Denne protokollen beskriver en prosess for rask innsamling av bilder av Arabidopsis frøplanter å svare på en tyngdekraft stimulus bruker kommersielt tilgjengelige planskannere. Metoden gjør det mulig for billig, høy-volum fangst av høyoppløselige bilder mottagelig for nedstrøms analyse algoritmer.
Forskningsinnsatsen i biologi i økende grad krever bruk av metoder som gjør at høy-volum samling av data med høy oppløsning. En utfordring laboratorier kan møte er utvikling og oppnåelse av disse metodene. Observasjon av fenotyper i en prosess av interesse er et typisk mål av forskningslaboratorier studerer gen-funksjon og dette er ofte oppnådd gjennom bildeopptak. En spesiell prosess som er mottagelig for observasjon ved hjelp av avbildnings tilnærminger er den korrigerende veksten av en frøplante rot som er blitt forskjøvet fra innretting med gravitasjonsvektor. Avbildnings plattformer som benyttes for å måle roten gravitropic responsen kan være kostbart, forholdsvis lav i gjennomløpet og / eller arbeidskrevende. Disse problemene har blitt løst ved å utvikle en høy gjennomstrømming bildeopptak metode å bruke billig, men likevel høy oppløsning, planskannere. Ved hjelp av denne metoden, kan bildene bli tatt med få minutters mellomrom på 4800 dpi. Den nåværende oppsettet muliggjør samling av 216 individuelle responses per dag. Bildedataene samles inn er av god kvalitet for bildene analyse applikasjoner.
Innsamling av høyoppløselig fenotypiske data er nyttig i studier som tar sikte på å forstå samspillet mellom genetikk og miljø i formidling organisme funksjon 1,2. Undersøkelser av denne art er også iboende store i omfang, slik at det i tillegg nødvendig at metoder som benyttes for måling av fenotypene i denne sammenheng være høy i gjennomstrømningen 3,4. I å etablere metoder for phenomics stilt forskning, avveininger mellom gjennomstrømming og oppløsning kommer inn i bildet. Metoder som er høyere i gjennomstrømningen også en tendens til å være lavere i oppløsning, noe som gjør det vanskeligere å oppdage små effekter av genetikk eller miljø fem. Alternativt metoder som mer nøye måle en ønsket fenotype også en tendens til å være lavere i gjennomstrømning, noe som gjør det vanskelig å kartlegge genetiske og miljømessige effekter bredt. I tillegg, kan manuelle metoder for å kvantifisere fenotyper, inkludert visuell inspeksjon, være gjenstand for variasjon på grunn av forskjeller i menneskelig perception seks.
Imaging teknologi kan gi en nyttig bro mellom gjennomstrømming og oppløsning i å skaffe fenotypiske observasjonene 7-9. Generelt, er et bilde relativt lett å fange opp, legge til rette for gjennomstrømning, og når de er tatt med tilstrekkelig høy oppløsning, kan subtile fenotyper detekteres 1,2,7. Bildebehandling teknologier har en tendens til å være modifiserbare å passe et system eller en prosess av interesse og er generelt skalerbar 10-12. På grunn av dette avbildningsteknologier er ideelle for utvikling av undersøkelser i stor skala av organisme funksjon.
Responsen til det primære rot til et gravitasjons stimulus er et vanskelig fysiologisk prosess som skjer i løpet av en enkelt morfologisk organ. Responsen innebærer aktivering av signalveier som forplanter seg gjennom roten organ og dets progresjon bestemmes av miljømessige og genetiske faktorer, inkludert genetiske faktorer påvirket av miljøet 12-14 </sup>. Responsen på den primære roten til et gravitasjons stimulans har blitt studert minst siden Darwin, men det er mye å lære om hvordan det fungerer, spesielt i de tidlige signalarrangementer og i hvilke faktorer som medierer respons plastisitet 12,14,15. Å få en detaljert forståelse av dynamikken i dette svaret er viktig å finne måter å forbedre evnen til frøplanter å kunne bli etablert i løpet av et gitt miljø 16. I tillegg er formen av roten gjør den mottagelig for bildebehandlingsapplikasjoner 8,12,17. Til sammen er roten gravitropic respons et ideelt system for utvikling av high-throughput bildeteknologi for den hensikt å gjennomføre genomikk-nivå studier av organisme funksjon.
I denne rapporten, er en høy gjennomstrømning, høy oppløsning metode for bildeopptak av roten gravitropic respons ved hjelp av rimelige, kommersielt tilgjengelige planskannere presentert. Oversikten overProtokollen er vist i figur 1.. Frøplanter plantet på Agarplatene ble plassert på vertikalt orienterte planskannere utstyrt med tilpassede pleksiglass plate holdere. Bilder ble samlet inn hvert femte minutt på 4800 dpi og lagret på en lokal stasjon eller dataserver. Metadata knyttet til hver bildeserie er lagret på en database, og de lagrede bildene blir behandlet. Tilnærmingen bruker VueScan programvare for bildeopptak. VueScan kan brukes til å kjøre over 2100 ulike skannere på Windows, Mac, eller Linux-operativsystemene (se Materialer tabell). En skanner oppløsning på 4800 dpi ble brukt i dette programmet for å matche oppløsningen oppnådd i tidligere studier med faste CCD-kameraer 1,8,12. Fleksibiliteten av VueScan programvare sammen med felles grensesnitt den bruker for enhver skanner det går lar brukerne lett vedta nesten alle skanneren tilstrekkelig oppløsning til protokollen presenteres i denne artikkelen. Nåværende gjennomstrømming åpner for innsamling av216 individuelle svar per dag. Teknologien er tilpasningsdyktig og skalerbar til bruk ved institusjoner som spenner fra videregående skoler til forskning universiteter. Videre er de bildene som er samlet inn av tilstrekkelig kvalitet for bildeanalyse anvendelser.
Nøyaktig fenotypiske observasjon er avgjørende for å forstå de manifestasjoner av gen-funksjon i en organisme. En måte å skaffe seg fenotypisk informasjon er gjennom fangst av høyoppløste bildedata. Skanneren-basert plattform utviklet har aktivert samling av mange bilder (200 bilder / scan periode) med høy oppløsning (4800 ppt) over flere timer. I tillegg er dette plattformen lett kan tilpasses til en rekke laboratorie og klasse miljøer på grunn av fleksibiliteten av de VueScan programvare for å kjøre flere tusen forskjellige skanner ved hjelp av en felles grensesnitt 18..
Metoden som presenteres her fyller et tomrom i high-throughput bildeopptak som strekker seg fra store fenotyping fasiliteter og automatiserte systemer gjennomfør i et enkelt laboratorium. De high-throughput plattformer tiden tilgjengelig tendens til å bruke spesialisert bildebehandling maskinvare, inkludert kameraer montert på robot støtter, for å fange høyoppløselige bilder av primarily over bakken plantemateriale (f.eks Centre for Plant Integrative Teknologi og Scanalyzer HTS av LemnaTec) 20,21. Specialized imaging-systemer som bruker røntgen og MRI-teknologi har også blitt utviklet for å image under bakken vev med bemerkelsesverdig oppløsning som de vokser i jorda miljøet (for eksempel Senter for Plant Integrative Technology) 11,22,23. Denne utvikling av mer spesialisert teknologi er vanligvis på bekostning av gjennomstrømning, slik at dynamiske fenotypiske studier vanskeligere. Viktigere, kostnads-og infrastrukturbehov for disse high-end plattformer gjør dem mest gjennomførbare for implementering i mindre laboratorier.
Plattformer har også blitt utviklet som bruker mer standard bildefangstteknologi og er godt egnet til måling av dynamiske tiltak som for eksempel roten svar på en tyngdekraft stimulans. For eksempel har CCD-kameraer benyttet for å fange opp de enkelte frøplante respons til lys-og vekt ved høyromlig og tidsmessig oppløsning 1,8,12. Andre systemer har blitt utviklet slik at måling av rotspissen orientering av flere røtter fra et enkelt bilde (f.eks RootTipMulti ved iPlant Collaborative) 17,24. I det førstnevnte tilfellet blir gjennomstrømningen relativt lave ettersom kun en frøplante avbildes av hvert kamera på et tidspunkt, mens det i det sistnevnte tilfelle gjennomstrømning er høyere, men vanligvis på bekostning av oppløsning.
Prosedyren er beskrevet i denne artikkelen presenterer en plattform for å fange høyoppløselige bilder i høy gjennomstrømning med utstyr og programvare som er lett tilgjengelig og relativt rimelig. Ved hjelp av dette oppsettet, kan 1080 individuelle rot svar samles hver uke i et enkelt lab utstyrt med en bank av seks skannere. I 15 måneder med å samle et gjennomsnitt på 864 individuelle svar per uke, ble totalt 41 625 frøplanter skannet for en genomstudie. Om 15% av de enkelte samlingene mislyktes på grunn av oppsettet feil, nettvrk feil eller feil på utstyr. En annen 22% responser mislyktes på grunn av mangel på spiring eller utilstrekkelig rotvekst for å fremkalle en vekstrespons. Den endelige datasettet består av 27 475 individuelle frøplante svar på en tyngdekraft stimulans fra 163 rekombinante innavlede linjer pluss 99 i nærheten isogene linjer. Data ble oppsamlet i en enkelt laboratorie, noe som gjør dette til en meget høy gjennomstrømning tilnærming. Selv gitt at utstyret som brukes for oppkjøpet er relativt billig, det har fungert pålitelig i over to år, selv med tung bruk.
Mens denne protokollen har vært svært nyttig for forsknings målene for denne gruppen, noen begrensninger fortsatt eksisterer. På grunn av gjennomstrømning på rundt 50 GB med ukomprimerte bildedata per dag, var det tydelig at en stor mengde plass var nødvendig for å huse bilder med mindre effektive komprimeringsmetoder kan utvikles. Lagrings problemet ble midlertidig løst ved å kjøpe eksterne harddisker for hver datamaskin. I tillegg er to en0 TB nettverks forbundet lagringsenheter ble kjøpt. Senere ble kompresjonsalgoritmer utviklet, som beskrevet ovenfor, noe som kan bidra til å redusere størrelsen av data med opp til 60% (figur 8). Det er viktig å merke seg at den hastigheten som data kan lagres på et nettverk tilknyttet lagringsenhet er avhengig av hastigheten på nettforbindelsen. Komprimeringsmetoder har også blitt hemmet på grunn av ønsket om å forhindre tap av bildedata.
Andre begrensninger som er spesifikke for et skannerbasert avbildningssystem blir også vurdert. For eksempel, i en skanner tilnærming frøplanter utsettes for lys med høy intensitet i de hvite og potensielt infrarøde områder i løpet av hver avsøkning. Dette påvirker sannsynligvis frøplante vekst, men frøplanter kan fortsatt følges for å gjennomgå robuste svar på en tyngdekraft stimulus (figur 7). En fremtidig forbedring kan innebære programmering skannere slik at bare infrarøde lysdioder er aktive. Et område i aktiv development er etableringen av algoritmer godt matchet til oppløsning og gjennomstrømningen av disse bildedata. Den store datasett generert ved hjelp av denne skanneren baserte metoden har vært ideelt for utvikling av robuste verktøy for høy gjennomstrømming phenotyping av frøplante bilder. Den komprimering algoritmen ansatt på disse bildene som er vist i Figur 7 støtter påstanden om at de er mottagelig for bilde analyse applikasjoner. I tillegg kan de bilder generert bli analysert ved den tidligere publiserte algoritmen, RootTrace 17,24, hvis de blir samlet inn ved lavere oppløsning (mindre enn 1200 ppt), og individuelle planter er segmentert av bildet ved hjelp av sammentrykningsalgoritme er beskrevet ovenfor, før analyse. Rotvekst data kan hentes ut fra bilder redusert til 1200 dpi mens spissen vinkel data kan hentes ut fra bilder redusert til 900 dpi (upublisert observasjon).
Prosedyren er beskrevet i denne artikkelen passer inn i sin egen nisje i verden av root bildebehandling i at det er høy gjennomstrømning og høy oppløsning samtidig som den er relativt rimelig. En ekstra fordel med denne tilnærmingen er at den enkelt kan tilpasses for å imøtekomme imaging behovene til en bestemt forskningsgruppe.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra National Science Foundation (award nummer IOS-1031416) og har blitt gjennomført i samarbeid med Nathan Miller, Logan Johnson og Edgar Spalding ved University of Wisconsin og Brian Bockelman, Carl Lundstedt og David Swanson av University of Nebraska er Holland Regnesentral.
Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |