Summary
Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen düz yataklı tarayıcı kullanılarak bir yerçekimi uyarana yanıt Arabidopsis fide görüntülerin hızla toplanması için bir işlemi tarif etmektedir. Yöntem aşağı analiz algoritmaları için mükellef yüksek çözünürlüklü görüntüleri, ucuz, yüksek hacimli yakalamak için izin verir.
Abstract
Biyoloji araştırma çabaları giderek daha yüksek çözünürlüklü verilerin yüksek hacimli toplamayı sağlayan yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Laboratuarlar yüz olabilir bir meydan okuma bu yöntemlerin geliştirilmesi ve başarıdır. Ilgi sürecinde fenotipleri Gözlem gen işlevini okuyan araştırma laboratuarları tipik bir hedefi olduğunu ve bu genellikle görüntü yakalama yoluyla elde edilir. Görüntüleme yaklaşımlar kullanılarak gözlem için uygun olan özel bir işlem olup, ağırlık vektör ile aynı hizada yerinden edilmiş bir fide kökünün düzeltici büyümesidir. Kök gravitropic tepkisini ölçmek için kullanılan görüntüleme platformlar, pahalı verim nispeten düşük ve / veya emek yoğun olabilir. Bu sorunlar, ucuz, ancak yüksek-çözünürlüklü, masaüstü tarayıcılar kullanarak yüksek verim görüntü yakalama yöntemini geliştirerek ele alınmıştır. Bu yöntemi kullanarak, görüntüler 4.800 dpi her birkaç dakikada yakalanabilir. Geçerli kurulum 216 bireysel r toplanmasını sağlayanGünde esponses. Toplanan görüntü verileri görüntü analiz uygulamaları için yeterli kaliteye sahip.
Introduction
Yüksek çözünürlüklü fenotipik veri toplama organizma işlevi 1,2 aracılık genetik etkileşimi ve çevresini anlamasını amaçlayan çalışmalarda yararlıdır. Bu tür çalışmalar, ek gerekli bu bağlamda fenotipleri ölçmek için kullanılan yöntemler, yüksek verim 3,4 olması yapımında, ölçek de doğal olarak büyüktür. Phenomics ölçekli araştırma yöntemleri kurulmasında, hacmi ve çözünürlük arasında makasına devreye girer. Geçirilendeki yüksek yöntemler de daha zor genetik ve çevre 5 küçük etkileri algılamak için yapım, çözünürlük düşük olma eğilimindedir. Alternatif olarak, daha dikkatli arzu edilen bir fenotip ölçen yöntemler de zor geniş genetik ve çevresel etkilerini anket yapma, verim düşük olma eğilimindedir. Ayrıca, görsel inceleme dahil miktarının fenotipleri, için manuel yöntemler nedeniyle insan Başı farklılıklara varyasyon konusu olabilirception 6.
Görüntüleme teknolojileri fenotipik olarak gözlem 7-9 elde hacmi ve çözünürlük arasında yararlı bir köprü sağlayabilir. Genel olarak, bir görüntü hacmi kolaylaştıran yakalamak için nispeten kolaydır, ve yeterli çözünürlükte alındığında, ince fenotipleri 1,2,7 tespit edilebilir. Görüntüleme teknolojileri ilgilendiren bir sistemi ya da süreci uygun değiştirilebilir olma eğilimindedir ve genellikle 10-12 ölçeklenebilir. Bu nedenle, görüntüleme teknolojileri organizma işlevi büyük ölçekli çalışmalar gelişimi için idealdir.
Bir ağırlık uyarıcı birincil kök cevabı, morfolojik olarak basit bir organ içinde meydana karmaşık bir fizyolojik bir süreçtir. Tepki kök organı yoluyla yaymak ve ilerleme ortamı 12-14 etkisinde genetik faktörler de dahil olmak üzere çevresel ve genetik faktörler tarafından belirlenir sinyal yollarının aktivasyonunu içerir 12,14,15 aracılık faktörler vardır. Bu yanıtın dinamiklerinin ayrıntılı bir anlayış kazanıyor başarıyla belirli bir ortamda 16 içinde kurulmuş olmak için fidan yeteneğini geliştirmek için yollar bulmak önemlidir. Buna ek olarak, kök şekli müsait görüntü işleme uygulamaları 8,12,17 için yapar. Birlikte ele alındığında, kök gravitropic tepki organizma fonksiyonu genomik düzeyinde çalışmalar yürütülmesi amacıyla yüksek verimli görüntüleme teknolojisinin gelişimi için ideal bir sistemdir.
Bu raporda, ucuz, piyasada mevcut dorse tarayıcıları kullanarak kök gravitropic tepki görüntü yakalamak için yüksek verimlilik, yüksek çözünürlüklü bir yöntem sunulmaktadır. Bir bakışprotokol, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Agar plakaları üzerinde dikilen fidanları özel pleksiglas plaka sahipleri ile donatılmış dikey odaklı dorse tarayıcılar üzerinde konumlandırıldı. Görüntüler 4,800 dpi her birkaç dakikada toplanan ve yerel bir sürücü veya veri sunucu üzerinde kaydedildi. Her resim serisi ile ilişkili metadata bir veritabanında saklanır ve saklanan görüntüler işlenir. Yaklaşım, görüntü yakalama için birisidir yazılımı kullanır. VueScan (Malzeme bkz. Tablo) Windows, Mac veya Linux işletim sistemleri üzerinde 2.100 farklı tarayıcılar çalıştırmak için kullanılabilir. 4.800 dpi bir tarayıcı çözünürlüklü sabit kameralar CCD 1,8,12 kullanarak daha önceki çalışmalarda elde çözünürlüğü maç bu uygulamada kullanılmıştır. Ortak bir arayüz ile birlikte birisidir yazılımının esnekliği kullanıcıların kolaylıkla bu yazıda sunulan protokole yeterli çözünürlükte hemen her tarayıcı donanım benimsemeye olanak çalışan herhangi bir tarayıcı için kullanır. Cari çıktı toplanması için izin verirGünde 216 bireysel yanıtları. Teknolojisi üniversitelere araştırma için yüksek okullardan değişen kurumlarda kullanım için uyarlanabilir ve ölçeklenebilir. Ayrıca, toplanan görüntülerin görüntü analiz uygulamaları için yeterli kalitede.
Protocol
1.. Görüntü Alma Protokolü
Hususlar:
Tek başına çalışması için mümkün olmasına rağmen, bu protokol, en verimli şekilde, iki kişi ile gerçekleştirilir. Bu laboratuvarda en iyi çalışan düzenleme tarayıcı kurulumu başka eserler, daha sonra her iki tarayıcılar tabak yerleştirin ve tarama işlemini başlatmak için birlikte çalışırken tarama plakaları hazırlamak için bir kişi için oldu.
Bu projede tarayıcılar dikey tarayıcı kapakları tarayıcının arkasındaki dinlenme yönlenmişlerdir unutmayın de önemlidir. Bir özel destek bu dikey pozisyonda yemekleri tutmak için yapılmış ve 3M Command Şeritler ile dorse yüzey (Şekil 2) yapıştırılmış edildi. Bu protokol (bir Epson V700) kullanılan tarayıcı ile geliyor çıkarılabilir belge kapağı siyah keçe ile bir tarafta kaplı. Belge kapağı bir bungee kablosu ile Flatbed'den karşı yerleştirildiyerinde tabak tutun ve görüntü kontrastını (Şekil 3) sağlamak için.
Yeterli çözünürlükte herhangi bir tarayıcı görüntü yakalamak için kullanılan olabilir. Epson Perfection V700 çünkü yatak ve kapak hem tarama ve kızılötesi kanalını kullanmak için, kendi kare profil (kolay dikey pozisyon verme), yüksek çözünürlük ve ek seçenekler seçildi. Bu ek seçenekler bu protokolde kullanılan değildi.
Plakalar, büyüme odasına kaldırıldı sonra, bu protokol sonuna kadar devam şarttır.
Tabaka preparasyonu
Şeffaf bir ortam 10 ml ve her bir levhanın ortasında ekilmiş 9 tohum içeren standart Petri kutuları kullanıldı. : Levha etiketleme, medya hazırlanması ve dikim için prosedürler bulunabilir http://www.doane.edu/doane-phytomorph
- Kimwipe ile kapak Triton X-100 (deterjan) uygulayın - cömert olmak.
(Triton X-100 plaka tarama gibi kapağın üzerinde yoğunlaşma oluşumunu önlemeye yardımcı olur unutmayın. Cömert bir uygulama (yeterince kapak yüzeyinde bir film tabakası oluşturmak için) kapak tüm tarayıcı çalışma boyunca şeffaf kalır emin olun yardımcı olacaktır .) - Kapağı sabitlemek için mikro gözenekli bant ile plaka sarın ve havalandırma için.
Tarayıcı Kurulumu ve Resim Koleksiyonu
Bu protokol daha 1 tarayıcı kullanılmakta olduğunu varsayar, ve tek bir bilgisayarda birden fazla tarayıcı başlatmak için gerekli talimatları içerir.
- Her tarayıcı görüntüleri depolamak için klasörler oluşturabilirsiniz. Her tarayıcı iki tabak tutun, böylece klasör oluştururken aklınızda bu devam edecektir. Bir, benzersiz her plaka için kimlikleri, fide yaş, tohum büyüklüğü ve dikilen stokların kimlikleri gibi dosya adının bileşenleri olarak meta kullanmayı seçebilirsiniz. Bu meta verileri içeren veri toplamada kullanılan bir klasör adının bir örnek "1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79-161" olduğunu.
- Belirlenen toplama zaman çıkış sürelerini ayarlayın (9 saat bu laboratuvarda kullanılmıştır). Hazırlanması için ekstra zaman (bir saat ya da öylesine) ayarlamak için emin olun.
VueScan yazılım bir kullanıcı tekrar tekrar görüntüleri toplamak için izin verir iken (. Tarayıcılar toplama süresini ayarlamak için çıkış sayaçları takılı olması gerektiğini unutmayın, bu kullanıcı belirtmek için izin vermiyor kaç toplamak için görüntü veya nasıl görüntüleri toplamak için uzun .) - İlk tarayıcı açın ve ilk sıcak-up geçmesi tarayıcı için yaklaşık 10 saniye bekleyin.
- Kez VueScan programını açın. VueScan sürüm 9.0.20 (Malzeme bkz. Tablo) Bu protokolde kullanılan, ama daha yeni sürümleri küçük modific ile kullanılabilirtirme. 'Daha' düğmesine aşağıda açıklanan menü seçeneklerini görüntülemek için kullanıcı arayüzünün alt panelinde basılı olduğundan emin olun.
- Otomatik tekrar ayarlayın: açılır kutusunda none set Önizleme alanında Girdi sekmesi altında ve Crop sekmesi altında: Maximum (Şekil 4). Basın 'Önizleme'.
- Tıklayın ve önizleme görüntüsünün faiz bölgede sürüklemek için fareyi kullanarak ilgi bölgeyi ele verecek bir kırpma kutusu oluşturun. Ayarlar Crop sekmesine ilgi bölge için değişmiş olabilir. Kırpma kutusu için kullanılan tipik ayarları şu şekildedir: 0,675 x-ofset, y-telafi, bu her bir tarayıcı için fide alan yakalamak için ayarlandı se olarak 1,924. Kullanılan kırpma kutusu boyutu (Şekil 5) uzun boylu 1.1 genişliğinde yılında 7.246 oldu.
- Fare ile sürüklerken Kırpma kutusunu taşımak için, Shift tuşunu basılı tutun. Kırpma kutusunun tüm taranacak fidan artı bir etiket (Şekil 5) içerdiği olabilecek herhangi bir istenen meta içerdiğinden emin olun.
- Crop sekmesinde, Önizleme alanını ayarlayın: Mahsul kutusu ve basın 'Önizleme' için.
- Çıktı sekmesine gidin ve tarayıcı için doğru dosyayı (Şekil 5) seçin.
- Tekrar bir bilgisayar için tüm tarayıcılar üzerinde 1,7-1,12 adımlar. VueScan birden fazla örneğini açmak isteyip istemediğiniz sorulduğunda 'evet' seçeneğini seçin.
- Her sekmede geçmesi ve ayarların doğru olduğunu doğrulamak. (Tüm özellikler görüntü renk, çözünürlük, vb dahil olmak üzere bireysel laboratuvar ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir olduğunu unutmayın. Ancak, bu protokolde kullanılan ayarlar doğrudan pa uygulanabilirrticular nedeniyle birisidir yazılımın ortak bir arayüz için belirli bir laboratuar tarama donanımı. VueScan 9.0.20 sürümünü kullanarak bu projede kullanılan parametreleri) görüntülemek için ekli özellikleri listesine bakın.
- Giriş sekmesinde Otomatik tekrar Sürekli seçin: alanına, ya da istenirse daha uzun görüntüler arasında zaman aralığını seçin. Zaman aralığı tarayıcı son görüntü kaydetme ve sonraki görüntü koleksiyonu başladıktan sonra durakladığı sürenin uzunluğudur. Sürekli modda, 3-4 dk çözünürlük 4800 dpi elde edilebilir.
- Tekrar tek bir bilgisayara bağlı tarayıcılar kalanı için 1,14-1,15 adımları.
- Yatay odaklı fide ile doğru tarayıcılar (gravistimulate yok) hazırlanan tabak yerleştirin.
- Geçici olarak pleksiglas şablondan düşmez böylece plakaların karşı arka keçe, bir siyah koyun. Tüm tarama için tekrarlayınners.
(Not: Bu projede, keçe siyah adet belge parlamayı önlemek ve kök dokularına karşı kontrast sağlamak için ekipman ile sağlanan kapakları bağlanmıştır kullanılan spesifik bir arka plan rengi doku görüntülü rengine bağlıdır.). - Bir kişi (plakaları bu protokolde yönünün tersine döndü edildi) plakaları 90 ° çevirin ve hemen keçe arka plan değiştirmek var.
- Hemen 'Tarama' düğmesine basın böylece diğer kişinin bilgisayarında ayakta olmalıdır.
- Bungee kablosu (Şekil 3) ile tarayıcıya arka sabitleyin. Bir kişi başka pozisyonları bungee kablosu süre yerde arka tutacak.
(Not: Derhal gravistimulation (90 °, levhaların dönme) ve keçe arka yerleştirme sonra, 'Tarama' basılmalıdır.) - Tekrar tek bilgisayarlar üzerindeki tarayıcılar kalanı için 1,17-1,21 adımlarıer.
- Tekrar varsa tarayıcıların sonraki set için 1,6-1,22 adımları.
- Birkaç görüntü, doğru tasarruf emin olmak için toplanıncaya kadar tarayıcılar bırakmayın.
- Bu belirlenen tarama zamanı için rahatsızlıklarının ücretsiz olacak bir alanda tarayıcılar tutmak için idealdir. İdeal fenotipik yanıtları sağlamak için tarama alanında çevresel koşulların dikkate de isabetli olmuştur.
- Veri toplama tamamlandığında, her tarayıcı ile çakışmaktadır her verenler pencerede yeşil iptal butonuna basın.
- Bilgisayardaki tüm programları kapatmak.
- Bilgisayarı yeniden başlatın ve görüntü koleksiyonun bir başka tur başlamadan önce tüm tarayıcıları kapatın.
Representative Results
Temsilci Görüntüler
Bu yaklaşım Arabidopsis fide büyüme yüksek çözünürlüklü zaman serilerinin hızlı üretimini sağlar. Bir tarayıcı çalıştırmak ilk ve son görüntüleri Şekil 7A ve 7B gösterilmiştir. 7C ve 7D tam bir tarayıcı görüntünün yarısından itibaren en iyi sonuçları göstermektedir. Görüntü kalitesini etkileyen bazı konular Şekil 7A ve 7B gösterilmiştir. Bu konular çimlenme varyasyonu, koşmak başında büyüme yörünge fide varyasyon, ve tarama sırasında yoğuşma oluşumunu içerir. Yoğunlaşma, büyük ölçüde plaka kapağının içine uygulanan Triton X-100'ün miktarını arttırarak çözülebilir. Doğru bir görüntü toplama engelleyebilecek diğer faktörlerin kırpma kutusunun göre eğik olacak şekilde, plaka pozisyon ve konumlandırma plakaları ile ilgili olarak ürün kutusunun doğru konfigürasyonu vardır.
Görüntü Analizi Uygulama: Görüntü Sıkıştırma
Tarayıcı görüntülerin bir zaman dizisi elde edildikten sonra, güvenli bir şekilde görüntü analizi kolaylaştırmak için bir ağ erişilebilir bir şekilde muhafaza edilmelidir. Tek bir tarayıcı çalıştırmak ile ilgili görüntü dosyaları sabit disk alanı önemli miktarda işgal. 4,800 dpi toplanan tek bir TIFF dosyası yaklaşık 220 MB olan ve tipik bir tarayıcı çalıştırmak 200 görüntü dosyaları oluşturur. Bu nedenle, sabit disk alanı yaklaşık 44 GB çalıştırmak başına gereklidir. Görüntü analizi ile ilişkili depolama ve ağ iletim maliyetlerini azaltmak için aynı anda veri kaybını en aza indirirken, görüntü verilerini saklamak için gerekli alan miktarını azaltmak tercih edilir. Mansap analizi deneysel bir çalışma ile ilişkili takip eden görüntü dosyaları her fide belirlenmesini içerecektir. Bu nedenle, tarayıcı görüntüden tek bir ağaç fideleri segmentlere aşağı analizini kolaylaştırabilir. Çünkü uzakta th kalanından fidenin segmentasyone görüntüsü de önemli ölçüde gereksiz arka plan piksel depolama azaltabilir, bu yaklaşım aynı zamanda veri boyutunda önemli bir azalmaya yol açar. Aşağı analiz kök dokusunda odaklanmış Ayrıca, eğer bu kök piksel kendi renk alanı nispeten dar olduğundan renk bilgileri korumak için gerekli olmayabilir. Bir bilgisayar görüntü işleme protokolü ve hem bireysel hem de fide çıkış segmentlere ve gri skala görüntüleri dönüştürerek veri boyutunu azaltmak için kod geliştirilmiştir. Bu yaklaşım depolama alanı şartları içinde% 60 azalma ile sonuçlanır.
Bu veri sıkıştırmasını elde etmek için kullanılan bir iş akışı, aşağıdaki adımlarda tarif edilmektedir:
- Tek bir klasörde tarayıcı görüntü dosyaları bir zaman serisi ile başlayın.
- Her görüntü için, (Şekil 8, üst) gri skala bir RGB dönüştürmek.
- Sağ ve sol tarafta içine görüntüyü bölünmüş.
- Kendi dosyasında (Şekil 8) içine resimdeki her bir fide ekstrakte edin.Bu siyah ya da beyaz ve daha sonra her görüntü satırın toplam piksel yoğunluğunu hesaplamak için piksel dönüştürmek için bir eşik uygulanarak yapılır. Yüksek yoğunlukla satır tanımlanır ve her bir piksel 'bitki' veya komşularının yoğunluğuna dayalı 'nonplant' olarak sınıflandırılır. Bu satırda, her bir 'bitki' merkezi bulunan ve bu noktadan önceden belirlenmiş boyutta bir kırpma kutusu (Şekil 8, alt) çizilir.
- Bireysel zaman serisi görüntü dosyaların depolanması için her fidan için ayrı alt klasörler ile görüntü (sol ve sağ) her tarafı için ayrı bir klasör oluşturun.
- Sıkıştırılmış ZIP dosyası içine çıkan klasörleri arşivle.
Bu adımları gerçekleştiren bir kod programlama dili Python 20 kullanılarak geliştirilmiştir. Algoritma veri boyutu yaklaşık% 60 azalma sağlar ve tarayıcı imag% 90 tüm bireysel fide tanımlamada başarılıdıre içerik şimdiye kadar analiz edilmiştir. Kodlar (Malzeme bkz. Tablo) GNU Genel Kamu Lisansı Sürüm 3 altında indirmek için serbestçe kullanılabilir.
Şekil 1. Tarama işlemleri, tohum ekimi (plaka başına kadar dokuz Arabidopsis tohum) ile başlar ve veri depolama ve görüntü işleme ile biter. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Petri destek inşaatı için Şekil 2. T emplate. Ple xiglas genişliği (bu durumda 227 mm olarak) düz yatak uygun şekilde kesilir ve uzunluğu 128 mm oldu. Bir 88 mm çaplı iki daire dengeli bir şekilde, desteğin genişliği ve uzunluğu boyunca dağıtılmıştır, öyle ki, kalan parçanın kesilip ayrılmıştır. Destek 3M Command Şeritler ile Flatbed'den yapıştırılmış edildi. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Fidan gravistimulated edilmiş ve belge kapağı yerleştirilmiş Şekil 3.. Tarayıcı yapılandırması sonra. Bu Tarayıcı Kurulumu ve Resim Koleksiyonu adımda 1.21 de tarayıcının yapılandırması."_blank"> Büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Tarayıcı Kurulumu ve Resim Koleksiyonu Aşama 1.8 için seçilmiş ayarları Şekil 4. Screen shot. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Mavi kutu fo özel ayarları vurgular iken Şekil 5.. Adımda 1.9 ve Tarayıcı Kurulum ve Resim Koleksiyonu 1.10 sırasında birisidir yazılımın ekran görüntüsü. Kırmızı kutu kırpma boyutunu vurgulamaktadır r x-ve y-telafi fide ve etiket bilgi yakalamak için kullanılır. Taranacak Flatbed'den bölgesi Önizleme alanında bir noktalı çizgi olarak gösterilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 6.. Tarayıcı Kurulumu ve Resim Koleksiyonu adım 1.12 hedef klasörün seçimi. Yanındaki Varsayılan Klasör iletişim kutusunda (kırmızı ok) @ düğmesine basıldığında kullanıcı uygun hedef klasörü seçmek için izin verir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
7 re "fo: İçerik-width =" "fo: src =" 5in / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 7, (AD). Yukarıdaki görüntüler bu yazıda anlatılan yöntem kullanılarak toplanmıştır bu örnekleridir. Paneller A, B, C, D, tek bir tarama süresi sırasıyla ilk ve son görsel vardır. A, B göstermektedir tam C, D, tek bir plaka gösteren, taranan alanın kırpılmış bir bölge iken, bölgeyi taradı. Çeşitli tutarsızlıklar görülebilir. Panel A çimlenme ve büyüme yörünge değişimini göstermektedir. Panel B (Görüntü A olarak aynı fideler; 9 saat sonra) plakalar yoğunlaşmayı birikebilir olduğunu göstermektedir. Panel C ve D güçlü büyüme o dolayı iyi sonuç olarak kabul edilirf fidan ve çalışma boyunca görüntü kalitesi. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 8. Geliştirilen görüntü sıkıştırma algoritması ölçeğini (üst) gri bir tarayıcı görüntü dönüştürür. Görüntü sağ ve sol yarıya bölünür ve görüntü sınırları (gösterilmemiştir) kaldırılır. Her yarım tek tek fidan pozisyonları en büyük toplam piksel yoğunluğuna sahip satır bularak tanımlanır. Bu pozisyonları plakası (alt) tüm fidan uygulanan yeni bir kırpma alanı tanımlamak için kullanılır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Discussion
Doğru fenotipik gözlem bir organizma içinde, gen fonksiyonunun anlaşılması belirtileri için çok önemlidir. Fenotipik bilgi elde etmek için bir yolu, yüksek çözünürlüklü görüntü verisi yakalama geçer. Geliştirilen tarayıcı-tabanlı platform birkaç saat üzerinden yüksek çözünürlüklü (4.800 dpi) birçok görüntü koleksiyonu (200 images / tarama periyodu) sağladı. Buna ek olarak, bu platform nedeniyle kolaylıkla ortak bir arayüz 18 kullanılarak farklı tarayıcı binlerce çalıştırmak için birisidir yazılımın esnekliği ve laboratuar sınıf ortamlarda çeşitli şekilde uyarlanmıştır.
Burada sunulan yöntem, büyük ölçekli fenotipleme tesisleri ve tek bir laboratuvarda uygulanabilir otomatik sistemlere kadar uzanan yüksek verimli görüntü yakalama bir boşluğu doldurur. Mevcut yüksek verimli platformlar p yüksek çözünürlüklü görüntü yakalamak için, robotik destekler üzerine monte edilmiş kameralar da dahil olmak üzere özel görüntüleme donanımları, kullanma eğiliminderimarily toprak bitki dokularında (LemnaTec tarafından Bitki Bütünleştirici Teknoloji ve Scanalyzer HTS örneğin Merkezi) 20,21 üstünde. Onlar toprak ortamında (Bitki Bütünleştirici Teknoloji örneğin Merkezi) 11,22,23 büyüdükçe X-ray ve MR teknolojilerini kullanarak özel görüntüleme sistemleri de olağanüstü çözünürlük ile zemin dokuları görüntü aşağıda geliştirilmiştir. Daha özel teknoloji Bu gelişme dinamik fenotip çalışmaları daha zor hale throughput pahasına genellikle. Önemlisi, bu high-end platformları için maliyet ve altyapı ihtiyaçları küçük laboratuarlarda uygulanması için onları çoğunlukla olanaksız hale.
Platformlar da daha fazla standart görüntü yakalama teknoloji kullanımı ve de bu tür bir ağırlık uyarıcıya kök yanıt olarak dinamik yanıtların ölçümü için uygun olan geliştirilmiştir. Örneğin, CCD kameraları, yüksek ışık ve yerçekimine bireysel fide yanıtları yakalamak için kullanılmıştıruzaysal ve zamansal çözünürlük 1,8,12. Diğer sistemler tek bir görüntü (iPlant İşbirlikçi örn RootTipMulti) 17,24 birden köklerinin kök ucu yönelim ölçümüne izin geliştirilmiştir. İlk durumda, verim nispeten düşük ikinci durumda çıkışı daha yüksek iken, sadece bir fide bir anda her kamera tarafından görüntüsü olduğu göz önüne alındığında, ama genellikle çözünürlük pahasına edilir.
Bu yazıda özetlenen prosedür ekipman ve kolayca kullanılabilir ve nispeten uygun fiyatlı yazılımı ile yüksek verim, yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalamak için bir platform sunuyor. Bu kurulumu kullanarak, 1.080 bireysel kök reaksiyonları altı tarayıcıların bir banka ile donatılmış tek bir laboratuarda her hafta toplanan olabilir. Haftada 864 bireysel tepkilerin ortalama toplama, 15 ay, 41.625 fidan toplam bir genomik çalışma için tarandı. Bireysel koleksiyonların yaklaşık% 15 nedeni kurulum hatası, netwo başarısızrk hatası veya ekipman arızası. Başka bir% 22 yanıtları bir büyüme tepkisi nedeniyle çimlenme veya yetersiz kök büyüme eksikliği başarısız oldu. Nihai veri seti 163 rekombinant kendilenmiş hatların bir yerçekimi uyarana 27.475 bireysel fide tepkileri artı 99 izogenike yakın çizgiler oluşur. Veriler, bu çok yüksek verimli bir yaklaşım yapma, tek bir laboratuarda toplanmıştır. Hatta edinimi için kullanılan ekipman bile ağır kullanımı ile iki yıldır güvenilir bir işlevi vardır, nispeten ucuz olduğu göz önüne alındığında.
Bu protokol, bu grubun araştırma amaçları için çok yararlı olsa da, yine de bazı sınırlamalar vardır. Çünkü günde sıkıştırılmamış görüntü verisi yaklaşık 50 GB throughput, etkili sıkıştırma programları geliştirilmiştir olabilir sürece alanı büyük miktarda ev görüntüleri için gerekli olduğu belli oldu. Depolama sorunu geçici olarak her bilgisayar için harici sabit diskler satın alarak çözüldü. Buna ek olarak, iki adet 10 TB ağ bağlantılı depolama cihazları satın alındı. Yukarıda açıklandığı gibi, daha sonra, sıkıştırma algoritmaları kadar% 60 (Şekil 8) ile veri boyutunu azaltmaya yardımcı olabilir, geliştirilmiştir. Bu verileri bir ağ bağlantılı depolama aygıtına kaydedilebilir hangi hızda ağ bağlantısının hızına bağlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Sıkıştırma programları nedeniyle de görüntü veri kaybını önlemek için arzu kısıtlı olmuştur.
Bir tarayıcı tabanlı görüntüleme sistemine özgü diğer sınırlamalar da kabul edilmektedir. Örneğin, bir tarayıcı-tabanlı yaklaşım fidanları her tarama sırasında beyaz ve potansiyel kızılötesi aralıkları yüksek şiddette ışığa maruz kalmaktadır. Fideler hala (Şekil 7), bir yerçekimi uyarana sağlam yanıtları geçmesi görülebilir ama bu büyük olasılıkla, fide büyümesini etkiler. Bir gelecekteki gelişim sadece kızılötesi LED aktif böyle tarayıcıları programlama içerebilir. Aktif developmen bir alant de bu görüntü verilerinin çözünürlük ve verimi eşleşen analiz algoritmaları oluşturulmasıdır. Bu tarayıcı-tabanlı bir yöntem kullanılarak oluşturulan büyük veri seti fide görüntüleri yüksek verimlilik fenotipleme için güçlü araçlar gelişimi için ideal olmuştur. Şekil 7'de gösterilen bu görüntüler üzerinde istihdam sıkıştırma algoritması, görüntü analiz uygulamaları için uygun olduğu iddiasını destekler. Ek olarak, üretilen görüntüler daha düşük çözünürlük (en az 1200 dpi) toplanır ise, daha önce yayınlanmış bir algoritma, RootTrace 17,24 ile analiz edilebilir ve fide analizden önce, yukarıda tarif edilen sıkıştırma algoritması kullanılarak resimdeki bölümlenmiştir. Kök büyüme verileri ucu açısı veri 900 dpi (yayınlanmamış gözlem) indirgenmiş görüntüleri elde edilebilir ise 1,200 dpi indirgenmiş görüntüleri elde edilebilir.
Bu yazıda özetlenen prosedür Roo dünyasında kendi niş sığarhala nispeten uygun fiyatlı olurken, yüksek verimlilik ve yüksek çözünürlükte olduğundan t görüntüleme. Bu yaklaşımın bir başka yararı da kolayca belirli bir araştırma grubu görüntüleme ihtiyaçlarını karşılamak için özelleştirilebilir olmasıdır.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (ödül sayısı IOS-1031416) bir hibe ile finanse edildi ve Nathan Miller, Logan Johnson ve Wisconsin Üniversitesi'nden Edgar Spalding ve Brian Bockelman, Carl Lundstedt ve David Swanson ile işbirliği içinde yapılmıştır Nebraska Holland Hesaplama Merkezi Üniversitesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | - |
| Plexiglas Scanner Template | - | - | Custom made. See Figure 2. |
| Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
| Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
| VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
| Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
| 3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | - |
| Holding racks | - | - | Custom made by gluing two cookie racks together. |
References
- Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation. Genetics. 186, 585-593 (2010).
- Clack, N. G. Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents. PLoS Comp. Biol. 8, (2012).
- Lussier, Y. A., Liu, Y. Computational approaches to phenotyping: high-throughput phenomics. Proc. Am. Thoracic Soc. 4, 18-25 (2007).
- Houle, D. Colloquium Paper: Numbering the hairs on our heads: The shared challenge and promise of phenomics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1793-1799 (2009).
- Elwell, A. L., Gronwall, D. S., Miller, N. D., Spalding, E. P., L, T. D. B. Separating parental environment from seed size effects on next generation growth and development in Arabidopsis. Plant Cell Env. 34, 291-301 (2011).
- Silk, W. K. Quantitative Descriptions of Development. Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 479-518 (1984).
- Cronin, C. J., Feng, Z., Schafer, W. R. Automated imaging of C. elegans behavior. Methods Mol. Biol. 351, 241-251 (2006).
- Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity. Plant J. 52, 374-381 (2007).
- Iyer-Pascuzzi, A. S. Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems. Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).
- Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. Automated measurement of Drosophila wings. BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).
- Jahnke, S. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. Plant J. 59, 634-644 (2009).
- Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis. Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).
- Perrin, R. M. Gravity signal transduction in primary roots. Ann. Botany. 96, 737-743 (2005).
- Strohm, A. K., Baldwin, K. L., Masson, P. H. Molecular mechanisms of root gravity sensing and signal transduction. Dev. Biol. 1, 276-285 (2012).
- Harrison, B. R., Masson, P. H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes. Plant J. 53, 380-392 (2007).
- Beeckman, T. Root Development. , Wiley-Blackwell. 157-174 Forthcoming.
- French, A., Ubeda-Tomás, S., Holman, T. J., Bennett, M. J., Pridmore, T. High-throughput quantification of root growth using a novel image-analysis tool. Plant Physiol. 150, 1784-1795 (2009).
- Granier, C. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. New Phytol. , 169-623 (2006).
- Walter, A. Dynamics of seedling growth acclimation towards altered light conditions can be quantified via GROWSCREEN: a setup and procedure designed for rapid optical phenotyping of different plant species. New Phytol. 174, 447-455 (2007).
- Gregory, P. J. Non-invasive imaging of roots with high resolution X-ray micro-tomography. Plant Soil. , 255-351 (2003).
- Pierret, A., Kirby, M., Moran, C. Simultaneous X-ray imaging of plant root growth and water uptake in thin-slab systems. Plant Soil. 255, 361-373 (2003).
- Naeem, A., French, A. P., Wells, D. M., Pridmore, T. P. High-throughput feature counting and measurement of roots. Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).
