Denne protokol beskriver en proces til hurtig samling af billeder fra Arabidopsis frøplanter reagerer på en tyngdekraft stimulus ved hjælp kommercielt tilgængelige flatbed scannere. Metoden giver mulighed for billig, high-volume indfangning af billeder med høj opløsning, som kan underkastes for downstream analyse algoritmer.
Forskningsindsatsen i biologi i stigende grad kræver brug af metoder, der muliggør høj volumen indsamling af data i høj opløsning. En udfordring laboratorier kan ansigt er udviklingen og realiseringen af disse metoder. Observation af fænotyper i en proces af interesse er et typisk mål for forskningslaboratorier studerer genfunktioner og dette opnås ofte gennem billedoptagelse. En særlig proces, der er modtagelig for observation ved hjælp af billeddiagnostiske metoder er den korrigerende vækst af en sætteplante rod, der er blevet fordrevet fra tilpasningen til tyngdekraft vektor. Imaging-platforme, der anvendes til at måle roden gravitropic reaktion kan være dyrt, relativt lavt i gennemløb, og / eller arbejdskrævende. Disse spørgsmål er blevet behandlet ved at udvikle en high-throughput billedoptagelse metode ved hjælp af billig, men alligevel i høj opløsning, flatbed scannere. Ved hjælp af denne metode, kan billederne blive fanget hvert par minutter ved 4.800 dpi. Den nuværende opsætning muliggør samling af 216 individuelle responses per dag. De billeddata indsamlede data er af rigelig kvalitet til billedbehandling analyse applikationer.
Indsamling af høj opløsning fænotypiske data er nyttige i undersøgelser, der har til formål at forstå samspillet mellem genetik og miljø i formidlingen organismal funktion 1,2. Undersøgelser af denne art er også i sagens natur store i, hvilket gør det desuden nødvendigt, at metoder, der anvendes til måling af fænotyper i denne sammenhæng være høj i gennemløb 3,4. Fastlægges metoder til phenomics skala forskning, kompromiser mellem gennemløb og opløsning kommer i spil. Metoder, der er højere i gennemløb også tendens til at være lavere i opløsning, hvilket gør det sværere at detektere små effekter af genetik eller miljø 5.. Alternativt metoder, mere omhyggeligt måle en ønsket fænotype også tendens til at være lavere i gennemløb, hvilket gør det vanskeligt at overskue genetiske og miljømæssige virkninger bredt. Derudover kan manuelle metoder til at kvantificere fænotyper, herunder visuel inspektion, være genstand for variation som følge af forskelle i den menneskelige perModtagelsen 6..
Imaging teknologier kan give en nyttig bro mellem gennemløb og opløsning i at opnå fænotypiske observationer 7-9. I almindelighed, et billede er relativt nemt at fange lette gennemløb, og når de ses i tilstrækkelig opløsning, kan subtile fænotyper detekteres 1,2,7. Imaging teknologier tendens til at være modificeres til at passe et system eller en proces af interesse og er generelt skalerbar 10-12. På grund af dette, imaging teknologier er ideelle for udviklingen af store studier af organismal funktion.
Svaret fra den primære rod til en tyngdekraft stimulus er en indviklet fysiologisk proces, der forekommer inden for en morfologisk simpel organ. Svaret indebærer aktivering af signalveje, der udbreder gennem roden orgel og dens progression er bestemt af miljømæssige og genetiske faktorer, herunder genetiske faktorer påvirket af miljøet 12-14 </sup>. Svaret fra den primære rod til en tyngdekraft stimulus er blevet undersøgt i hvert fald siden Darwin, men der er meget at lære om, hvordan det virker, især i de tidlige signaleringsbegivenheder og i de faktorer, der medierer respons plasticitet 12,14,15. Opnåelse af en detaljeret forståelse af dynamikken i denne reaktion er vigtigt at finde måder at forbedre muligheden for kimplanter med succes etableret sig i et givet miljø 16. Hertil kommer, at formen af roden gør det modtagelig for programmer til billedbehandling 8,12,17. Tilsammen roden gravitropic reaktion er et ideelt system til udvikling af high-throughput imaging-teknologi med henblik på at gennemføre studier af organismal funktion genomics-niveau.
I denne rapport er et high-throughput, høj opløsning metode til billedoptagelse af roden gravitropic reaktion anvendelse af billige, kommercielt tilgængelige flatbedscannere præsenteres. Oversigten overprotokol er vist i figur 1.. Frøplanter plantet på agarplader var placeret vertikalt orienterede flatbed scannere er udstyret med brugerdefinerede plexiglas plade holdere. Billeder blev indsamlet hvert par minutter på 4.800 dpi og gemmes på et lokalt drev eller data-server. Metadata forbundet med hvert billede serien lagres i en database, og de lagrede billeder behandles. Den fremgangsmåde bruger VueScan software til billedoptagelse. VueScan kan bruges til at køre mere end 2.100 forskellige scannere på Windows, Mac eller Linux operativsystemer (se Materialer tabel). En scanner opløsning på 4.800 dpi blev brugt i dette program til at matche opløsning opnået i tidligere undersøgelser ved hjælp af faste CCD-kameraer 1,8,12. Fleksibiliteten i VueScan software sammen med den fælles grænseflade bruger den til enhver scanner det kører giver brugerne mulighed for let at vedtage stort set alle scannerhardwaren af tilstrækkelig opløsning til protokollen præsenteres i dette papir. Aktuel gennemløb giver mulighed for indsamling af216 individuelle svar per dag. Teknologien er fleksibel og skalerbar til brug på institutioner, der spænder fra gymnasier til forskning universiteter. Desuden billederne indsamlede er af en tilstrækkelig kvalitet til billedbehandling analyse applikationer.
Præcis fænotypiske observation er afgørende for forståelsen af manifestationer af genfunktion i en organisme. En måde at tilegne sig fænotypisk information er gennem erobringen af højopløselige billeddata. Scanneren-baseret platform udviklet har gjort det muligt samling af mange billeder (200 billeder / scan periode) ved høj opløsning (4.800 dpi) over et antal timer. Derudover er denne platform let tilpasses til en bred vifte af lab og klasseværelset miljøer på grund af fleksibiliteten af VueScan software til at køre tusindvis af forskellige scannere ved hjælp af en fælles grænseflade 18.
Metoden præsenteres her udfylder et tomrum i high-throughput billedoptagelse der strækker sig fra store fænotypebestemmelse faciliteter og automatiserede systemer gennemførlige i et enkelt laboratorium. De high-throughput platforme øjeblikket er til rådighed tendens til at bruge specialiserede imaging hardware, herunder kameraer monteret på robot understøtter, at tage billeder af p høj opløsningrimarily over jorden plantevæv (fx Center for Plant Integrativ Technology og Scanalyzer HTS ved LemnaTec) 20,21. Specialiserede imaging systemer, der anvender røntgen og MR-teknologier er også blevet udviklet til billede under jorden væv med bemærkelsesværdig opløsning som de vokser i jorden miljø (f.eks Center for Plant Integrativ Technology) 11,22,23. Denne udvikling af mere specialiseret teknologi er generelt på bekostning af gennemløb, hvilket gør dynamiske fænotypiske undersøgelser vanskeligere. Vigtigere er det, omkostnings-og infrastrukturbehov for disse high-end platforme gør dem oftest umuligt for implementering i mindre laboratorier.
Platforme er også blevet udviklet, som bruger mere standard image capture teknologi og er velegnede til måling af dynamiske reaktioner såsom roden reaktion på en tyngdekraft stimulus. For eksempel har CCD-kameraer er blevet anvendt til at fange individuelle frøplanter respons på lys og tyngdekraft ved højrumlige og tidsmæssige opløsning 1,8,12. Andre systemer er blevet udviklet, så målingen af rodspids orientering af flere rødder fra et enkelt billede (f.eks RootTipMulti ved iPlant Collaborative) 17,24. I førstnævnte tilfælde er gennemløb relativt lavt i betragtning, at kun én kimplante afbildet ved hvert kamera på et tidspunkt, mens der i sidstnævnte tilfælde gennemløb er højere, men generelt på bekostning af opløsning.
Proceduren er beskrevet i denne artikel præsenterer en platform for at optage billeder i høj opløsning i high throughput med udstyr og software, der er let tilgængelige og forholdsvis overkommelig. Ved at bruge denne opsætning, kan 1.080 individuelle rod svar indsamles hver uge i et enkelt laboratorium er udstyret med en bank af seks scannere. I 15 måneder at indsamle et gennemsnit af 864 individuelle svar om ugen, blev i alt 41.625 kimplanter scannet for en genomics undersøgelse. Ca. 15% af de enkelte samlinger mislykkedes på grund af opsætning fejl, network svigt eller fejl i udstyret. Yderligere 22% respons mislykkedes på grund af manglende spiring eller utilstrækkelig vækst rod at fremkalde en vækst respons. Det endelige datasæt består af 27.475 individuelle sætteplante reaktioner på en tyngdekraft stimulans fra 163 rekombinante indavlede linjer plus 99 nær isogeniske linjer. Dataene blev indsamlet i et enkelt laboratorium, hvilket gør dette en meget high-throughput tilgang. Selv i betragtning af at det udstyr, der anvendes til erhvervelse er relativt billig, det har fungeret pålideligt i over to år, selv med tunge brug.
Mens dette protokol har været meget nyttigt for forskning formålet med denne gruppe, nogle begrænsninger stadig eksisterer. På grund af throughput på omkring 50 GB ukomprimerede billeddata per dag, var det tydeligt, at der var behov for en stor mængde plads til at huse billeder, medmindre der kan udvikles effektive komprimering ordninger. Opbevaringen Problemet blev midlertidigt løst ved at købe eksterne harddiske til hver computer. Desuden to 10 TB netværks tilhørende lagringsenheder blev købt. Senere blev komprimeringsalgoritmer udviklet som beskrevet ovenfor, hvilket kan bidrage til at reducere data størrelse med op til 60% (figur 8). Det er vigtigt at bemærke, at den hastighed, hvormed data kan gemmes til et netværk forbundet lagerenhed er afhængig af hastigheden på netværksforbindelsen. Compression ordninger er også blevet begrænset på grund af ønsket om at forhindre tab af billeddata.
Andre begrænsninger er specifikke for en scanner-baserede imaging system er også under overvejelse. For eksempel kimplanter i en scanner tilgang udsættes for lys med høj intensitet i de hvide og potentielt infrarøde områder under hver scanning. Denne sandsynlige påvirker vækst af frøplanter, selvom kimplanter stadig kan observeres at gennemgå robuste responser til en tyngdekraft stimulus (figur 7). En fremtidig forbedring kunne indebære programmering scannere sådan, at kun infrarøde lysdioder er aktive. Et område i aktiv UDVIKLINGSt er oprettelsen af analysealgoritmer godt matchede til opløsning og gennemløb af disse billeddata. Den store datasæt genereres ved hjælp af denne scanner-baserede metode har været ideel til udvikling af robuste værktøjer til high-throughput fænotypebestemmelse af sætteplante billeder. Kompressionen ansat på disse billeder, der vises i figur 7 algoritme understøtter påstanden om, at de er egnede til billede analyse applikationer. Derudover kan billeder, der genereres blive analyseret af den tidligere offentliggjorte algoritme, RootTrace 17,24, hvis de er indsamlet på en lavere opløsning (mindre end 1.200 dpi), og de enkelte frøplanter segmenteres fra billedet ved hjælp af komprimering algoritme beskrevet ovenfor før analysen. Root væksttal kunne udvindes fra billeder reduceret til 1.200 dpi, mens spids vinkel data kan udvindes fra billeder reduceret til 900 dpi (upubliceret observation).
Proceduren er beskrevet i dette papir passer ind i sin egen niche i verden af root billeddannelse i, at det er høj kapacitet og høj opløsning, mens den stadig er forholdsvis overkommelig. En yderligere fordel ved denne fremgangsmåde er, at det nemt kan tilpasses for at imødekomme de billeddannende behovene i en bestemt forskergruppe.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra National Science Foundation (tildeling nummer IOS-1.031.416), og er blevet gennemført i samarbejde med Nathan Miller, Logan Johnson og Edgar Spalding fra University of Wisconsin og Brian Bockelman, Carl Lundstedt og David Swanson af University of Nebraska s Holland Computing Center.
Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |