Ce protocole décrit un procédé pour la collecte rapide d'images de jeunes plants d'Arabidopsis répondant à un stimulus de gravité en utilisant des scanners à plat disponibles dans le commerce. La méthode permet de peu coûteuse, la capture de gros volumes d'images haute résolution qui se prêtent à des algorithmes d'analyse en aval.
Les efforts de recherche en biologie exigent de plus en plus recours à des méthodes qui permettent la collecte de gros volumes de données à haute résolution. Un défi laboratoires peuvent faire face est le développement et la réalisation de ces méthodes. Observation des phénotypes dans un processus d'intérêt est un objectif typique des laboratoires de recherche qui étudient la fonction des gènes et ce qui est souvent atteint par la capture d'image. Un procédé particulier qui se prête à l'observation à l'aide des approches d'imagerie est la croissance d'une racine de correction des semis qui ont été déplacés à partir de l'alignement avec le vecteur de gravité. plates-formes d'imagerie utilisées pour mesurer la réponse de gravitropique racine peuvent être coûteux, relativement faible en débit et / ou de main-d'œuvre. Ces questions ont été abordées par le développement d'une méthode de capture d'image à haut débit en utilisant peu coûteux, mais de haute résolution, les scanners à plat. En utilisant cette méthode, les images peuvent être capturées toutes les quelques minutes à 4800 dpi. La configuration actuelle permet la collecte de 216 r individuelleesponses par jour. Les données d'image recueillies sont de grand qualité pour les applications d'analyse d'image.
Collecte de données phénotypiques haute résolution est utile dans les études visant à comprendre l'interaction entre la génétique et l'environnement dans la médiation de la fonction organismal 1,2. Les études de cette nature sont aussi intrinsèquement grande échelle, ce qui rend plus nécessaire que les méthodes employées pour mesurer les phénotypes dans ce contexte être riches en débit de 3,4. Dans l'établissement de méthodes de recherche phénomique échelle, compromis entre le débit et la résolution entrent en jeu. Les méthodes qui sont plus élevés en débit ont également tendance à être plus faible dans la résolution, ce qui rend plus difficile la détection de petits effets de la génétique ou de l'environnement 5. Alternativement, les méthodes qui mesurent plus attentivement un phénotype souhaité ont également tendance à être plus faible dans le débit, ce qui rend difficile de sonder les effets génétiques et environnementaux au sens large. En outre, les méthodes manuelles pour les phénotypes de quantifier, y compris l'inspection visuelle, peuvent être sujettes à des variations en raison des différences par l'hommeception 6.
Les technologies d'imagerie peuvent fournir une passerelle utile entre le débit et la résolution pour obtenir des observations phénotypiques 7-9. En général, une image est relativement facile à saisir, ce qui facilite le débit, et lorsqu'ils sont pris avec une résolution suffisante, les phénotypes peuvent être détectés subtiles 1,2,7. Les technologies d'imagerie ont tendance à être modifiables pour s'adapter à un système ou d'un processus d'intérêt et sont généralement évolutive 10-12. Pour cette raison, les technologies d'imagerie sont idéales pour le développement des études à grande échelle de la fonction organismal.
La réponse de la racine primaire à un stimulus de la gravité est un processus physiologique complexe qui se produit dans un organe morphologiquement simple. La réponse implique l'activation des voies qui se propagent à travers l'organe de racine et sa progression est déterminée par des facteurs génétiques et environnementaux, y compris les facteurs génétiques influencées par l'environnement 12-14 signalisation </sup>. La réponse de la racine primaire à un stimulus de gravité a été étudié au moins depuis Darwin, mais il ya beaucoup à apprendre sur la façon dont il fonctionne, en particulier dans les événements de signalisation précoces et dans les facteurs de médiation réponse plasticité 12,14,15. Acquérir une compréhension détaillée de la dynamique de cette réponse est important de trouver des façons d'améliorer la capacité des plants à devenir établi avec succès dans un environnement donné 16. En outre, la forme de la racine, il est prête pour les applications de traitement d'image 8,12,17. Dans l'ensemble, la racine réponse gravitropique est un système idéal pour le développement de la technologie d'imagerie à haut débit dans le but de mener des études de génomique niveau de la fonction organismal.
Dans ce rapport, un haut débit, la méthode à haute résolution pour la capture d'image de la réponse de gravitropique racine en utilisant peu coûteux, les scanners à plat disponibles dans le commerce est présenté. La vue d'ensemble de laprotocole est représentée sur la figure 1. Les semis plantés sur des plaques de gélose ont été positionnés sur les scanners à plat orientées verticalement équipés de supports personnalisés en plexiglas de la plaque. Les images ont été recueillies toutes les quelques minutes à 4800 dpi et sauvegardés sur un disque local ou un serveur de données. Métadonnées associées à chaque série d'image sont stockées sur une base de données et les images stockées sont traitées. L'approche utilise le logiciel VueScan pour la capture d'image. VueScan peut être utilisé pour exécuter plus de 2100 scanners différents sur Windows, Mac ou Linux (voir le tableau des matériaux). Une résolution du scanner de 4800 dpi a été utilisé dans cette application pour correspondre à la résolution obtenue dans des études antérieures utilisant des caméras CCD fixes 1,8,12. La flexibilité du logiciel VueScan avec l'interface commune qu'il utilise pour n'importe quel scanner il fonctionne permet aux utilisateurs d'adopter facilement pratiquement n'importe quel matériel de numérisation de la résolution suffisante pour le protocole présenté dans cet article. Le débit de courant permet la collecte d'216 réponses individuelles par jour. La technologie est adaptable et évolutif pour une utilisation dans des établissements allant des écoles secondaires aux universités de recherche. En outre, les images recueillies sont d'une qualité suffisante pour les applications d'analyse d'image.
Observation phénotypique précise est cruciale pour comprendre les manifestations de la fonction des gènes dans un organisme. Une façon d'acquérir de l'information phénotypique est grâce à la capture de données d'image à haute résolution. La plate-forme scanner développé a permis la collecte de nombreuses images (200 images / période de balayage) à haute résolution (4800 dpi) sur un certain nombre d'heures. En outre, cette plate-forme est facilement adapté à une variété d'environnements de laboratoire et de la classe en raison de la flexibilité du logiciel VueScan à exécuter des milliers de différents scanners utilisant une interface commune 18.
La méthode présentée ici comble un vide en haut débit de capture d'image qui s'étend de grandes installations de phénotypage à grande échelle et des systèmes automatisés réalisables dans un seul laboratoire. Les plates-formes à haut débit actuellement disponibles ont tendance à utiliser le matériel d'imagerie spécialisée, y compris les caméras montés sur des supports robotisés, de capturer des images à haute résolution de primarily-dessus des tissus végétaux au sol (par exemple Centre de technologie végétale intégrative et la ScanAlyzer HTS par LemnaTec) 20,21. Systèmes d'imagerie spécialisés à l'aide de rayons X et IRM technologies ont également été développés à l'image ci-dessous tissus au sol avec une résolution remarquable à mesure qu'ils grandissent dans l'environnement du sol (par exemple Centre de technologie végétale intégrative) 11,22,23. Ce développement de la technologie plus spécialisée est généralement au coût de débit, ce qui rend les études phénotypiques dynamiques plus difficile. Surtout, les besoins en matière de coûts et d'infrastructures pour ces plates-formes haut de gamme en font la plupart du temps impossible la mise en œuvre dans les petits laboratoires.
Plates-formes ont également été développés qui utilisent la technologie de capture d'image plus standard et sont bien adaptés à la mesure des réponses dynamiques tels que la réponse de la racine à un stimulus de gravité. Par exemple, les caméras CCD ont été utilisés pour capturer les réponses individuelles des semis à la lumière et de la gravité à hauterésolution spatiale et temporelle 1,8,12. D'autres systèmes ont été développés permettant la mesure de la pointe de la racine orientation des racines multiples à partir d'une seule image (par exemple RootTipMulti par la iPlant Collaboratif) 17,24. Dans le premier cas, le débit est relativement faible, étant donné que seulement une plantule est imagé par chaque caméra à la fois, alors que dans ce dernier cas, le débit est plus élevé, mais généralement au détriment de la résolution.
La procédure décrite dans ce document présente une plate-forme pour capturer des images haute résolution en haut débit avec des équipements et des logiciels qui sont facilement disponibles et relativement abordable. En utilisant cette configuration, 1080 réponses individuelles profondes peuvent être collectées chaque semaine dans un seul laboratoire équipé d'une banque de six scanners. En 15 mois de collecte une moyenne de 864 réponses individuelles par semaine, un total de 41 625 plants ont été numérisés pour une étude de la génomique. Environ 15% des collections individuelles a échoué en raison d'une erreur de configuration, les réseaéchec rk ou dysfonctionnement de l'équipement. Un autre réponses 22% ont échoué en raison de l'absence de germination ou la croissance des racines insuffisante pour provoquer une réponse de croissance. L'ensemble de données final est constitué de 27 475 réponses individuelles de semis à un stimulus de gravité de 163 lignées recombinantes ainsi que 99 lignes isogéniques. Les données ont été recueillies dans un seul laboratoire, ce qui en fait une approche très haut débit. Même étant donné que le matériel utilisé pour l'acquisition est relativement peu coûteux, il a fonctionné de manière fiable depuis plus de deux ans, même avec un usage intensif.
Bien que ce protocole a été très utile pour les objectifs de recherche de ce groupe, certaines limitations existent toujours. Parce que du débit d'environ 50 Go de données d'image non compressées par jour, il était évident qu'une grande quantité d'espace est nécessaire pour des images de la maison, sauf si les systèmes de compression efficaces pourraient être développés. Le problème de stockage a été temporairement résolu par l'achat de disques durs externes pour chaque ordinateur. En outre, les deux 1Dispositifs de stockage de réseaux associés 0 de la tuberculose ont été achetés. Plus tard, les algorithmes de compression ont été développés, comme décrit ci-dessus, ce qui peut aider à réduire la taille des données d'un maximum de 60% (figure 8). Il est important de noter que la vitesse à laquelle les données peuvent être enregistrées dans un dispositif de stockage associé au réseau est dépendante de la vitesse de la connexion de réseau. systèmes de compression ont également été limitée en raison de la volonté d'empêcher la perte de données d'image.
Autres limitations spécifiques à un système d'imagerie par balayage électronique sont également envisagées. Par exemple, dans une approche fondée scanner plants sont exposés à la lumière de haute intensité dans les plages blanches et potentiellement infrarouges pendant chaque balayage. Cela affecte probablement la croissance des semis, mais les semis peuvent encore être observées à subir des réponses solides à un stimulus de gravité (figure 7). Une amélioration future pourrait impliquer que seuls ces scanners LED infrarouges sont actifs programmation. Une zone en développemen actift est la création d'algorithmes d'analyse adaptée à la résolution et le débit de ces données d'image. Le grand ensemble de données généré à l'aide de cette méthode basée scanner a été idéal pour le développement d'outils robustes pour phénotypage à haut débit d'images de semis. L'algorithme de compression utilisé sur ces images montrées à la figure 7 prend en charge l'affirmation selon laquelle ils se prêtent à des applications d'analyse d'images. En outre, les images générées peuvent être analysées par l'algorithme précédemment publiées, RootTrace 17,24, s'ils sont recueillis à une résolution plus faible (moins de 1 200 points par pouce), et les semis individuels sont segmentés à partir de l'image en utilisant l'algorithme de compression décrit ci-dessus avant l'analyse. données sur la croissance des racines pourraient être extraites des images réduites à 1200 dpi tandis que les données d'angle de pointe pourraient être extraites des images réduites à 900 dpi (observation non publiée).
La procédure décrite dans le présent document s'inscrit dans sa propre niche dans le monde de root imagerie en ce qu'il est à haut débit et haute résolution tout en restant relativement abordable. Un avantage supplémentaire de cette approche est qu'il peut facilement être personnalisé pour répondre aux besoins d'imagerie d'un groupe de recherche particulier.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par une subvention de la National Science Foundation (numéro d'attribution IOS-1031416) et a été menée en collaboration avec Nathan Miller, Logan Johnson et Edgar Spalding de l'Université du Wisconsin et Brian Bockelman, Carl Lundstedt et David Swanson de la Université de Hollande Centre de Calcul du Nebraska.
Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |