد يتم تنفيذ تكرار TUR قبل العلاج الكيميائي 3،4. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من تكرار تا بدرجة منخفضة أو تا عالية الجودة أو آفات T1، والطور يليها العلاج الكيميائي المواد المساعدة أو العلاج المناعي في شكل عصيات كالميت غيران (BCG) يمكن أن تستخدم 3،4. وقد تبين BCG داخل المثانة لتكون متفوقة على إينترفسكل ميتوميسين C مع الاحترام لآخر لتكرار 5. لعضلة T2 المرض الغازية، استئصال المثانة الجذري مع أو بدون العلاج الكيميائي المواد الجديدة المساعدة هو المسار الموصى بها من العلاج 3. في المرضى الذين يعانون من SCC، استئصال المثانة الجذري يبدو أن العلاج الأكثر فعالية 6. وبالنظر إلى معدلات عالية جدا من تكرار على الرغم من أفضل العلاجات المتوفرة، ومن الواضح أن هناك حاجة لعلاجات جديدة وأكثر فعالية لسرطان المثانة.
توسيع المناعية جديدة للbladdإيه السرطان هو أحد النهج الممكنة التي قد تبشر لتمديد بقاء خالية من الأمراض. تاريخيا، كان BCG الخلايا الجذعية الوحيد الفعال لسرطان المثانة. ويعتقد أن آلية عملها لتشمل تحريض غير محدد من نوع تي المساعد 1 (TH1) الاستجابة المناعية عن طريق زيادة مستويات انترلوكين 2 (IL-2) والانترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) 4. الخلوية، أو TH1 الحصانة، أمر بالغ الأهمية في العلاج المناعي السرطان كما الخلطية، أو TH2، ولم يثبت قط الحصانة لتكون فعالة ضد الأورام الصلبة، مع استثناء من الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات عامل النمو 7. في محاولة لتحسين بناء على فوائد BCG حيد، تم تقييم الإنترفيرون α 2B/BCG تركيبة الخلايا الجذعية في التجارب السريرية المرحلة الثانية مع نتائج غير حاسمة 8. نهج بديل لزرع الخلايا الجذعية لسرطان المثانة قد تكون لاستهداف مستضدات الأورام المرتبطة (TAAS)، وتحديد والتي جعلت الخلايا الجذعية السرطانية أكثر تحديدا 7
واحدة من هذه TAA هو الميوسين 1 (MUC1)، وهو بروتين سكري سطح الخلية بإفراط (overexpressed) في العديد من أنواع السرطان الخلايا الظهارية مثل المثانة والثدي والرئة، وسرطان البنكرياس 9،10. أيضا يتم تبديل التعبير وتعديل MUC1 بشكل كبير خلال التسرطن، بحيث underglycosylation يعرض تسلسل الأنتيجين من الأحماض الأمينية المعروفة باسم عدد متغير من يكرر جنبا إلى جنب (VNTR) على جوهر الببتيد. بينما MUC1 هو جزيء النفس، لا تتعرض هذه المناطق VNTR سائد مناعيا عادة بسبب ارتباط بالغليكوزيل واسعة، وبالتالي ينظر إليهم من قبل النظام المناعي كما 11،12 الأجنبية. تم السامة للخلايا T-الخلايا الليمفاوية (CTLs) التي تعترف على وجه التحديد MUC1 الحواتم معزولة عن ورم الغدد الليمفاوية استنزاف لمرضى سرطان الثدي 13، وكذلك الدم ونخاع العظام للمرضى المايلوما 14،15، مما يجعل MUC1 هدفا محتملا ل الاستجابة المناعية الخلوية. وVNTRs سائد مناعيا من underglycosylateيتم التعرف على شكل D من MUC1 بواسطة CTLs، مما أدى إلى تدمير الخلايا السرطانية 16-19. الأم الاستجابات المناعية الخلوية و / أو الخلطية إلى MUC1 سرطانية، ومع ذلك، ليست قوية بما فيه الكفاية للقضاء على الأورام. لزيادة ضعف الاستجابة المناعية الموجودة بالفعل لMUC1، ويمكن إدخال الببتيدات سائد مناعيا الاصطناعية من خلال التطعيم لتوليد استجابة CTL قوية بما فيه الكفاية لتكون ذات فائدة سريرية 18،20. وقد تبين بالفعل هناك لقاح الليبوسومال MUC1 لزيادة البقاء على قيد الحياة في مرضى سرطان الرئة 21،22، وتوليد CTLs قادرة على قتل الخلايا السرطانية إيجابية MUC1، وإنتاج رد فعل خلوى TH1 الاستقطاب 23،24. مع مستوى عال من MUC1 التعبير 9،11،25، وسرطان المثانة هو المرشح المنطقي لاختبار MUC1 العلاج المناعي الموجه 26،27. وعلاوة على ذلك، MUC1 لديها امكانات كعامل النذير في سرطان المثانة 28، MUC1 التعبير في TCC يرتبط بشكل كبير مع المرحلة والصف، والنقيلي TCCوقد تبين أن يواصل التعبير عن MUC1 29.
من أجل تقييم الفائدة المحتملة من العلاج المناعي الموجه MUC1 في سرطان المثانة، وضعنا على MUC1 الإنسان سليمة المناعي (hMUC1)، معربا عن المعدلة وراثيا (MUC1.Tg) نموذج الفأر من مسانج سرطان المثانة على C57BL / 6 خلفية 30. وأعرب عن MUC1 الإنسان باعتبارها من البروتين الذاتي تحت سيطرة المروج الخاصة بها، مما أدى إلى نمط التعبير الأنسجة متسقة مع تلك التي لوحظت في البشر 30،31. وقد حثت الفئران مع المثانة مسرطنة معروفة N-بوتيل-N-(4-hydroxybutyl) نيتروماسين (OH-BBN) 32، ثم تم تقييم الأورام الناتجة عن hMUC1 التعبير ونوع الورم والصف. لتقييم تأثير مسرطن على Th1/Th2 مستويات خلوى خلال تطوير الورم، تم جمع عينات من مصل الدم بصورة دورية للتحليل المتعدد. ثم عولجت الفئران مع لقاح الببتيد MUC1 المستهدفة، وكانت خلوى المصل والاستجابات المناعية EVALUAتيد بواسطة متعدد فلوروميتريك المناعية microbead وELISPOT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات على الحيوانات والتجارب في إطار البروتوكول المعتمد من قبل جامعة كاليفورنيا، ديفيس المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة الاستشارية الإدارية.
1. MUC1.Tg تربية ماوس والدعوة
- وديفيس برنامج علم الأحياء ماوس UC (ب ب) السلالات البرية نوع C57BL / 6 الفئران الذكور مع متخالف MUC1.Tg C57BL / 6 الفئران الإناث إلى إنشاء لدينا مستعمرة التكاثر. يتم تسليم MUC1.Tg ذرية للدراسات حسب الحاجة.
- أفراد MBP مقطع أصابع ذرية في نمط المعرفة (0-99) لتحديد الماوس، وعندما ينطبق مقطع الذيل. تتم معالجة الأنسجة اصبع القدم أو ذيل لالتنميط الجيني باستخدام استخراج الحمض النووي القياسية وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تحليل.
2. تصميم الدراسة
- دراسة وظائف بيتية المجموعة
- وزن كل فأر بشكل منفصل على التوازن وتسجيل الوزن في غرام لكل الماوس.
- هذا الجزء من الإجراء الجردolves المنهجية وتصميم الدراسة. بالنسبة للجزء الأول من الدراسة، تعيين العمر المتطابقة MUC1.Tg والبرية نوع الفئران لبدء الاستقراء سرطان المثانة مع OH-BBN. الموت ببطء الفئران بعد 8 أسابيع من مشاركة OH-BBN جرعة للتأكد من وجود أورام المثانة بواسطة الأنسجة.
- بالنسبة للجزء الثاني من الدراسة، الفئران بطريقة عشوائية MUC1.Tg الذكور إلى العدد المناسب من العلاج ومجموعات المراقبة. وسيتم رصد هذه الفئران لالسيتوكينات في مصل الدم والاستجابات المناعية T-الخلية خلال الاستقراء والتنمية الورم، ومن ثم في إنهاء الدراسة بعد 8 أسابيع من الجرعة OH-BBN الماضي.
- سرطان المثانة التعريفي
- OH-BBN هي مادة مسرطنة وشديدة السمية. يرجى قراءة واتباع المبادئ التوجيهية للورقة بيانات سلامة المواد عند التعامل مع هذه المادة الكيميائية وتخزينها.
- حساب تركيز المحلول الجرعات اللازمة لتقديم الجرعة المناسبة (3 ملغ)، في حجم 100 ميكرولتر، إلى كل فأر على أساس متوسط أوزان وnumbeR من الفئران في كل دراسة والمجموعة.
- تمييع OH-BBN في الإيثانول بنسبة 100٪. جلب التركيز النهائي إلى 30 ملغ / مل مع الماء المعقم. الإيثانول النهائي: يجب أن يكون تركيز الماء 20:80، V / V.
- إدارة OH-BBN شفويا باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ، 20 G الإبر أنبوب تغذية يوميا، 5 أيام / الأسبوع لمدة 12 أسبوعا، بناء على الاحالة المجموعة بدء العلاج في سن 8 أسابيع.
- علاجات التلقيح
- إعادة كل قنينة من لقاح مجفف بالتجميد الببتيد في 600 ميكرولتر من المياه المالحة عقيمة 0.9٪ و resuspend بدقة عن طريق رسم الحل من خلال 0.5 بوصة 27 G إبرة 6X. باستخدام المياه المالحة، وضبط تركيز بحيث يتم تسليم جرعة المطلوبة في حجم 100 ميكرولتر.
- ابتداء من الأسبوع 20، بعد آخر جرعة من OH-BBN، ويدير لقاح على أساس أسبوعي لدورة لمدة ثمانية أسابيع بواسطة الحقن تحت الجلد من 100 ميكرولتر باستخدام إبرة G 25 (عدد الأسبوع يتوافق مع عمر الفئران).
- رصد وجمع العينات
- تزن كل الفئران وجس لوجود أورام جديدة مرة واحدة كل أسبوع. الموت ببطء أي الفئران التي فقدت ≥ 20٪ من وزن الجسم أو إذا كان هناك أورام واضح، والدم في البول، و / أو احتباس البول.
- قبل أول جرعة OH-BBN ومن ثم على فترات الأسبوع 4 بعد ذلك، وجمع الدم كله عبر ينزف تحت الفك السفلي. جمع الدم في أنابيب تخثر الدم (BD Microtainer)، والسماح ل30 دقيقة على تجلط الدم.
- الطرد المركزي عينات الدم في microcentrifuge في 3،500 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل بعناية المصل إلى المسمار cryotubes قبعة باستخدام ماصة.
- تجميد فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل بواسطة متعددة.
- بعد ثمانية أسابيع من آخر جرعة من OH-BBN، الموت ببطء كل الفئران عن طريق CO 2 الاختناق.
- وضع كل الماوس على لوحة التشريح وحصره من قبل جميع أطرافه الأربعة.
- باستخدام ملقط ومقص، يا أماهكه شق أفقي في منطقة البطن العلوية. إدراج مقص في شق بين طبقة البشرة وجدار البطن وفصل بلطف على الجلد من الأنسجة الكامنة بمساعدة ملقط.
- جعل شق عمودي من شق أفقي في أعقاب محور الأوسط نحو نهاية الأمامي من الفأرة. فصل الجلد من القفص الصدري، وباستخدام حقنة 1 مل وإبرة G 22، ثقب القلب وجمع الدم بالتعادل على نحو سلس ومطرد.
- الرجوع إلى الخطوة 2.4.3 و2.4.4 لعزل وتخزين المصل.
- باستخدام ملقط ومقص، وقطع وقشر عودة بقية طبقة البشرة. قطع طريق جدار البطن والصفاق وجو معقم و مطهر إزالة ورم المثانة لالمناعية (IHC) وطخة غربية.
- جمع الطحال للتحليل بقاء الخلية (موسى) وELISPOT. لIHC، مكان المثانة عينة الورم في الأنسجة كاسيت والإصلاح في ليلة وضحاها الفورمالين المبردة في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، استبدال الفورمالين مع الايثانول 70٪.
- لتحليل لطخة غربية من الورم، والتجانس الورم، إضافة العازلة استخراج البروتين بالإضافة إلى مثبطات الأنزيم البروتيني وقف ونقل إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
- دوامة لمدة 30-60 ثانية مع الاستمرار على الجليد لمدة 5 دقائق. تجميد فلاش في النيتروجين السائل وذوبان الجليد في المياه المحيطة. تكرار عملية vortexing ل، وتجميد والذوبان مرتين.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل مقتطفات الخلوية إلى أنابيب جديدة المسمى.
- قياس تركيز عن طريق إجراء الفحص Bicinchoninic حمض البروتين (BCA) لقياس البروتين. عينات في مخزن -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للتحليل لطخة غربية.
3. علم الأحياء الجزيئية / ويسترن
تم تنفيذ الإجراءات التالية للتحقق من التعبير عن MUC1 في الماوس المثانة نسيج الورم باستخدام معيار الغربية وصمة عار بروتوكول (البيانات لا تظهرن).
- فصل مستخلصات البروتين بواسطة SDS-بولكرلميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) ثم نقل على غشاء PVDF باستخدام جهاز شبه الجافة.
- منع نقل البروتين الغشاء مع الحليب الخالي 5٪ في 0.1٪ توين 20 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS-T) ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 1 ساعة على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مع الأجسام المضادة لمكافحة MUC1 أو مكافحة β-الأكتين في 0.1٪ PBS-T.
- يغسل الغشاء من قبل الصب الحل وإضافة 0.1٪ PBS-T. دوامة الغشاء على شاكر لمدة 5 دقائق وصب. كرر هذه الخطوة مرتين.
- احتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع البيروكسيداز الفجل (HRP) الأجسام المضادة الثانوية مترافق.
- غسل 3X (يرجى الرجوع إلى الخطوة 3.4).
- اتبع بروتوكول لتعزيز Chemiluminesence (ECL) عدة لتنشيط وقراءة تصوير تألقي.
4. متعددة فلوروميتريك المناعية Microbead
<OL>- باستخدام خريطة وحة 96 جيدا، تعيين الفراغات، والمعايير، والضوابط، والمجاهيل إلى الآبار. حساب عدد وحجم التحاليل، والتقاط الأجسام المضادة وStreptavidin-فيكوإيريترين (SA-PE) اللازمة للفحص.
- السماح لجميع مخازن ومنظفة لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد المعايير والتخفيفات عينة باستخدام لوحة 96 جيدا فارغة.
- إعادة تشكيل مصفوفة المصل ومستوى مجفف بالتجميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وجعل 01:05 التخفيفات التسلسلي للمعيار مع مخفف المناسبة في لوحة 96 جيدا. لآبار فارغة، استخدم مخفف المناسبة.
- تمييع جميع الضوابط وعينات غير معروفة في 01:02 مخفف المناسبة في بقية من لوحة 96 جيدا.
- لمزيج حبة، ماصة حجم المطلوب من مخفف المناسبة في أنبوب مل 15. دوامة كل قارورة حبة لمدة 20 ثانية وماصة حجم المطلوب من كل الحليلة في أنبوب مل 15. دائما حماية حبات من ضوء لتجنب photobleaching. لا تضع لوحة 96 جيدا على مادة ماصة لتجنب فقدان العينة من خلال فتل.
- Prewet لوحة أسفل 96-جيدا مرشح مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي الفحص والسماح للاستحمام الكامل للمرشح. استنزاف بلطف باستخدام 96 جهاز فراغ لوحة جيدا وصمة عار تجف الجزء السفلي من لوحة مع منشفة ورقية.
- باستخدام ماصة الأقنية، ماصة 25 ميكرولتر من المصفوفة المصل إلى الآبار المخصصة للفراغات والمعايير وماصة 25 ميكرولتر من الاحتياطي الفحص إلى الآبار المخصصة للضوابط والمجاهيل.
- ماصة 25 ميكرولتر من الفراغ، والمعايير، والضوابط، والمجاهيل إلى الآبار المخصصة منها. دوامة المزيج حبة لمدة 20 ثانية ونقل الخرز إلى خزان.
- ماصة 25 ميكرولتر من مزيج حبة في كل بئر. تغطية لوحة بورق الألمنيوم أو غطاء لوحة مبهمة للحماية من ضوء.
- إعداد الحل الضد الالتقاط. ماصة المبلغ المطلوب من 0.1٪ PBS-T والتقاط الأجسام المضادة إلى 15 مل أنبوب ودوامة لمدة 10 ثانية. نقل مزيج الأجسام المضادة القبض على خزان وماصة 25 ميكرولتر في كل بئر.
- يهز لوحة في 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على طبق من ذهب شاكر. يصفى ويغسل اللوحة مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T مرتين. استنزاف وصمة عار الجافة.
- إعداد الحل SA-PE. ماصة حجم المطلوب من 0.1٪ PBS-T و SA-PE إلى 15 مل أنبوب ودوامة لمدة 10 ثانية. نقل الحل إلى خزان وماصة 25 ميكرولتر في كل بئر.
- يهز لوحة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على طبق من ذهب شاكر. يصفى ويغسل اللوحة مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T مرتين. استنزاف وبالكثير الجافة.
- ماصة 100 ميكرولتر من 0.1٪ PBS-T ويهز على طبق شاكر في 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين على الأقل ل resuspend الخرز. قراءة وتحليل لوحة على الجهاز LX200 LUMINEX.
5. IFN-γ/IL-4 ELISPOT إعداد وتحليل
- في خزانة السلامة البيولوجية، معالجة الطحال من خلال 100 ميكرون الأنسجة نايلون غرابيل إلى 5 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أطباق بتري معقمة. طبقة splenocytes على 3 مل من المتوسط فصل الخلايا اللمفاوية في أنابيب 15 مل العقيمة.
- أنابيب الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 دقيقة لفصل الخلايا الليمفاوية من خلايا الدم الحمراء. نقل الخلايا الليمفاوية الطبقات فوق التدرج إلى 15 مل أنابيب جديدة معقمة.
- ضبط مستوى الصوت إلى 10 مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة. الطرد المركزي تعليق في 600 x ج لمدة 10 دقيقة لخلايا بيليه.
- نضح في وطاف resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة بقاء الخلية والعد مع موسىمحلل. اتبع عدد موسى وبروتوكول كيت قدرتها على البقاء.
- جعل التخفيفات المسلسل من الخلايا الليمفاوية في 1.5 مل المسمار كأب أنابيب الطرد المركزي في عوامل التخفيف من 1:10، 1:20، 1:40 و(أو عند الضرورة) في عدد والكاشف الجدوى (الحد الأدنى إجمالي حجم 300 ميكرولتر). ماصة كل تخفيف صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط وتحليل على موسى.
- إعداد خريطة لوحة من العينات وشروط لوحة ELISPOT. إعداد لوحة ELISPOT وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وماصة 100 ميكرولتر من المتوسطة، الببتيد (10 ميكروغرام / مل)، أو التدافع الببتيد (10 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر.
- ماصة 100 ميكرولتر من تعليق خلية، وتقديم 1.0 × 10 6 خلايا إلى كل بئر واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للمقايسة ELISPOT. تحليل لوحة ELISPOT تطويرها باستخدام مجهر تشريح.
- قياس النتائج عن طريق حساب عدد من البقع الملونة correspondiنانوغرام لكل الحليلة في كل بئر. البقع تتوافق مع عدد من بقعة تشكيل الخلايا (SFC) في كل بئر.
6. المناعية (IHC) والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ
- اتخاذ المثانة أنسجة الورم الحفاظ على النحو المبين أعلاه (القسم 2.4.11)، تغرس في البارافين والباب خطوة في 4 ميكرومتر لتحليل المناعى.
- أداء IHC باستخدام الأجسام المضادة MUC1 أن تعترف تكرار المنطقة جنبا إلى جنب من MUC1. استخدام عدة بحوث الحيوان البيروكسيديز لتقليل تفاعل الأجسام المضادة مع الماوس الثانوي المناعي الذاتية موجودة في الأنسجة.
- أداء H & E تلطيخ باستخدام البروتوكولات القياسية.
7. الأساليب الإحصائية
لملتيبليكس فلوروميتريك المناعية Microbead، استخدم اختبار t لطالب ثنائي الطرف لاحظ مقارنة متوسط تركيزات خلوى المصل بين العلاج ومجموعات المراقبة. لELISPOT، استخدم-W واحدةAY ANOVA لمقارنة بقعة تشكيل المستعمرات بين سيطرة وسائل الإعلام، سارعت الببتيد والجماعات الببتيد. استخدام عدة اختبار المقارنة DUNNETT لتقليل احتمال وجود نتيجة إيجابية كاذبة. يعتبر A-P من قيمة ≤ 0.05 اختلافا كبيرا عن جميع التحليلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقييم ما قبل السريرية من آثار المناعية رواية ومجموعات في سرطان المثانة يتطلب تطوير نموذج حيواني المناسبة. في نموذجنا الماوس المعدلة وراثيا، أدى الاستقراء مع مادة مسرطنة الكيميائية OH-BBN في ارتفاع معدل حدوث سرطان المثانة في الغالب من TCC مع بعض SCC، الذي يشبه سرطان المثانة لدى البشر. لتحديد الأنسجة الورم، MUC1 حالة التعبير والاستجابة المناعية لعلاج لقاح الببتيد، الموت الرحيم كانت 21 و 18 MUC1.Tg الفئران نوع البرية لجمع الدم، وقربة، والطحال (الشكل 1) ثمانية أسابيع بعد OH-BBN الاستقراء (الأسبوع 28). كان معدل حدوث سرطان المثانة لكلا MUC1.Tg (14/21) ونوع البرية (12/18) الفئران 67٪. الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) أكد تلطيخ وجود كل من TCC وSCC، مع البلدان المساهمة بقوات في غلبة نسبة 2:1. ومن بين هذه، لاحظنا مجموعة من موسع منخفض وعالي الجودة إلى الدرجة العالية الأورام الغازية.وكانت جميع العينات MUC1.Tg سرطان المثانة إيجابية لMUC1 التعبير IHC (الشكل 2). وتجدر الإشارة إلى أن الأجسام المضادة المستخدمة في MUC1 IHC تعترف MUC1 الإنسان على حد سواء طبيعية وسرطانية.
خلال تطوير نموذج، تم رصد مستويات المصل من السيتوكينات الالتهابية متسلسل بين 8-28 أسابيع. لاحظنا أن مستويات السيتوكينات الالتهابية زيادة مع الوقت من الاستقراء حتى نهاية الدراسة (الشكل 3). هذا نمط خلوى هي مشابهة جدا لما شاهدناه سابقا في نموذجنا سرطان الرئة 33، والتي تشير بقوة إلى أن زيادة مستويات السيتوكينات الالتهابية قد ترتبط التنمية الورم.
لتقييم TH1 خلوى المصل استجابة للقاح الببتيد، 15 تطعيم وكانت 14 عولجوا بدواء وهمي الفئران MUC1.Tg الموت الرحيم وتم جمع الدم في نهاية الدراسة في الأسبوع 28 و 24 ساعة بعد العلاج لقاح آخر. تحليل متعددة (الارقام ..ه 4) يبين زيادة مستويات المصل TH1 خلوى من TNF-α، الإنترفيرون γ، IL-2، IL-12 (P70)، وIL-17 في مجموعة اللقاح مقارنة مع مجموعة الدواء الوهمي. مستويات TNF-α، كان الإنترفيرون γ، وIL-17 أعلى معنويا (P <0.05) في الفئران المعالجة باللقاحات. هذه النتائج تشير إلى استجابة TH1 خلوى الاستقطاب للقاح الببتيد.
من أجل تقييم Th1/Th2 الاستجابة المناعية للقاح الببتيد، تم تقييم splenocytes بواسطة IFN-γ/IL-4 ELISPOT. أربع وعشرين ساعة بعد العلاج الاخير، تم جمع الطحال ومعالجتها لعزل الخلايا الليمفاوية للتحليل ELISPOT. احصي الخلايا الليمفاوية وتقييمها لجدوى كتبها موسى محلل (الشكل 5). وفازت المصنفة لوحات ELISPOT مع 1 × 10 6 خلايا قابلة للحياة لكل بئر وضعت في وقت لاحق 48 ساعة. نتائج ممثلة (الشكل 6) تظهر الإنترفيرون γ استجابة واضحة ومحددة لالببتيد، مما يؤكد استجابة مناعية TH1 إلى الببتيدلقاح.
الشكل 1. تم إجراء التشريح الماوس. التشريح في 28 أسبوعا، 8 أسابيع بعد نهاية OH-BBN الاستقراء. يشار إلى الكبد، ورم المثانة، والطحال. النجمة (*) يمثل نقطة ثقب لجمع الدم. في هذا المثال، لوحظ وجود درجة عالية، الغازية SCC. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. أقسام ممثل الأنسجة المثانة ملطخة H & E (يسار) والإنسان MUC1 IHC (يمين) من نورما L المثانة، سرطان الخلايا الحرشفية الغازية، وسرطان الخلايا الانتقالية الغازية. (A) المثانة البولية عادي مع الغشاء المخاطي اصطف بواسطة ظهارة الانتقالية، مما يدل منتشر MUC1 تفاعل. (B) أوكار SCC الغازية (السهم) في مخاطية. طبقات الكيراتين تنظيم (النجمة) خط الغشاء المخاطي المثانة. وينظر منتشر تفاعل MUC1 في أعشاش من SCC. (C) يحتوي الغشاء المخاطي TCC توقع في التجويف (اليسار وعلى اليمين). سرطان الخلايا الانتقالية هو كشمي مع الغزو في مخاطية والعضلات (السهم وأقحم). الغشاء المخاطي وTCC إسقاط إلى عرض التجويف نشر MUC1 تفاعل (الحق، على اليمين)، في حين TCC الغازية ذو حساسية أقل وضوحا (الحق، في اليسار). شريط = 200 ميكرون (لوحة رئيسية) و 50 ميكرون (أقحم). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
3 "FO: محتوى العرض =" 6in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الشكل (3). تم جمع السيتوكينات الالتهابية المصل في مراحل مختلفة من التنمية الورم. عينات المصل المسلسل من قبل نزيف تحت الفك السفلي في الأساس (8 أسابيع)، ثم كل 4 أسابيع بعد ذلك حتى إنهاء الدراسة. تم تجميع الدم (ن = 4)، وتم عزل المصل وتحليلها عن وجود 20 السيتوكينات. تركيزات تمثل متوسط العينات المجمعة والحانات تمثل النطاق. السهام تشير إلى النقطة التي اختتمت OH-BBN الجرعات. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4.تم جمع TH1 السيتوكينات المصل بعد العلاج لقاح الببتيد. عينات من مصل الدم في إنهاء الدراسة، 24 ساعة بعد الجرعة الأخيرة من لقاح (ن = 15) أو وهمي (ن = 14) وتحليلها لوجود 20 السيتوكينات. يتم عرض البيانات كما تركيزات خلوى يعني وأشرطة تمثل الانحراف المعياري إيجابية. * P <0.05 انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 5. تم عزل ممثل الماوس خلية طحالية الرسم البياني. splenocytes فأر في إنهاء دراسة وتقييم لعدد وحيوية باستخدام محلل موسى. اللوحة اليسرى، viablility الخلية يعتمد على حجم الخلية. اللوحة اليمنى، بقاء الخلية يعتمد على الخلايا الأنوية (الخلايا الحية في المنطقة الخضراء والخلايا الميتة في منطقة البيضاء). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل (6). تحليل LISpot خلية طحالية في إنهاء الدراسة. (A) الممثل الآبار تظهر الإنترفيرون γ (البقع الحمراء) و IL-4 (البقع الزرقاء) الإنتاج استجابة لوسائل الإعلام، سارعت الببتيد، والببتيد. ولوحظ وجود الإنترفيرون γ، ردا واضحا مستضد معين مع التعرض الببتيد. (B) التمثيل البياني من الإنترفيرون γ نموذجي البيانات ELISPOT تبين يعني (± الانحراف المعياري) بقعة تشكيل مستعمرات في الاستجابة إلى وسائل الإعلام، سارعت والببتيد الببتيد._blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والاستقراء الناجح الغازية سرطان الخلايا الحرشفية والمثانة الانتقالية في الفئران MUC1.Tg الإنسان يقدم نموذجا قبل السريرية للتنمية الخلايا الجذعية. تتطلب دراسات Immunotherapeutic استخدام عفوية، نموذج سليمة المناعي من أجل تقييم الاستجابة الالتهابية لتطور الورم على مر الزمن، فضلا عن الاستجابة المناعية لعلاج مناعي. في نموذج التنمية الورم عفوية، يبقى المكروية الورم سليمة وأورام تطوير في أكثر معدل النمو ممثل الذي يسمح لتقييم الآثار انتيتومور من العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن الجهاز المناعي يمكن قياسها ورصدها من خلال المؤشرات الحيوية، مما يتيح لتقييم فعالية العلاج.
نماذج أخرى الماوس تحمل ورم موضح في الأدب لاختبار العلاج بالخلايا الجذعية وتشمل كلا النموذجين طعم أجنبي ونماذج زرع. على الرغم من أن هذه النماذج هي مريحة واستخدمت على نطاق واسع في أبحاث السرطان،وهناك عدد من القيود الهامة التي يجب مراعاتها عند إجراء دراسات immunotherapeutic. لا xenografts ولا الأورام المزروعة تطوير عفويا، وأنها تتكاثر في المكروية التي لا تمثل الأنسجة من الأورام التي كانت مستمدة في الأصل. وعلاوة على ذلك، xenografts والأورام المزروعة تنمو بسرعة أكبر من الأورام عفوية، مما يتيح وقتا أقل لدراسة الآثار المناعية للعلاج. الأهم من ذلك، هذه النماذج تتطلب المضيفين مع الجهاز المناعي للخطر.
بالإضافة إلى نموذج لدينا، وهناك عدد من النماذج سرطان المثانة التي يسببها كيميائيا الأخرى. على سبيل المثال، N-[4 - (5-نيترو-2-فيورايل)-2-thiazolyl] وقد ثبت الفورماميد (FANFT) وN-ميثيل-N-نتروزويوريا (MNU) أيضا للحث على سرطان المثانة في كل من الفئران والجرذان . ومع ذلك، هذه المواد الكيميائية هي مختلفة قليلا فيما يتعلق الأنسجة من الأورام التي تحفز. FANFT يدفع في المقام الأول سرطان الخلايا الظهارة البولية (UCC) مع بعض SCC، في حين MNU يدفع سرطان حليمي أن يؤدي في نهاية المطاف في أورام العضلات الغازية مع وجود نسبة منخفضة من ورم خبيث 34. يستخدم OH-BBN عادة لتحريض سرطان المثانة في نماذج القوارض لأن البلدان المساهمة بقوات التي تنمي تشبه عالية الجودة البلدان المساهمة بقوات الإنسان 34. كما تم يسببها سرطان المثانة البولية في الكلاب والأرانب والفئران وكذلك في الفئران باستخدام OH-BBN. على الرغم من أنياب تبادل عمليات التمثيل الغذائي مماثلة مع البشر فيما يتعلق التنشيط الحيوي من المواد المسرطنة 35، وفترة الكمون لتطوير سرطان المثانة في البيجل هو 37 أسبوعا 36، والتجريب مع الكلاب لديها كل الاعتبارات المالية والأخلاقية. الأرانب لها فترات كمون لفترة أطول، وإذا أضيف إلى فترة الجرعة، مطلوب ما لا يقل عن 21 شهرا لTCC والتنمية SCC 37. مماثلة للفئران، ونماذج الفئران تطوير الأورام التي تشبه histopathologically إلى البشر، مع فترات قصيرة جرعة من 8 أسابيع وفترات كمون 5 أسابيع 38
سابقا وضعنا اثنين المناعة MUC1، معربا عن نماذج ورم عفوية الإنسان سليمة لكلا الرئة وسرطان الثدي 33 39. من أجل تقييم المناعية في سرطان المثانة، وضعنا على OH-BBN التي يسببها، نموذج الفأر عفوية من سرطان المثانة. وعلى غرار النماذج التي سبق وصفها 33،39، والأورام التي تتطور في هذا النموذج تعبر عن MUC1 مستضد الورم المصاحب بمثابة جزيء المصير، الذي هو الهدف من لقاح الببتيد. وأظهر هذا النموذج وجود نسبة 67٪ من أورام المثانة، وكلها كانت إيجابية للتعبير عن MUC1 الإنسان. وأظهرت التقييمات النسيجية التي سادت البلدان المساهمة بقوات، وهو ما يتسق مع ما لوحظ في سرطان المثانة الإنسان. هذا نموذج مثالي لدراسة السيارةcinogenesis، استراتيجيات الوقاية والعلاج من سرطان المثانة المترجمة ومتقدمة في البشر. في المستقبل، ونحن نخطط لمواصلة إجراء دراسات إضافية من الخلايا الجذعية في تركيبة مع مبحث المعالجة الكيميائية والعلاج الإشعاعي في نموذج سرطان المثانة وصفها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DPV، GTW، SMG، كجك، AMG، وGKH تعلن أي تضارب مصالح. MWD هو الباحث الرئيسي من المنحة المقدمة من ميرك، وMW هو موظف من ميرك.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر ديفيس برنامج علم الأحياء ماوس UC لتربية الفئران. وأيد هذا البحث من خلال منحة من ميرك، دارمشتات، ألمانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
