Summary
Poly (etylenglykol) (PEG) børste-arm stjerne-polymerer (BASPs) med smal massefordelinger og avstembare nanoscopic størrelser er syntetisert i via ringåpningspolymeriseringen metatese (tumle) av en PEG-norbornen makromonomer etterfulgt av overføring av porsjoner av den resulterende levende børste initiator til ampuller inneholdende varierende mengder av en stiv, foto-spaltbar bis-norbornen-tverrbinder.
Abstract
Enkle metoder for rask, parallell syntese av Variert functionalized nanopartikler vil muliggjøre oppdagelsen av nye formuleringer for levering av legemidler, biologisk avbildning, og støttet katalyse. I denne rapporten viser vi parallell syntese av pensel-arm stjemepolymer (BASP) nanopartikler av "brush-først"-metoden. I denne fremgangsmåten blir en norbornen-terminert poly (etylenglykol) (PEG) makromonomer (PEG-MM) først polymeriseres via ringåpnende metatese polymerisasjon (tumle) for å generere et levende børste macroinitiator. Aliquoter av denne initiator stamløsning tilsettes til ampuller som inneholder varierende mengder av et Fotonedbrytbar bis-norbornen-tverrbinder. Eksponering for crosslinker utløses en rekke kinetisk-kontrollerte børste + børste og stjerne +-stjerners kobling reaksjoner som til slutt gir BASPs med kjerner består av crosslinker og coronas består av PEG. Den endelige BASP størrelse avhenger av hvor mye av crosslinker tilsettes. Vi utfører syntesen om tre BASPs på benkeplate med ingen spesielle forholdsregler for å fjerne luft og fuktighet. Prøvene er kjennetegnet ved gelpermeasjonskromatografi (GPC), resultatene var i nær overenstemmelse med våre tidligere rapport som benyttes inerte (hanskerom) forhold. Viktige praktiske egenskaper, fordeler og mulige ulemper ved børsten-første metoden er diskutert.
Introduction
Polymere nanopartikler har vært mye studert for deres potensielle bruk som plattform for levering av legemidler, støttet katalyse, biologisk bildebehandling, og selvbygging 1-3. Moderne applikasjoner krever at nanopartikkel syntheses være lettvinte, reproduserbar, kompatibel med kjemiske funksjonalitet, og mottagelig for diversifisering 4,5. Ring-åpningen metatese polymerisasjon (tumle) av anstrengt olefiner er en kraftig metode for syntese av funksjonelle polymere nanostrukturer med kontrollert størrelse og smale massefordelinger 1,6-8. For eksempel kan norbornen-funksjon poly (etylenglykol) (PEG) makromonomerer (MMS) være effektivt polymerisert via boltre å generere vannløselige flaskekost polymerer. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan nanostrukturer som bærer flere løsbare stoffet molekyler, fluoroforene, og agenter spin-kontrast være forberedt raskt og parallelt 6, 9, 10.
ROMP har også blitt brukt til "arm-først" syntese av stjerne polymerer. I den arm-først-metoden, er lineære polymerer tverrbundet med et flerfunksjonelt tverrbindingsmiddel for å gi sfæriske nanostrukturer med polymere armer. Schrock og medarbeidere rapporterte den første arm-første boltre syntese av stjerne polymerer via kryssbinding av norbornen, dicarbomethoxynorbornadiene, og trimetylsilylderivater beskyttet dicarboxynorbornene lineære polymerer med et bifunksjonelt norbornen kryss kobling. 11, har 12 Buchmeiser utvidet denne metodikken for syntese av materialer med en spekter av applikasjoner som inkluderer støtte for katalyse, vev-engineering, og kromatografi 13-17. Otani og kollegaer har gjort stjerne polymer nanopartikler med funksjonelle overflater via en relatert "inn-ut" polymerisasjon strategi 18, 19.
De fleste arm-første polymerisering omfatter et komplekst samspill av monomer, polymer, og stjerne kobling reaksjoner. The sistnevnte inntektene via en steg-vekst mekanisme som vanligvis fører til bred molekylvekt (MW) distribusjoner. For å overvinne denne begrensningen i relaterte arm-første atom overføring radikale polymeriseringsreaksjoner, Matyjaszewski og kolleger utførte arm-første kryssbinding av prefabrikkerte polymere MMS å gi stjerne polymerer med svært smale MW distribusjoner 20. I dette tilfellet, den steriske parten av MMS, og den økte forholdet mellom stjernearmene ved iverksettelse områder, hemmet dårlig kontrollert stjerners + stjerners koblingsprosesser, og førte til en levende, kjetting vekst mekanisme.
Da vi forsøkte samme strategi i sammenheng med tumle med en norbornen-terminerte PEG-MM og en bis-norbornen tverrbinder ble stjerne-polymerer med meget brede, multimodale fordelinger MW erholdt. Dette resultatet antydet at i dette system MM alene ikke var tilstrekkelig store til å inhibere stjerne + stjernekobling. For å øke den steriske parten av stjerne armene, og potensielt begrense denne uncontrolled kopling, forsøkte vi å først polymerisere MM å danne flaske pensler polymerer i fravær av crosslinker og deretter legge til crosslinker. Vi var glade for å finne at under visse betingelser, denne "brush-først"-metoden gitt grei tilgang til "brush-arm stjerne polymerer" (BASPs) med smale MW distribusjoner og tunbare kjerne og corona funksjonalitet.
Vi har nylig rapportert børsten-første boltre syntese av PEG BASPs bruker Grubbs 3. generasjon katalysator A (Figur 1) 21. I dette arbeidet, eksponering av PEG-MM B til katalysator En generert en levende børste macroinitiator med definert ryggrad lengde (B1, Figur 1). Overføring av aliquoter av B-1 til ampuller som inneholdt forskjellige mengder av tverrbindingsmiddel C initiert BASPdannelse. Den MW, og derfor størrelsen, av de BASPs økt geometrisk med mengden av C tilsatt. Vi ga en mekanistisk hypotese for dette geometriske vekstprosessen og viste at funksjonelle nitroxide kjerne-og corona-merkede BASPs kan lett fremstilles uten behov for etter-polymerisasjons-fremgangsmåten for modifisering eller sekvensiell monomer tilføyelser. Men i alle de rapporterte eksempler, var vi bekymret for katalysator deaktivering, vi utført alle reaksjonene etter N 2 atmosfære inne i en hanskerommet.
Siden vår første rapport, har vi funnet ut at børsten-første metoden er veldig effektiv for dannelsen av BASPs fra et bredt spekter av norbornen-terminert MMS og funksjonelle crosslinkers. Vi har også funnet at fremgangsmåten kan utføres på den stasjonære uten spesielle forholdsregler for å fjerne luft eller fuktighet.
Heri blir en serie på tre BASPs med forskjellige MWS bli SYnthesized av børsten-første metoden under omgivelsene. I korte trekk, blir 10 ekvivalenter B utsettes for 1,0 ekvivalenter av katalysator A (figur 1a) i 15 min for å gi en BI med en gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad (DP) på 10. Tre alikvoter av denne gruppe med BI vil bli overført til separate ampuller som inneholder 10, 15, og 20 ekvivalenter (N, figur 1b) i C. Etter 4 timer, vil polymeriseringer bli slukket via tilsetning av etyl-vinyl-eter. Stjernen polymer MWS og MW distribusjoner vil bli karakterisert ved hjelp av en gelpermeasjonskromatografi instrument utstyrt med en multi-vinkel laser lysspredning detektor (GPC-kjøpesentre).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi først beskrive syntese og rensing av PEG-MM B fra 3 kDa O-(2-aminoetyl) polyetylenglykol (PEG-NH 2) og norbornen-N-hvdroksvsuccinimidvl (NHS)-ester. Den førstnevnte forbindelse kan kjøpes fra Sigma Aldrich Inc., eller fremstilt ved anionisk polymerisering i henhold til litteraturfremgangsmåter 22,23. Sistnevnte forbindelsen kan være forberedt i to trinn i henhold til en publisert prosedyre 21. Neste vi beskriver en syntese av katalysator A fra kommersielt tilgjengelig Grubbs 2. generasjon katalysator. Deretter demonstrere bruken av dette komplekset for børste-først BASP syntese. Dette forsøk beskriver prosedyren for å lage BASPs med N = 10, 15 og 20 fra en BI med DP = 10. Alle reaksjoner ble utført i en avtrekkshette ved hjelp av standard scintillasjonsglass.
ADVARSEL: Bruk alltid hansker, en lab-frakk, og labbriller, og følge vanlige laboratoriesikkerhetspraksis ved arbeid med farlige kjemikalier. Organisk løsemiddel må håndteres i et avtrekksskap. Solids kan veies ut på en balanse utenfor avtrekksskap. Kjemikalier bør ikke komme i kontakt med hud, øyne eller munn. Det anbefales sterkt å lese HMS-datablad for hver løsemiddel og solid brukes i denne prosedyren før du begynner.
En. Utarbeidelse av PEG-MM B
- Legg PEG-NH2 (300 mg, 0.0001 mol, 1.0 ekv) i et 40 ml scintillasjonsglass utstyrt med en rørestav.
- Oppløs de PEG-NH 2 i 3 ml vannfritt N, N-dimetylformamid (DMF).
- Til 36 mg av norbornen-NHS-ester (0,000105 mol, 1,05 ekvivalenter) 21.
- Lokk på ampullen og omrør reaksjonsblandingen over natten ved romtemperatur.
- Fjern rørestav og tilsett dietyleter til reaksjonsoppløsningen for å utfelle PEG-MM B.
- Filtrere det hvite influensaffy bunnfall og vaskes omfattende med dietyleter. Alternativt kan overføre suspensjonen til en 50 m sentrifugerør, sentrifuge ved 4000 rpm i 5 min ved romtemperatur, og deretter dekantere supernatanten. Legg frisk dietyleter, sentrifuger, og dekanter nytt. Vi anbefaler å gjenta denne prosedyren 3x for totalt 5x.
- Tørk bunnfallet under vakuum i 24 timer for å fjerne rester av dietyleter.
2. Rensing av PEG-MM
I vår tidligere rapport, ble PEG-MM B fremstilt fra kommersielt tilgjengelig PEG-NH 2, og ble anvendt for BASP syntese uten ytterligere rensing etter tørking (dvs. etter trinn 1.7). I denne studien, varierer vi PEG-NH2-kilde (kommersielt versus hjemmelaget), og vi sammen BASP formasjons resultatene før og etter strengere preparativ væskekromatografi med høy ytelse (prep-HPLC) MM rensing. I resten av denne studien, drIED MM erholdt etter trinn 1.7 blir referert til som B1. Prep-HPLC ble benyttet for å rense B1 for å gi B2. En tilsvar prep-HPLC renset MM syntetisert i vårt laboratorium via anionisk polymerisasjon er referert til som B3. Prep-HPLC ble utført ved hjelp av en Beckmann Coulter HPLC (127p oppløsningsmiddel modul og 166p detektormodul) med en 1 ml prøvesløyfe og en Agilent Zorbax 300SB-C18 PrepHT revers-fase kolonne ved romtemperatur.
- Set-up HPLC med oppløsningsmiddel A: avionisert vann (Millipore rensesystem, 18,2 Ω) med 1% eddiksyre, løsningsmiddel B: acetonitril.
- Prime pumper og ekvilibrere kolonnen med 95% A og 5% B.
- Oppløs PEG-MM i acetonitril eller i MeOH (150 mg / ml).
- Filtrer gjennom et 13 mm 0,45 mikrometer Nylon sprøyte filter.
- Sett HPLC-metoden:
- Strømningshastighet: 20 ml / min
- 0-1 min: lineær gradient til 10% B 90% A
- 1-10 min: linear-gradient til 90% B 10% A
- 10-13 min: bryteren til startbetingelsene (5% B 95%) og re-likevekt kolonne
- Sett UV-detektor for å detektere absorbans ved 256 nm - Load 0,8 ml av prøve i prøvesløyfen.
- Injisere prøven.
- Samle de store absorbans peak (på de vilkår som er angitt, elutes produktet mellom 5-7 min).
- Gjenta om nødvendig. Kombiner rene fraksjoner sammen i en rundbunnet kolbe.
- Fjern alt løsningsmiddel ved rotasjonsfordamper.
- Oppløs produktet i diklormetan og tilsett natrium-sulfat. Rist eller rør kolbe med jevne mellomrom for ≅ 1 hr.
- Filtrer blandingen ved hjelp av et frittet glassfilter.
- Konsentrer via rotasjonsfordampning. Tørr under vakuum over natten.
- PEG-MM kan være preget av en H-NMR i CD 2 Cl 2 (15-20 mg/0.7 ml CD 2 Cl 2, 500 MHz eller høyere anbefales med over 128 skanner og avslapping forsinkelse, d1= 2,0 sek), og MALDI-TOF ved hjelp av positiv ionisering modus og 2 - (4-hydroxyphenylazo) benzosyre som MALDI matrise.
- Den PEG-MM kan lagres i flere måneder i en scintillasjonskyvette ved 4 ° C.
Tre. Fremstilling av katalysator A
- Legg Grubbs 2. generasjon katalysator (500 mg, 0,589 mmol) i et 20 ml hetteglass utstyrt med en rørestav.
- Legg pyridin (ca. 0,474 ml, 5,89 mmol, 10 eq) til ampullen. Løsningen farge bør umiddelbart skifte fra rødt til grønt. Tillat reaksjonsblandingen å omrøres inntil alt av det røde farge er forsvunnet, og oppløsningen er blitt tyktflytende (15-30 min).
- Fyllreaksjons ampulle med kald pentan for å felle komplekset A.
- Filtrer suspensjonen for å samle den grønne bunnfall (katalysator A). Vask 4x med 15 ml kaldt pentan.
- Tørk den grønne solid under vakuum over natten.
- Complex En kan værelagres i flere måneder ved romtemperatur i en stasjonær eksikator uten betydelig tap av aktivitet. For ekstra sikkerhet, vi vanligvis lagre komplekset i en -20 ° C fryser inne i en hanskerommet. For enkelthets skyld vi pre-veie kjente mengder av A i 4 ml scintillasjonsglass umiddelbart etter tørking (trinn 3.5). Vi deretter lagre disse ampullene i hanskerommet fryser. Når du er klar til å kjøre på tur reaksjon, vi bare ta ett hetteglass ut av hanskerommet og bruke som beskrevet nedenfor (trinn 4,4).
4. Utarbeidelse av Stock Solution of Living Brush Polymer (BI) med DP = 10
- I en 3 ml hetteglass med en gasstett skrulokk utstyrt med en rørestav, veie ut 65 mg (0,020 mmol, 10 ekv) i MM B. Denne mengde tilsvarer 20 mg av MM for hver av de 3 forskjellige størrelser av BASPs, og 5 mg til overs for GPC-analyse av BI. Bruk av en spatel for å legge til MM direkte til bunnen av ampullen. Try for å hindre at materialet fester seg til sidene av flasken, da dette scenario kan føre til MM forurensning i slutt BASP produktet.
- Oppløse MM B i 158 mL THF. Umiddelbart cap hetteglasset etter å ha lagt THF å unngå fordampning løsemiddel. Merk: Den endelige konsentrasjonen av MM under polymeriseringen bør være 0,05 M. Ved 158 ul THF tilsettes her, og deretter 243 pl av katalysatoroppløsningen, trinn 4.4, bli tilsatt for å gi 401 pl THF totalt, tilsvarende [MM ] = 0,05 M. Mengden av oppløsningsmiddel i løpet av dette trinnet kan varieres, så lenge som mengden av oppløsningsmidlet under trinn 4.4 blir også variert for å gi [MM] 0,05. Vi har funnet at polymeriseringer utført med [MM] <0,05 noen ganger ikke fortsetter inntil fullstendig omvandling.
- La løsningen rør til alt av MM er oppløst. Varm forsiktig hvis det er nødvendig. Unngå splattering den tyktflytende løsning på sidene eller hetten av hetteglasset.
- Deretter legger en kjent mengde (2,8mg for dette eksempel) av katalysator A i en 3 ml ampulle (eller oppnå en ampulle med forhånds veide katalysator A). Til vannfritt THF (466 mL i dette eksempel) for å gi en 6 mg / ml katalysator-løsning. Cap hetteglasset umiddelbart. La katalysator for å løse opp;. Rist forsiktig på hetteglasset hvis nødvendig Dette katalysator oppløsning bør brukes umiddelbart for boltre seg. Note 1: Katalysatoroppløsningen bør være en skoggrønn farge. Hvis det er svart eller grønn-brun, så det har sannsynligvis nedbrutt, og det vil sannsynligvis ikke gi tilfredsstillende boltre resultater. Hvis dekomponering oppstår, foreslår vi forbereder frisk katalysator (i henhold til § 3 ovenfor), eller ved hjelp av nydestillert THF. Note 2: Mengden av THF tilsatt til A er valgt for å sikre at det endelige [MM] ~ er 0,05. Denne mengde kan reguleres, så lenge kompenserende justeringer er gjort til MM-løsning i trinn 4.2.
- Legg 243 mL (1,46 mg, en ekv til B BI urenhet i slutt BASP.
- Lokk på hetteglasset umiddelbart og lar reaksjons-blandingen røres i 15 min for å danne børste macroinitiator (BI).
5. Dannelse av BASPs
- Til 3,6 ± 0,1 mg (6,18 umol, 10 ekv til mengden av BI som skal overføres i trinn 5.2), 5,5 ± 0,1 mg (9.28μmol, 15 eq til mengden av BI som skal overføres i trinn 5.2), og 7,3 ± 0,1 mg (12.4μmol, 20 eq til mengden av BI som skal overføres i trinn 5.2) av tverrbindingsmiddel C for tre separate 3 ml ampuller som er utstyrt med rør barer. Prøv å veie tverrbindingsmiddelet direkte på bunnen av flasken for å hindre at materialet fester seg til sidene av flasken. Merk: tverrbinder C ikke er svært oppløselig i THF. Av denne grunn blir det faste stoffet direkte brukes i dette trinnet. I de tilfeller hvor tverrbindingsmiddel er oppløselig, og en konsentrert stamløsning av tverrbindingsmiddel kan bli gjort, og forskjellige mengder av denne oppløsning kan overføres til ampuller. Igjen bør konsentrasjonen av den endelige polymeriseringer være> 0,05 M, hvis oppløsningsmiddel tilsettes til tverrbinder deretter en kompenserende reduksjon av oppløsningsmiddel bør være et annet sted.
- Legg 123 pl (0,618 pmol) av BI-løsning til hver av de tre ampuller inneholdende C. Prøv å holde nålespissen like over solid crosslinker når du legger til hetteglasset. Tilsett BI løsningen på en gang i stedet for dråpevis.
- Cap hetteglassene og røre reaksjonene på RT for inntilferdigstillelse. Med denne spesifikke MM og tverrbinder-kombinasjon er reaksjonen fullført i ~ 4 timer; fortsatt omrøring i opp til 24 timer ikke har noen merkbar virkning på BASP vekst. Monitor ved GPC å sikre fullstendig konvertering av BI.
- Quench reaksjonene ved tilsetning av en dråpe av etyl-vinyl-eter til det gjenværende BI-løsning, og hver av de N = 10, 15 og 20 BASP reaksjonsblandinger. Omrør i 10 minutter for å sikre fullstendig bråkjøling.
6. GPC Prøvepreparering
GPC-kjøpesentre resultater ble oppnådd på en Agilent 1260 LC-systemet utstyrt med en Shodex GPC KD-806m kolonne, en Wyatt Dawn Heleos-II MALLS detektor, og en Wyatt Optilab t-rex brytningsindeks detektor ved romtemperatur. DMF med 0,025 M LiBr ved en strømningshastighet på 1,0 ml / min ble anvendt som elueringsmiddel. Resultatene ble analysert ved hjelp av Astra 6 programvare levert av Wyatt.
- Ved hjelp av en ny glass pipette for hver reaksjon hetteglass, Dyppe pipettespissen til reaksjonsløsningen til å trekke opp en liten prøve av reaksjonen. Vask ned på innsiden av pipetten med 250 pl 0,025 M LiBr i DMF for å gi en endelig konsentrasjon på omtrent 3 mg / ml.
- Filtrer den fortynnede prøven gjennom et 0,45 um filter før polytetrafluoretylen avsette prøven inn i en GPC ampulle.
- Set-up GPC-kjøpesentre løper og analysere resultatene når de kjører er fullført.
Liste over forkortelser:
A: Grubbs 3. generasjon bis-pyridine katalysator
B: poly (etylenglykol) (PEG) makromonomer (MM)
B1: PEG MM utarbeidet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig (Aldrich) PEG-NH 2 og brukes uten HPLC-rensing.
B2: PEG MM utarbeidet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig (Aldrich) PEG-NH B3: PEG MM utarbeidet etter nysyntetiserte PEG-NH 2 og brukes etter HPLC-rensing. BASP: brush-arm stjemepolymer BI: stue børste initiator C: Fotonedbrytbar crosslinker D: molmassefordeling dispersity index DMF: N, N-dimetylformamid DP: tallmidlere polymerisasjon GPC: gelpermeasjonskromatografi Prep-HPLC: preparativ væskekromatografi med høy ytelse MALLS: multi-vinkel laser lysspredning MM: makromonomer MW: molekylvekt M w: vekten gjennomsnittlig moLar masse N: antall tverrbindingsmidler (forholdet mellom C til A) NHS: N-hvdroksvsuccinimidvl PEG: polyetylenglykol PEG-MM: norbornen-PEG makromonomer (også referert til som forbindelse B) Boltre: ring-åpning metatese polymerisasjon THF: tetrahydrofuran
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser GPC spor for en rekke BASPs fremstilt fra B1, B2 og B3. I alle tilfeller, de data illustrerer at øke ekvivalenter av tverrbinder (N) fører til en økning i størrelsen på BASP. Som observert i vårt tidligere rapport, 10 ekvivalenter av tverrbindingsmiddel er ikke tilstrekkelig til å oppnå ensartede BASPs, N = 10 eksempel viser en tydelig multi-modal GPC spor med en stor mengde av rest-børste polymer, spesielt i tilfellet med rørsukker MM B1 ( Figur 2a). Større mengder av tverrbindingsmiddel resulterer i ensartede MW fordelinger med svært lite rest-børste og MM. Vekten-gjennomsnittet molar masse (M w) omtrent dobles i går fra N = 15 - 20. I tilfellet med B3, ingen gjenværende MM, og mindre enn 1% gjenværende BI forblir for N = 15 og N = 20 tilfeller.
Figur 1. Skjematisk for børste-arm stjemepolymer (BASP) Syntese. Panel (a) illustrerer syntesen av Grubbs '3. generasjon bispyridine katalysator (A) fra kommersielt tilgjengelig Grubbs' 2. generasjon katalysator. Også vist er de strukturer av PEG-MM (B) tverrbindingsmiddel og (C) som brukes i dette arbeidet. Panel (b) viser et skjematisk diagram av børste-første prosessen. Polymerisering av PEG-MM (B) med katalysator (A) genererer en 10 enhet levende børste initiator (BI), som så blir overført til tverrbindingsmiddel (C) som resulterer i dannelse av en BASP. ig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Representative GPC resultatene av N = 10, 15, og 20 BASPs fremstilt fra forskjellige PEG MMS. Paneler (a), (b), og (c) fremstille data for MMS B1, B2 og B3, respektivt. Urenheter fra kommersielle PEG-NH 2, ikke reagert MM, og rest BI er merket med stjerner. M w og dispersitet indeks (d) Verdiene er gitt i de innfelte tabeller. Legg merke til at D-verdiene som oppnås ved GPC for høyt forgrenede nanostrukturer må vurderes nøye 24,25. Observasjonen av monomodal, ensartede topper antyder en snever fordeling av partikkelradius.tp_upload/50874/50874fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigste fordelen med pensel første BASP syntese er den unike evnen til å raskt syntetisere nanostrukturer av variert størrelse og sammensetning i parallell uten behov for spesialutstyr. I denne studie demonstrerer vi at børste første syntetiske metode med bruk av en norbornen funksjonalisert PEG makromonomer (B, figur 1) og en bis-norbornen nitrobenzyl-ester-tverrbinder (C, figur 1). De PEG kjeder fra B formidle vannløselighet til finalen BASP struktur. Den nitrobenzyl-baserte kryss kobling er Fotonedbrytbar.
Denne generelle fremgangsmåten kan modifiseres for andre exo-norbornen-baserte MMS og tverrbindingsmidler. Vi har forberedt BASPs fra flere kombinasjoner av begge. For eksempel har vi brukt norbornen-PEG-baserte MMS som bærer ulike anti-kreft narkotika, nitroxides, og Magnetic Resonance Imaging kontrastmidler 27. Vi har også brukt MMS består av andre enn PEG polymerer. I vår erfaring, kan børsten-første metoden brukes på nesten alle funksjonelle exo-norbornen imid avsluttet MM. I de tilfeller hvor høye konverteringer av MM til BI (> 95%) er ikke oppnådd, er en MM urenhet den mest sannsynlige årsaken (i motsetning til katalytisk aktivitet). Strengere rensing som er skissert i denne rapporten (prep-HPLC) vanligvis fører til vellykket boltre seg. Merk at vi ikke har forsøkt boltre polymerisasjoner med MMS som bærer ubeskyttede funksjonelle grupper som er kjent for å forstyrre katalysator A (f.eks frie aminer, olefiner, azider, etc.). Disse gruppene kan innføres etter at børste første syntese via post-polymerisasjon modifikasjon 27.. For eksempel har vi forberedt Azide-BASPs fra alkylhalid MMS som ble konvertert til azider etter BASP formasjon. Disse azider ble brukt for Cu-katalysert azid-alkyne cycloaddition "click &# 34; reaksjoner.
Vi ønsket å studere virkningen av MM renhet i mer detalj. Små mengder av rest-MM og BI ble alltid observert i GPC spor når børste-første reaksjoner ble utført ved hjelp av MM fremstilt fra kommersielt tilgjengelig PEG-NH 2 (B1, figur 2a). Vi hadde lært av erfaring at helt rene MMS generelt gi kvantitativ MM konvertering. Videre har vi hadde lagt merke til at mengden av gjenværende MM varieres avhengig av batchnummer kommersielt PEG-NH2. Vi har mistanke om at en ikke-fungerende PEG-NH 2 urenhet, kanskje rett og slett PEG diol, var ansvarlig for den tilsynelatende rest MM urenhet. Derfor benyttes vi prep-HPLC for å rense B1 for å gi ren MM B2 Figur 2b viser at denne renseprosess ble faktisk redusere mengden av gjenværende MM (orange star) omtrent to ganger,. Den ikke remove det helt. Interessant, ga B2 høyere konvertering av BI til BASPs så vel, kanskje en urenhet som førte til katalysator deaktivering ble fjernet via prep-HPLC. Fortsatt misfornøyd med mengden av rest MM, vi fulgte litteratur metoder for syntese av PEG-NH 2 via anioniske polymerisasjon av etylen oksid fra etanolamin (FORSIKTIG: Etylenoksyd bør håndteres av utdannede, erfarne kjemikere, det er et svært brannfarlig og eksplosiv , og giftig gass!). 22,23 MM forberedt fra denne hjemmelagde PEG-NH 2 (B3) ga bedre resultater i forhold til de kommersielle MMS. GPC-analyse av de tilsvarende BASPs viste ingen påvisbar rest-MM og meget lite (<1%) gjenværende BI (figur 2c). Dermed, hvis høy renhet BASPs kreves anbefaler vi å bruke et renest mulig MM. Legg merke til at rest-MM og BI kan lett bli fjernet frade større BASPs gjennom dialyse etter pensel første syntese.
Vi har også brukt andre enn C crosslinkers. For eksempel har vi forberedt BASPs fra bisnorbornene metallkomplekser, polymerisasjonsinitiatorer, syre cleavable linkere, og supramolekylære verter. Vi finner at crosslinkers med stive avstandsstykker mellom norbornenes tendens til å gi de mest ensartede BASPs; slike crosslinkers er mindre sannsynlighet for å gjennomgå intra syklisering reaksjoner som forbruker norbornenes men bidrar ikke til BASP vekst.
Uavhengig av MM og kryss kobling kombinasjon, finner vi følgende generelle praksis vil føre til høyest sjanse for pensel-første suksess. Først, før du prøver brush-første syntese med nysyntetiserte monomerer, anbefaler vi gjør DP = 10 børste polymer alene og muligens lengre pensel polymerer med DP = 25 og 50. Hvis disse testene er vellykket, er det en god sjanse for at børsten førstMetoden vil også være vellykket. For det andre, er det ideelle konsentrasjons for børsten første polymerisering avhengig av monomer kjemiske sammensetning og struktur av komponentene. Vi anbefaler å teste noen konsentrasjoner på liten skala før du gjør en stor gruppe med BASP. For det tredje, polymerisasjoner utført i diklormetan eller tetrahydrofuran synes å gi de beste resultater, monomerer som er løselige i disse løsningsmidler er ideelle. Som diskutert ovenfor, dersom tverrbindingsmiddelet er dårlig oppløselig i disse oppløsningsmidler anbefales det å legge til det som et faststoff i stedet for å legge til ekstra løsningsmiddel. Så lenge MM er oppløselig, finner vi at tverrbindingen gir den tverrbinder helt inn i løsningen i løpet av minutter. For det fjerde, selv om polymeriseringen krever ikke inerte betingelser, anbefales lagring av katalysatoren under inert atmosfære for å øke dens levetid. Viktigere, vil katalysatoren nedbrytes over tid i løsning, og den katalysatorløsningen bør fremstilles friskt fra Grubbs tredje generasjons catalyst hver gang en serie av tumle reaksjoner utføres. Endelig vil mengden av tverrbindingsmiddel som kreves for jevn BASPs variere vidt med tverrbindingsmiddel og MM struktur. Som vist i figur 2, er 10 ekv av tverrbindingsmiddel C ikke er tilstrekkelig til å gi fullstendig BI konverteringer. I andre tilfeller, finner vi at tilsetning av 1 ekvivalent av tverrbindingsmiddel, og til og med opp til 40 ekvivalenter, gir gode resultater. Hver gang et nytt tverrbindingsmiddel som skal anvendes, anbefales det å kjøre en serie med småskalareaksjoner med forskjellige N-verdier for å identifisere optimale tverrbindings mengder.
Som et siste notat, er det viktig erkjenne at mange alternative metoder finnes for å lage stjerneformede polymerer (kjerne-først, arm-first, etc.) 25, 26. Hver metode har ulemper og fordeler, for eksempel grenser for størrelse, rensekrav og funksjonelle gruppen kompatibilitet. Vi argumenterer for at den brede funksjonell gruppe toleranse for boltre seg,den enkle syntese av norbornen baserte funksjonelle monomerer, og evnen til å utføre tumle reaksjoner på Borstemmaskin hurtig, i parallell, og ved romtemperatur, få børste første tumle tilnærming verdt å ta hensyn til en rekke anvendelser. I fremtiden vil vi fortsette å utvikle denne metoden og BASP nanoarchitectures for ulike bruksområder, inkludert narkotika og genet levering, cellular bildebehandling, og selv-montering. Det fulle potensialet av disse nye partikler, og deres kapasitet for kombinatorisk syntese, har ennå ikke utforsket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker MIT Institutt for kjemi og MIT Lincoln Labs Advanced Concepts komité for støtte til dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grubbs Second Generation Catalyst | Materia (or Sigma Aldrich) | C848 (Sigma Aldrich: 569747) | Used as purchased from manufacturer. *Provided as a generous gift. |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 270970 | Used as purchased from manufacturer |
| O-(2-aminoethyl)polyethylene glycol 3000 | Sigma Aldrich | 07969 | Used as purchased from manufacturer |
| PEG-MM | N/A | N/A | Synthesized following reported procedures (Ref. 21, protocol 1) |
| norbornene-N-hydroxysuccinimidyl (NHS) ester | N/A | N/A | Synthesized following reported procedures (Ref. 21) |
| Bis-norb-NBOC Crosslinker | N/A | N/A | Synthesized following reported procedures (Ref. 21) |
| Pentane | Sigma Aldrich | 158941 | Used as purchased from manufacturer |
| Tetrahydrofuran (HPLC grade) | Sigma Aldrich | 34865 | Dried and purified over a solvent purification columns |
| Dichloromethane | VWR | BDH1113-4LG | Used as purchased from manufacturer |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Sigma Aldrich | 34998 | Used as purchased from manufacturer |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | A6283 | Used as purchased from manufacturer |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Used as purchased from manufacturer |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | Used as purchased from manufacturer |
| Dimethylformamide (HPLC grade) | Sigma Aldrich | 270547 | Used as purchased from manufacturer |
| Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | Used as purchased from manufacturer |
| MillQ Biocel A10 | Millipore | ||
| Beckmann Coulter HPLC (127p solvent module, 166p detector) | Beckmann Coulter | ||
| Zorbax 300SB-C18 PrepHT reverse phase column | Agilent | ||
| 1260 Infinity Liquid Chromatography | Agilent | ||
| GPC KD-806M column | Shodex | ||
| Dawn Heleos II Light Scatterer | Wyatt | ||
| Optilab T-rEX Refractive Index Detector | Wyatt | ||
| Glass Scintillation Vials - 40 ml | Chemglass | CG-4909-05 | |
| Glass Scintillation Vials - 4 ml | Chemglass | CG-4904-06 | |
| Glass Scintillation Vials (PTFE-lined cap) - 2 ml | Agilent | 5183-4518 | |
| Stir-bars | VWR | 5894x | various sizes |
| 13 mm 0.45 µm Nylon Syringe filter | PerkinElmer | 02542903 | |
| 13 mm 0.45 µm polytetrafluoroethylene syringe filter | PerkinElmer | 02542909 | |
| 1 ml disposable syringes | VWR | 53548-001 | |
| Swing bucket centrifuge or similar | Should be able to reach approximately 4,000 rpm | ||
| Round bottom flask | |||
| Fritted glass filter assembly | |||
| Rotary Evaporator | |||
| Balance |
References
- Bielawski, C. W., Grubbs, R. H. Living ring-opening metathesis polymerization. Prog. Polym. Sci. 32, 1-29 (2007).
- Hawker, C. J. The Convergence of Synthetic Organic and Polymer Chemistries. Science. 309, 1200-1205 (2005).
- Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat. Nano. 2, 751-760 (2007).
- Whitesides, G. M. Nanoscience, Nanotechnology, and Chemistry. Small. 1, 172-179 (2005).
- Leitgeb, A., Wappel, J., Slugovc, C. The ROMP toolbox upgraded. Polymer. 51, 2927-2946 (2010).
- Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Burts, A. O., Lim, Y. -H., Finn, M. G., Koberstein, J. T., Turro, N. J., Tirrell, D. A., Grubbs, R. H. Core-Clickable PEG-Branch-Azide Bivalent-Bottle-Brush Polymers by ROMP: Grafting-Through and Clicking-To. J. Am. Chem. Soc. 133, 559-566 (2010).
- Bielawski, C. W., Grubbs, R. H. Highly Efficient Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP) Using New Ruthenium Catalysts Containing N-Heterocyclic Carbene Ligands. Angew. Chem. Int. Ed. 39, 2903-2906 (2000).
- Love, J. A., Morgan, J. P., Trnka, T. M., Grubbs, R. H. A Practical and Highly Active Ruthenium-Based Catalyst that Effects the Cross Metathesis of Acrylonitrile. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 4035-4037 (2002).
- Lu, J. A., Johnson, Y. Y., Burts, A. O., Xia, Y., Durrell, A. C., Tirrell, D. A., Grubbs, R. H. Drug-Loaded, Bivalent-Bottle-Brush Polymers by Graft-through ROMP. Macromolecules. 43, 10326-10335 (2010).
- Burts, A. O., Li, Y. J., Zhukhovitskiy, A. V., Patel, P. R., Grubbs, R. H., Ottaviani, M. F., Turro, N. J., Johnson, J. A. Using EPR To Compare PEG-branch-nitroxide "Bivalent-Brush Polymers" and Traditional PEG Bottle-Brush Polymers: Branching Makes a Difference. Macromolecules. 45, 8310-8318 (2012).
- Bazan, G. C., Schrock, R. R. Synthesis of star block copolymers by controlled ring-opening metathesis polymerization. Macromolecules. 24, 817-823 (1991).
- Saunders, R. S., Cohen, R. E., Wong, S. J., Schrock, R. R. Synthesis of amphiphilic star block copolymers using ring-opening metathesis polymerization. Macromolecules. 25, 2055-2057 (1992).
- Buchmeiser, M. R., Wurst, K. Access to Well-Defined Heterogeneous Catalytic Systems via Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP): Applications in Palladium(II)-Mediated Coupling Reactions. J. Am. Chem. Soc. 121, 11101-11107 (1999).
- Weichelt, F., Frerich, B., Lenz, S., Tiede, S., Buchmeiser, M. R. Ring-Opening Metathesis Polymerization-Based Synthesis of CaCO3 Nanoparticle-Reinforced Polymeric Monoliths for Tissue Engineering. Macromol. Rapid Comm. 31, 1540-1545 (2010).
- Weichelt, F., Lenz, S., Tiede, S., Reinhardt, I., Frerich, B., Buchmeiser, M. R. ROMP-Derived cyclooctene-based monolithic polymeric materials reinforced with inorganic nanoparticles for applications in tissue engineering. Beilstein J. Org. Chem. 6, 1199-1205 (2010).
- Mayr, M., Mayr, B., Buchmeiser, M. R. Monolithic Materials: New High-Performance Supports for Permanently Immobilized Metathesis Catalysts. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3839-3842 (2001).
- Mayr, B. H., ölzl, G., Eder, K., Buchmeiser, M. R., Huber, C. G. Hydrophobic, Pellicular, Monolithic Capillary Columns Based on Cross-Linked Polynorbornene for Biopolymer Separations. Anal. Chem. 74, 6080-6087 (2002).
- Otani, H., Fujita, S., Watanabe, Y., Fujiki, M., Nomura, K. A Facile, Controlled Synthesis of Soluble Star Polymers Containing a Sugar Residue by Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP). Macromol. Symp. 293, 53-57 (2010).
- Nomura, K., Watanabe, Y., Fujita, S., Fujiki, M., Otani, H. Facile Controlled Synthesis of Soluble Star Shape Polymers by Ring-Opening Metathesis Polymerization (ROMP). Macromolecules. 42, 899-901 (2009).
- Gao, H., Ohno, S., Matyjaszewski, K. Low Polydispersity Star Polymers via Cross-Linking Macromonomers by ATRP. J. Am. Chem. Soc. 128, 15111-15113 (2006).
- Liu, J., Burts, A. O., Li, Y., Zhukhovitskiy, A. V., Ottaviani, M. F., Turro, N. J., Johnson, J. A. "Brush-First" Method for the Parallel Synthesis of Photocleavable, Nitroxide-Labeled Poly(ethylene glycol) Star Polymers. J. Am. Chem. Soc. 134, 16337-16344 (2012).
- Studer, P., Larras, V., Riess, G. Amino end-functionalized poly(ethylene oxide)-block-poly(methylidene malonate 2.1.2) block copolymers: synthesis, characterization, and chemical modification for targeting purposes. Eur. Polym. J. 44, 1714-1721 (2008).
- Mosquet, M., Chevalier, Y., Le Perchec, P., Guicquero, J. P. Synthesis of poly (ethylene oxide) with a terminal amino group by anionic polymerization of ethylene oxide initiated by aminoalcoholates. Macromol. Chem. Phys. 198, 2457-2474 (1997).
- Burchard, W. Solution properties of branched macromolecules. Adv. Polym. Sci. 143, 113-194 (1999).
- Gao, H. F. Development of Star Polymers as Unimolecular Containers for Nanomaterials. Macromol. Rapid Comm. , 722-734 (2012).
- Blencowe, A., Tan, J. F., Goh, T. K., Qiao, G. G. Core cross-linked star polymers via controlled radical polymerisation. Polymer. 50, 5-32 (2009).
- Burts, A. O., Liao, L., Lu, Y. Y., Tirrell, D. A., Johnson, J. A. Brush-first and Click: Efficient Synthesis of Nanoparticles that Degrade and Release Doxorubicin in Response to Light. Photochem. Photobiol. , (2013).
