Vurdering av kalsium Sparks i Intakt skjelettmuskelfibre

Summary

Beskrevet her er en metode for å direkte måle kalsium gnister, de elementære enheter av Ca ^{2 +} slipp fra sarkoplasmatisk retikulum i intakte skjelettmuskelfibre. Denne metoden benytter osmotisk stresse-mediert utløser av Ca ^{2 +} utgivelsen fra ryanodine reseptor i isolerte muskelfibre. Dynamikken og homeostatic kapasitet på intracellulær Ca ^{2 +} signalering kan brukes til å vurdere muskelfunksjon i helse og sykdom.

Abstract

Opprettholde homeostatic Ca ^{2 +} signale er en fundamental fysiologisk prosess i levende celler. Ca ^{2 +} gnister er de elementære enheter av Ca ^{2 +} signal i tverrstripet muskelfibrene som vises som svært lokalisert Ca ^{2 +} utgivelsen hendelser mediert av ryanodine reseptor (RyR) Ca ^{2 +} slipper kanaler på sarkoplasmatisk retikulum (SR) membran. Riktig vurdering av muskel Ca ^{2 +} gnister kunne gi informasjon om de intracellulære Ca ^{2 +} håndteringsegenskaper av friske og syke tverrstripet muskler. Selv Ca ^{2 +} gnister hendelser blir ofte sett i hvile cardiomyocytes, er de sjelden observert i hvile skjelettmuskelfibre, derfor er det behov for metoder for å generere og analysere gnister i skjelettmuskelfibre.

Detaljert her er en eksperimentell protokoll for måling av Ca ^{2 +} gnister i isolerte flexor digitorm Brevis (FDB) muskelfibre bruker fluorescent Ca ^{2 +} indictors og laser scanning konfokalmikroskopi. I denne tilnærmingen, er isolerte FDB fibre utsatt for forbigående hypoosmotic stresset etterfulgt av en retur til isotonisk fysiologisk løsning. Under disse forholdene, gnister en robust Ca ^{2 +} respons oppdages ved siden sarcolemmal membran i unge friske FDBs muskelfibre. Altered Ca ^{2 +} gnister respons oppdages i dystrofe eller alderen skjelettmuskelfibre. Denne tilnærmingen har nylig vist at membranen delt signale involverer krysstale mellom inositol (1,4,5)-trifosfat reseptor (IP ₃ R) og RyR bidrar til Ca ^{2 +} gnist aktivering i skjelettmuskulatur. I sammendraget, våre studier ved hjelp av osmotisk stress indusert Ca ^{2 +} gnister viste at dette intracellulær respons reflekterer en muskel signaliserer mekanisme i fysiologi og aldring / sykdomstilstander, inkludert musemodeller av muskel dystrofi (MDX mus) eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS modell).

Introduction

Intracellulær gratis Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) er en allsidig og viktig sekundær budbringer som regulerer flere cellulære funksjoner i opphisset celler som nerveceller, hjerte, skjelett og glatt muskulatur (for gjennomgang se Stutzmann og Mattson ^1). Regulert Ca ^{2 +} mobilisering og cross-talk mellom sarcoplasmic retikulum (SR) og T-tubule (TT) membraner er grunnleggende regulatorer av muskelfysiologi. Videre endringer i ^{Ca2 +} signale hadde blitt vist å være en underliggende mekanisme for kontraktil dysfunksjon i forskjellige muskel-sykdommer.

Ca ^{2 +} gnister er lokalisert elementære Ca ^{2 +} utgivelsen hendelser som stammer fra åpningen av ryanodine reseptor (RyR) kanal på sarkoplasmatisk retikulum (SR) membran ^to. I hjertemuskulatur, gnister oppstå spontant gjennom åpningen av RyR2 kanal ved en Ca ^{2 +-indusert} Ca ^{2 +} release (CICR) mekanisme ^3-5. I skjelettmuskel, er RyR1 strengt kontrollert av spenningssensor ved TT membranen ^6,7. Dermed Ca ^{2 +} gnister blir undertrykt og sjelden påvises i hvile forhold i intakte skjelettmuskelfibre. Inntil nylig, den sarcolemmal membran som trengs for å bli forstyrret av ulike kjemiske eller mekaniske "skinning" metoder for å kople den undertrykkelse av spenningssensoren på RyR1 og lov for Ca ^{2 +} gnist hendelser for å bli oppdaget i skjelettmuskulatur ^8,9. En metode som tidligere er beskrevet som kreves permeabilization av membranen av muskelfibre av saponin vaskemiddel ^10..

I 2003, oppdaget vi at enten forbigående hypoosmotic stress eller hyperosmo stress kan indusere perifer Ca ^{2 +} gnister ved siden av sarcolemmal membran i intakte muskelfibre ^11. Metoden har senere blitt modifisert for å studere de molekylære mekanisme og modulering av Ca ^{2 +} 12-16. Her vil vi skissere detaljene i vår eksperimentell tilnærming for induksjon, deteksjon og analyse av Ca ^{2 +} gnister i intakt skjelettmuskulatur. Vi presenterer også vår spesialbygde gnist analyse program som kan brukes til å kvantifisere de elementære egenskapene til individuelle Ca ^{2 +} gnister i skjelettmuskulatur, f.eks gnist frekvens og amplitude (Δ F/F0, noe som gjenspeiler den åpne sannsynligheten for RyR kanaler og Ca ^{2 +} belastning inne i SR), tid til maksimal (stige-tid) og varighet (FDHM, hele varigheten til halv-maksimal amplitude) av gnister, samt den romlige fordelingen av Ca ^{2 +-gnister.} I tillegg presenterer vi bevis for at lenker endret Ca ^{2 +} gnister til de ulike patofysiologiske tilstander i muskel-skjelettlidelser, som muskeldystrofi og amyotrofisk lateral sklerose.

Fordelen med denne teknikk innebærer evnen til å måle Ca ^{2 +} i relativt undamalderen celler, i stedet for stripping muskelfibre, slik at opptak av Ca ^{2 +} gnister i forhold nærmere fysiologisk. I tillegg gir vår spesialdesignede program mer nøyaktige beregninger av egenskapene til gnisten i forhold til muskelfibrene.

Protocol

En. Sette opp Salt stresse Perfusjonssystem

Figur 1 er et skjematisk protokoll av kalsium gnister vurdering i intakte skjelettmuskelfibre.

1. Sett opp en tre-akse (xyz) mikromanipulator i stand til å posisjonere utløps spissen av perfusjons-system inneholdende minst to kanaler. Dette kan gjøres med engangs Luer-sprøyten med vedlagt tre - veis Luer - Lok stoppekran for å slå på og / eller ut av flyten av perfusjon oppløsninger. Disse perfusjon kanalene skal være i stand til å levere> 1 ml / min oppløsning gjennom en enkelt perfusjon spiss med en> 0,2 mm diameter.
2. Last inn to kanaler av perfusjon system, en med isoton Tyrode løsning og den andre med hypoton Tyrode-løsningen.

2. Forbereder Intakt Enkelt Flexor digitorum brevis (FDB) muskelfibre fra mus

1. Fjern foten fra en mus euthanized følgende NIH og IACUC føringer ved hjelp av et par tunge dissecting saks ved å skjære gjennom benet over ankelleddet.
2. Pin foten på en disseksjon kammer fylt med Minimal Ca ^{2 +} Tyrode Solution med plantar overflaten vendt opp.
3. Dissekere FDB ved å kutte senen og forsiktig trekke opp på senen for å skille muskel fra den omkringliggende vev.
4. Avslutt disseksjon ved å kutte distal sene der den grener i individuelle sifre i de dype lag av muskler.
5. Overfør FDB muskler ved å plukke opp med tang via sine sener for å unngå ytterligere skade på muskelfibrene og plassere inn i et rør med en tint delmengde av Collage Fordøyelse Solution forvarmet til 37 ° C.
6. Inkuber røret som inneholder FDB oppreist på en orbital rystemaskin ved 37 ° C i 60-90 minutter med en hastighet på 160 rpm. Denne muskelbunter dissosiasjon protokollen må eksperimentelt undersøkt for forskjellige stammer av dyr, Særlig for de sykdoms / mutant fibrene utsatt for membranskade.
7. Overfør de fordøyd FDB inn i røret med 700 pl av Isoton Tyrode løsning og forsiktig Triturer å frigjøre fibrene ved å tegne muskelen flere ganger gjennom en serie av 200 ml-mikropipette spissene på gradvis avtagende diameter via skjæring med en ren barberblad for å fjerne spissene av 200 ml mikropipette. For å unngå å skade fibrene i spesielt svake muskler fra sykdom, sørg for at spissen er akkurat stor nok til at fiber bunt å passere uten å stikke. Ikke tving bunt gjennom for liten en åpning.
8. Plate ut FDB fibrene ved å banke lett og risting av FDB fibre i røret og deretter trekke ut 70 ml (1/10 av det totale fiber) med et hakk 200 ml mikropipette inn i sentrum av en 35 mm Delta TPG Skål inneholdende 1 ml Isoton Tyrode løsning for å redusere diffusjon over fatet.
9. Bestem antall intakte enkeltfibre i dish å bruke en disseksjon mikroskop. Legg til flere porsjoner av FDB fibre for å oppnå 3-4 intakte fibrene på fatet.
10. Lagre flere isolerte muskelfibre ved 4 ° C og bruk innen seks timer.

Tre. Fluo-4 AM Dye Lasting og Ca ^{2 +} Imaging (Sparks Measurement)

1. Overføring 500 ml Isoton Tyrode-løsning fra fatet med belagt FDB fibre til et rør med 10 ml Fluo-4 AM lager (1 mM), blande og legge tilbake til fatet til en endelig Fluo-4 AM konsentrasjon på 10 mM. Alternativt kan pluronic-syre brukes til å øke fargestoff lasteeffektivitet.
2. Laste i 60 min ved romtemperatur i mørke.
3. Vask fibrene ved forsiktig å trekke ut 500 ml Fluo-4 AM-inneholdende Tyrode Isotonisk løsning fra formen med en uslipte 200 ml-plast mikropipette spissen og erstatte med like stort volum ferskt Isoton Tyrode-løsningen.
4. Gjenta dette 3 ganger.
5. For å visualisere mitokondrienes funksjon, overføre 500 ml Isotonic Tyrode Solution fra fatet med FDB fibre til et rør med 5 ml TMRE lager (1 mM), blandes, og legge tilbake til formen for en endelig konsentrasjon på 50 nM.
6. Inkuber ved romtemperatur i 10 min.
7. Vask fibrene ved forsiktig å trekke ut 500 ml TMRE-inneholdende Tyrode Isotonisk løsning fra formen med en uslipte 200 ml plast mikropipette spissen og erstatte med like stort volum ferskt Isoton Tyrode-løsningen.
8. Gjenta dette 3 ganger.
9. Overfør oppvask til konfokalmikroskop og velg en intakt fiber med klare striper og en jevn sarcolemmal membran for eksperimentering.
10. Plasser tuppen av perfusjon system 400-500 mikrometer bort fra målet muskel fiber og utenfor sentrum ved hjelp av micromanipulator kontroller.
11. Begynn flyt av Isotonisk Tyrode løsning for å sikre FDB fiber holder seg på plass.
12. Spill fluorescens signalet fra Fluo-4 AM med en 40X oljeneddyppingsobjektivet og opphisse Fluo-4 AM med enargon laser (eksitasjon bølgelengde 488 nm) og rekordutslipps signaler (bølgelengde 510-580 nm). Intensiteten av fluorescent signal er proporsjonal med det relative nivået av intracellulær ^{Ca2 +-konsentrasjon ([Ca2 +]} _i).
13. Fremkall Ca ^{2 +-transienter} ved å endre det osmotiske trykk av det ekstracellulære løsning for å produsere osmotisk stress på fiberen. Utgangspunktet perfuse fibrene med isoton Tyrode-løsning (290 mOsM) (baseline samling i 60 sek), og deretter med hypoton Tyrode-løsning (170 mOsM) i 100 sekunder for å fremkalle svelling. Perfuse de FDB fibrene tilbake med Isotonisk Tyrode løsning. Vanligvis er bare ett osmotisk sjokk lagt til et enkelt intakt fiber i ett deltaet TPG fatet og tenn hendelser siste 10 min for datainnsamling.
14. Record romlig lokalisering av Ca ^{2 +} gnister (figur 2) ved hjelp av en tidsserie av xy to-dimensjonale bilder med skannehastighet på 166 lps (linje per sekund, og each linje består av 512 piksler som resulterer i 3,08 sek / ramme) for hver tilstand av isotonisk (1 min), hypotonisk belastning (100 sek) og post-hypotonisk belastning (5 min). Lagre signaler for offline analyse for å beregne fordelingen og hyppigheten av Ca ^{2 +} gnister etter gjennomføringen av forsøket.
15. Finn en ny fiber på en ny parabol og følger samme osmotisk sjokk-protokollen til å indusere Ca ^{2 +} transienter. Bruk en confocal linje scan (xt) modus (512 piksler i lengde, samplingsrate på 2 msek / linje scan for å spille Ca ^{2 +} transienter i ett minutt (dvs. 30 000 linjer) med confocal avsøkningslinjen plassert rett under sarcolemmal membran (Figur 3 ). Endre linjen skanning til ulike fokus fly for å spille inn tre sekvensiell serie (på en-min intervaller) av linescans for analyse av omfanget og kinetikk av individuelle Ca ^{2 +} gnister.

4. Data Analysis

1. Samle et stort antallxt linjeavsøking spor å vurdere morfologi og kinetikk av individuelle Ca ^{2 +} gnister parametre, dvs. amplitude (F / F _0; hvor F ₀ er hvile Ca ^{2 +} fluorescens), stige tid, tid til toppen, varighet (FDHM , full varighet på halv magnitude), og romlig bredde (FWHM, full bredde på halv magnitude) av de registrerte gnister. Disse parametrene representerer de grunnleggende gating egenskaper Ryr Ca ^{2 +} kanaler som Ca ^{2 +} flux (amplitude), og gating kinetikk av RYRs (varighet).
2. Analyser digitale bildedata med en spesialutviklet, semi-automatisk algoritme som ble opprettet med bildebehandlings språk IDL (Interactive Data Language), som beskrevet tidligere ^11,16. Fordi det unike kinetikken av Ca ^{2 +-slipp} i tilfelle av Ca ^{2 +-gnister} som induseres i FDB fibre av osmotisk stress, er det bedre å kombinere de manuelle og automatiserte funksjoner av Ca ^{2 +} gnist hendelseridentifisering og behandling med disse custom-build bildeanalyseprogrammer ^11. Denne algoritmen er svært nyttig når det er nødvendig for å identifisere ROI (region av interesse) manuelt i enkelte muskel sykdom modeller. Når en ROI er definert, kan algoritmen automatisk utlede de nevnte tenn parametere som deretter kunne eksporteres til Excel-fil. Alternativt, offentlig tilgjengelige bildebehandling, f.eks SparkMaster i ImageJ, kan brukes til å definere de kinetiske egenskapene til Ca ^{2 +} gnister og deres romlige fordelingen i skjelettmuskulatur ^17.

Representative Results

Tidligere studier viste at transient hypoosmotic stress indusert perifer Ca ^{2 +} gnister ved siden av sarcolemmal membranen hos intakte muskelfibre ^11.. Figur 1 viser bilder av intakte enkeltmuskelfibre med jevn sarcolemmal membran og karakteristiske tydelige striper. Figur 2 viser typiske Ca ^{2 +} gnister (som xy bilder) ble indusert av transient (100 sek) behandling med en hypoosmotic løsning som sveller de FDBs muskelfibre fra unge, friske mus. Som muskelfiber krymper tilbake til det opprinnelige volum, vil en robust Ca ^{2 +} tenn respons stå rett under sarcolemma av muskelfiber. Disse xy bilder er brukt til å beregne tenn frekvenser og plotte forfallet profil for dette svaret. Figur 3 viser typiske linjeavsøkingene (XT) genereres med denne modusen for gnist analyse. Confocal skanning linje ligger rett under avsarcolemmal membranen (figur 3A). Tidsseriene med tenn hendelser blir fanget og spesifisert Rois (region av interesse) kan bli identifisert med vår spesialutviklede, semi-automatic "Spark Fit"-programmet (Figur 3B). Figur 3C viser en typisk Spark Fit analyse av amplitude og kinetikk av gitt Ca ^{2 +} gnist. Ca ^{2 +} gnist intensitet er beregnet som amplitude endring av Fluo-4 AM-signaler (Δ F / F _0, hvor F er toppen Fluo-4 intensitet og F ₀ er hvile Fluo-4 intensitet før gnisten som oppstår). Varigheten av gnisten er representert ved FDHM (hele varigheten av en halv magnitude) og stigningstiden, så vel som tid til maksimal kan også beregnes. En typisk 3D (tredimensjonalt) representasjon kan være laget av angitte ROIs vise Ca ^{2 +} intensitetsendring (figur 3D). Figur 4 viser bilder av Ca ^{2 +} tennlinescans fra skjelettmuskelfibre under ulike fysiologiske og patofysiologiske tilstander. Linje scan (xt) serie av Ca ^{2 +} gnister avledet fra friske, unge (3 måneder) vill type muskel (Figur 4A), og alderen (22 måneder) muskel (Figur 4B). Legg merke til den reduserte signal som opptrer i alderen muskelfibre. De unge MDX muskelfibre vise robuste Ca ^{2 +} gnister (Figur 4C). Figur 5 viser Ca ^{2 +} gnister (xy bilder) fra extensor digitorum longus (EDL) muskelfibre fra villtype (figur 5A) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS) sykdom, en motor neuron sykdommer med karakteristiske muskelatrofi og skadede mitochondria (figur 5B). De Ca ^{2 +} intensiteter er show ved Fluo-4-signaler (grønne, venstre panel) og mitokondriene respiratoriske tilstander blir vist ved TMRE signaler (rød, høyre panel). Merk at than skadet mitokondrier (miste TMRE signal) havner robuste Ca ^{2 +} gnister.

Figur 1. Skjematisk protokoll av kalsium gnister vurdering i intakte skjelettmuskelfibre. Skjematisk protokoll av kalsium gnister vurdering i intakte skjelettmuskelfibre. Dette viser trinnvis fremgangsmåte for å få intakte FDBs muskelfibre for analyse og oppsett av perfusjon system for å indusere osmotisk stress på fiber. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Representant Ca ^{2 +} gnister (XY bilder) episoder av skjelett FDBs muskelfibre. Den midterste spor viser tidslinjen og de ​​tilsvarende xy bilder (topplater) til den sekvensielle osmotisk trykkendring i protokollene. Øverst til venstre panel - fiber behandles med Isotonisk Tyrode løsning; toppen midtre panelet - fiber behandles med Hypoton Tyrode løsning, og øverst til høyre panel - fiber tilbake til behandling med Isotonisk Tyrode løsning. En representant histogram av tenn episoder observert med xy bildebehandling er vist på bunnen. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3. Representant Ca ^{2 +} spa RKS (linjen skanner xt bilder) og Spark Fit analyse (A) Confocal linje scan (rød stiplet linje) er plassert rett under sarcolemmal membran av muskelfiber;. (B) Salt stresset fremkalt diskret Ca ^{2 +} gnister presenteres som linjeavsøking (xt) modus. (C) Tenn analyse med gnist Fit algoritme for å demonstrere Ca ^{2 +} intensitet (Δ F / F ₀₎ som er proporsjonal med SR Ca ^{2 +} frigi fluks, og kinetikk (varighet, representert som FDHM). (D) Tredimensjonal handlingen i en Fluo-4 linjeavsøking bilde som viser de osmotiske stress-fremkalt gnister i spatio-temporal modus og deres intensitet. Klikk her for å se større bilde .

/ Ftp_upload/50898/50898fig4.jpg "width =" 600px "/>
Figur 4. Representative Ca ^{2 +} gnister i muskel fysiologiske og patofysiologiske tilstander som svar på osmotisk stress (A) linjeavsøkingene (xt bilder) av Ca ^{2 +} gnister avledet fra unge (3 måneder) sunne FDBs muskelfibrer;. (B) gnister fra alderen ( 22 måneder) FDBs muskelfibre og (C) gnister fra unge (3 måneder) dystrofe MDX mus FDB muskel. Klikk her for å se større bilde .

Figur 5. Representant Ca ^{2 +} gnister (XY bilder) fra FDB muskler i respons til osmotisk stress. (A 2 + gnister (XY bilder) fra villtype FDB muskler og (B) Ca ^{2 +} gnister fra ALS muskler. FDB muskelfibre samtidig merket med Fluo-4 AM (Ca ^{2 +,} grønne signaler, venstre panel) og TMRE (mitokondrie, røde signaler på de riktige panelene). Bildene viser transienter før og etter osmotiske trykkforandringer. Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Denne metoden for å vurdere Ca ^{2 +} gnister i intakt skjelettmuskulatur er et nyttig verktøy for muskel fysiologi og sykdomsforskning. Vi viste at Ca ^{2 +} tenn respons ble endret på ulike tilstander, deriblant muskeldystrofi ^11, aldring ^{_18, 19,} så vel som i amyotrofisk lateralsklerose ^20.. Vår fersk undersøkelse avslørte også funksjonell kobling mellom IP ₃ reseptor og RyR representerer en kritisk komponent som bidrar til Ca ^{2 +} gnister aktivering i skjelettmuskelfibre ^21. Flere andre forskningsgrupper også tilpasset denne teknikken til å utforske de funksjonelle aktiviteter og effekten av genet rednings strategier for dystrophic muskler ^12, og koble Ca ^{2 +} gnist signaliserte til endret redoks stress i enkelte sykdomstilstander ^13,22. Det faktum at membran deformasjon av osmotisk stress til avlaste undertrykkelsen av DHPR på Ryr tilsvarlates pent med den avgjørende rollen som fysisk interaksjon (kopling) av DHPR-Ryr i moduler Ca ^{2 +} gnister i differensiere skjelettmuskulatur ^23, og dermed disse funnene ytterligere implisere Ca ^{2 +} gnister som viktige fysiologiske hendelser. Videre utbygging av denne teknikken for å bruke noen fysiologiske agenter eller hemmere å modulere Ca ^{2 +} gnister vil gi innsiktsfull informasjon om Ca ^{2 +} signalering i cellene ^24.

Den mest kritiske trinn i analysen er å isolere og identifisere intakte muskelfibre i henhold mikroskop før Ca ^{2 +} fargestoff lasting. Ett viktig skritt i denne protokollen er collagenase fordøyelsen tid og temperatur som å endre disse forholdene kan potensielt gjengi cellemembranen skade under fiber isolasjon. En fiber må være fast festet til bunnen av delta TPG retter og vise intakt morfologi med karakteristiske rett, stavlignende utseende, størrelse på 70 til 100 _6, m (lengde), og 8 til 18 mikrometer (cross diameter), enhetlig striation mønster og en glatt sarcolemmal membran for å være nyttig for Ca ^{2 +} gnister måling. En forbedring på tidligere begrensninger i datainnsamlingen er å ta målinger på flere knutepunkter flyene innenfor hver fiber for å fange opp de mest nøyaktige målinger mulig av Ca ^{2 +} gnister. Selv om vi bruker en custom-avledet "Spark Fit" algoritme for å analysere gnist frekvens, dynamikk og egenskaper, lignende programmer er tilgjengelig for public domain for å analysere gnist parametere karakteristikker som "SparkMaster" i ImageJ ^17. Små modifikasjoner av denne metoden kan gi bedre visualisering av Ca ^{2 +} gnister i andre vevstyper som reagerer på osmotisk stresse mediert utløsning av Ca ^{2 +} løsne fra ryanodine reseptoren.

Visualisering av lokale og globale Ca ^{2 +-signaler} i voksen skjelettmuskelfibre er et svært nyttig verktøy for muskelfysiologi og kardiovaskulær forskning. Utvidelse av denne metoden for påvisning av Ca ^{2 +} gnister i muskel-skjelettlidelser sammen med ulike dyremodeller for sykdom hos mennesker forskning og gjennomføring av de kraftige molekylærbiologi tilnærminger (f.eks genet høyekspresjonsystemer eller genet stanse) skal produsere enorme informasjon om regulering av Ca ^{2 +} signalering i menneskers helse og sykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation