Vurdering af Calcium Sparks i intakte Skeletal muskelfibre

Summary

Beskrevet her er en metode til direkte at måle calcium gnister, de elementære enheder af Ca ^{2 +} frigivelse fra sarkoplasmiske reticulum i intakte skeletmuskulatur fibre. Denne metode udnytter osmotisk stress-medieret udløsning af Ca ^{2 +} frigivelse fra ryanodine receptor i isolerede muskelfibre. Dynamik og homeostatiske kapacitet af intracellulær Ca ^{2 +-signalering,} kan anvendes til at vurdere muskelfunktionen hos sundhed og sygdom.

Abstract

Fastholdelse homeostatiske Ca ^{2 +-signalering} er en grundlæggende fysiologisk proces i levende celler. Ca ^{2 +} gnister er de elementære enheder af Ca ^{2 +} signalering i de tværstribede muskelfibre, der vises som meget lokal Ca ^{2 +} frigivelse begivenheder medieret af ryanodine receptor (RyR) Ca ^{2 +} frigive kanaler på sarcoplasmic reticulum (SR) membran. Korrekt vurdering af muskel Ca ^{2 +} gnister kan give oplysninger om de intracellulære Ca ^{2 +} håndtering egenskaber af sunde og syge tværstribede muskler. Selvom Ca ^{2 +} gnister begivenheder er almindeligvis ses i hvile cardiomyocytes, er de sjældent observeret i hvile skelet muskelfibre, der er således et behov for metoder til at generere og analysere gnister i skeletmuskulatur fibre.

Detaljeret her er en forsøgsprotokol til måling af Ca ^{2 +} gnister i isolerede fleksor digitorm brevis (FDB) muskelfibre hjælp fluorescent ^{Ca2 +} indikatorer og laserscanning konfokal mikroskopi. I denne tilgang er isolerede FDB fibre udsat for forbigående hypoosmotisk stress efterfulgt af en tilbagevenden til isotonisk fysiologisk opløsning. Under disse betingelser, et solidt ^{Ca2 +} gnister respons detekteres støder op til sarcolemmal membranen i unge raske FDB muskelfibre. Altered Ca ^{2 +} gnister respons detekteres i dystrofiske eller alderen skelet muskelfibre. Denne fremgangsmåde har for nylig vist, at membran-afgrænset signalering involverer cross-talk mellem inositol (1,4,5)-triphosphat receptor (IP ₃ R) og RyR bidrager til Ca ^{2 +} gnist aktivering i skeletmuskulatur. Sammenfattende vores undersøgelser ved hjælp af osmotisk stress, induceret Ca ^{2 +} gnister viste, at denne intracellulære reaktion afspejler en muskel signalering mekanisme i fysiologi og aldring / sygdomstilstande, herunder musemodeller af muskel dystrofi (MDX-mus) eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS model).

Introduction

Intracellulært frit ^{Ca2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) er en alsidig og vigtig sekundær budbringer, der regulerer flere cellulære funktioner i overgearet celler, såsom neuroner, hjerte-, knogle-og glatte muskler (for oversigt se Stutzmann og Mattson ^1). Reguleret Ca ^{2 +} mobilisering og cross-talk mellem sarcoplasmic reticulum (SR) og T-tubuli (TT) membraner er grundlæggende regulatorer af muskel fysiologi. Endvidere havde ændringer i ^{Ca2 +-signalering} er vist at være en underliggende mekanisme kontraktil dysfunktion i forskellige muskelsygdomme.

Ca ^{2 +} gnister er lokaliseret elementære Ca ^{2 +} frigivelse begivenheder stammer fra åbningen af ryanodine receptoren (RyR) kanal på sarcoplasmic reticulum (SR) membran ^2. I hjertemusklen opstår gnister spontant gennem åbning af RyR2 kanal ved en ^{Ca2 +-inducerede} Ca ^{2 +} release (CICR) mekanisme ^3-5. I skeletmuskulatur er RYR1 strengt kontrolleret af spændingssensoren på TT membran ^6,7. Således Ca ^{2 +} gnister undertrykkes og sjældent påvist i hvile forhold i intakte skelet muskelfibre. Indtil for nylig, at den sarcolemmal membran behov blive forstyrret af forskellige kemiske eller mekaniske "flåning" metoder til at afkoble undertrykkelsen af spændingssensoren på RYR1 og tilladt for Ca ^{2 +} gnist begivenheder, der skal detekteres i skeletmuskulatur ^8,9. En fremgangsmåde beskrevet tidligere krævede permeabilisering af membranen af muskelfibre af saponin vaskemiddel ^10.

I 2003 opdagede vi, at enten forbigående hypoosmotisk stress eller hyperosmotisk stress kan fremkalde perifer Ca ^{2 +} gnister støder op til sarcolemmal membran i intakte muskelfibre ^11. Denne metode er siden blevet modificeret for at studere den molekylære mekanisme og modulering af ^{Ca2 +} 12-16. Her skitserer vi detaljerne i vores eksperimenterende tilgang til induktion, detektion og analyse af Ca ^{2 +} gnister i intakt skeletmuskulatur. Vi præsenterer også vores specialbyggede gnist analyse program, der kan bruges til at kvantificere de elementære egenskaber af de enkelte Ca ^{2 +} gnister i skeletmuskulaturen, fx gnist frekvens og amplitude (Δ F/F0, hvilket afspejler den åbne sandsynlighed af Ryr kanaler, og Ca ^{2 +} belastning inde i SR), tid til at toppe (stigetid) og varighed (FDHM, fuld varighed på halv maksimal amplitude) af gnister, samt den rumlige fordeling af Ca ^{2 +} gnister. Desuden præsenterer vi beviser for, at links ændret Ca ^{2 +} gnister til de forskellige patofysiologiske tilstande i skeletmuskulaturen, såsom muskelsvind og amyotrofisk lateral sklerose.

Fordelen ved denne teknik indebærer evnen til at måle ^{Ca2 +} i relativt undamalderen celler, i stedet for stripning muskelfibrene, som muliggør optagelse af Ca ^{2 +} gnister i forhold tættere på fysiologisk. Derudover vores specialdesignede program giver mere nøjagtige beregninger af egenskaber gnisten i forhold til muskelfibre.

Protocol

1.. Opsætning Osmotisk-stress perfusionssystem

Figur 1 er et skematisk protokol af calcium gnister vurdering intakte skeletmuskulatur fibre.

1. Opsæt en tre-akse (xyz) mikromanipulator stand til at placere udløb spidsen af ​​perfusionssystemet indeholder mindst to kanaler. Dette kunne gøres med engangs Luer-sprøjtecylinder med vedhæftet tre - vejs Luer - Lok stophane til at tænde og / eller slukke for strømmen af infusionsvæsker. Disse perfusion kanaler bør være i stand til at levere> 1 ml / min løsning gennem en enkelt perfusion spids med en> diameter 0,2 mm.
2. Load to kanaler i perfusion system, et med Isotonisk Tyrode opløsning og den anden med Hypotonisk Tyrodeopløsning.

2. Forberedelse Intakt Single Flexor Digitorum Brevis (FDB) muskelfibre fra Mouse

1. Fjern foden fra en mus euthanized efter NIH og IACUC retningslinjer ved hjælp af et par af tunge Dissecting saks ved at skære gennem benet over ankelleddet.
2. Nål foden på en dissektion kammer fyldt med Minimal Ca ^{2 +} Tyrodeopløsning med fodsålsoverfladen opad.
3. Dissekere FDB ved at skære sener og forsigtigt at trække op på senen at adskille muskel fra det omgivende væv.
4. Afslut dissektion ved at skære den distale senen hvor det grene i individuelle cifre i de dybe lag af musklen.
5. Overfør FDB muskel ved optagning med pincet via sine sener at undgå yderligere skader på muskelfibre og anbringes i et rør med en optøet portion af collagenasefordøjelse Solution forvarmet til 37 ° C.
6. Inkubér rør indeholdende FDB oprejst på en orbitalryster ved 37 ° C i 60-90 minutter med en hastighed på 160 rpm. Denne muskel bundter dissociation protokol skal eksperimentelt undersøgt for forskellige stammer af dyr, Især for de sygdomme / mutant fibre sårbare over for skader membran.
7. Overfør fordøjet FDB ind i røret med 700 pi isotonisk Tyrode opløsning og forsigtigt udriv at frigøre fibrene ved at trække musklen flere gange gennem en serie af 200 ml-mikropipette tip gradvist aftagende diameter fra skæring med et rent barberblad til at fjerne spidserne 200 ml mikropipette. For at undgå skadelige fibre i særligt svage muskler fra sygdom, så sørg for at spidsen er lige stor nok til at tillade fiberbundt at passere igennem uden stikning. Tving ikke bundt igennem for lille en åbning.
8. Udplad FDB fibre ved forsigtigt at banke og resuspendering FDB fibre i røret, og derefter trække ud 70 ml (1/10 af de samlede fibre) med et snit 200 ml mikropipette i midten af ​​en 35 mm Delta TPG skål indeholdende 1 ml Isotonisk Tyrodeopløsning at reducere diffusion over skålen.
9. Bestem antallet af intakte enkelte fibre i dish ved hjælp af et dissektionsmikroskop. Tilføj yderligere portioner af FDB fibre for at opnå 3-4 intakte fibre på fadet.
10. Opbevar ekstra isolerede muskelfibre ved 4 ° C og bruges inden 6 timer.

3. Fluo-04:00 Dye Loading og Ca ^{2 +} Imaging (Sparks Measurement)

1. Overfør 500 ml Isotonisk Tyrodeopløsning fra fad med belagte FDB fibre ind i et rør med 10 ml Fluo-04:00 lager (1 mM), blandes og tilføje tilbage i skålen til en endelig Fluo-04:00 koncentration på 10 mM. Alternativt kan pluronsyre anvendes til at forøge farvestof loading effektivitet.
2. Ladning i 60 minutter ved stuetemperatur i mørke.
3. Vask fibrene ved omhyggeligt tegning ud 500 ml Fluo-04:00-holdige Isotonisk Tyrodeopløsning fra fadet med en uklippet 200 ml-plast mikropipettespids og erstatte med tilsvarende volumen af ​​frisk Isotonisk Tyrodeopløsning.
4. Gentag denne proces 3 gange mere.
5. At visualisere mitokondriefunktionen, overføres 500 ml Isotonic Tyrodeopløsning fra fad med FDB fibre ind i et rør med 5 ml TMRE lager (1 mM), blandes og tilføje tilbage til parabol til en endelig koncentration på 50 nM.
6. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
7. Vask fibrene ved omhyggeligt tegning ud 500 ml TMRE-holdige Isotonisk Tyrodeopløsning fra fadet med en uklippet 200 ml plast mikropipettespids og erstatte med tilsvarende volumen af ​​frisk Isotonisk Tyrodeopløsning.
8. Gentag denne proces 3 gange mere.
9. Overfør parabol til konfokal mikroskop, og vælg en intakt fiber med klare Rillerne og en glat sarcolemmal membran til eksperimenter.
10. Placer spidsen af ​​perfusionssystemet 400-500 um væk fra målet muskelfiber og off center hjælp mikromanipulator kontrol.
11. Begynd strømmen af ​​Isotonisk Tyrodeopløsning at sikre FDB fiber bliver på plads.
12. Optag fluorescens signalet fra Fluo-4 am med en 40X olie immersionsobjektivet og ophidse Fluo-4 am med enargon laser (excitation bølgelængde 488 nm) og optage emission signaler (bølgelængde 510-580 nm). Intensiteten af det fluorescerende signal er proportional med den relative niveau af intracellulær ^{Ca2 +-koncentration ([Ca2 +]} _i).
13. Inducere Ca ^{2 +} transienter ved at ændre det osmotiske tryk af det ekstracellulære opløsning for at fremstille osmotisk stress på fiber. Oprindeligt perfuse fibrene med Isotonisk Tyrode-opløsning (290 mOsM) (baseline kollektion for 60 sek) og derefter med Hypotonisk Tyrode-opløsning (170 mOsM) til 100 sekunder til at inducere hævelse. Perfundere FDB fibre tilbage med Isotonisk Tyrode-opløsning. Generelt er kun et osmotisk chok anvendes til et enkelt intakt fiber i et delta TPG fad og gnisten begivenheder sidste 10 min til dataopsamling.
14. Optag rumlig lokalisering af Ca ^{2 +} gnister (figur 2) ved hjælp af en tidsserie af xy to-dimensionelle billeder med scanning hastighed på 166 LPS (linje pr sekund, og EAch linje består af 512 pixel resulterer i 3,08 sec / ramme) for hver betingelse isotonisk (1 min), hypotonisk stress (100 sekunder) og post-hypotonisk stress (5 min.) Store signaler til offline analyse for at vurdere fordelingen og hyppigheden af Ca ^{2 +} gnister efter afslutningen af forsøget.
15. Find en ny fiber på et nyt fad og følge den samme osmotisk chok-protokollen til at fremkalde Ca ^{2 +} transienter. Brug en konfokal linje scanning (XT) mode (512 pixels i længden, sample rate på 2 msek / linje scanning for at optage Ca ^{2 +} transienter i et minut (dvs. 30.000 linjer) med konfokal scanning linje placeres direkte under sarcolemmal membran (Figur 3 ). Skift linje scanning til forskellige brændplaner at optage tre fortløbende serie (ved 1-minutters intervaller) af linescans til analyse af omfanget og kinetik af individuelle Ca ^{2 +} gnister.

4.. Dataanalyse

1. Indsamle et stort antalxt line scan spor at vurdere morfologi og kinetik af individuelle Ca ^{2 +} gnister parametre, dvs amplitude (F / F _0, hvor F ₀ er den hvilende Ca ^{2 +} fluorescens), stigetid, tid til peak, varighed (FDHM , fuld varighed på halv størrelsesorden) og rumlig bredde (FWHM, fuld bredde i halv størrelse) af de optagne gnister. Disse parametre repræsenterer de grundlæggende gating egenskaber RYR Ca ^{2 +-kanaler,} såsom ^{Ca2 +} flux (amplituden) og gating kinetik RYRs (varighed).
2. Analysere digitale billeddata med en brugerdefineret udviklet, semi-automatisk algoritme, der blev skabt med billedbehandling sprog IDL (Interactive Data Language), som beskrevet tidligere ^11,16. Fordi unikke kinetik af Ca ^{2 +} frigivelse i tilfælde af Ca ^{2 +} gnister induceret i FDB fibre ved osmotisk stress, er det bedre at kombinere de manuelle og automatiske funktioner af Ca ^{2 +} gnist begivenhederidentifikation og behandling med disse brugerdefinerede-build billede analyseprogrammer ^11. Denne algoritme er meget nyttigt, når det er nødvendigt manuelt at identificere ROI (region af interesse) i nogle muskler sygdomsmodeller. Når en ROI er defineret, kan algoritmen automatisk udlede ovennævnte gnist parametre, som derefter kunne eksporteres til Excel-fil. Alternativt offentligheden tilgængelige billedbehandling software, fx SparkMaster i ImageJ, kan bruges til at definere de kinetiske egenskaber af Ca ^{2 +} gnister og deres rumlige fordeling i skeletmuskulatur ^17..

Representative Results

Tidligere undersøgelser viste, at forbigående hypoosmotisk stress induceret perifer ^{Ca2 +} gnister støder op til sarcolemmal membranen i intakte muskelfibre ^11. Figur 1 viser billeder af intakte enkelt muskelfibre med glatte sarcolemmal membran karakteristiske, klare og riller. Figur 2 viser typiske ^{Ca2 +} gnister (som XY billeder) blev fremkaldt af forbigående (100 sek) behandling med en hypoosmotisk løsning, der svulmer FDB muskelfibre fra unge, raske mus. Da muskelfiber krymper tilbage til det oprindelige volumen, vil en robust Ca ^{2 +} gnist svar være direkte under sarcolemma af muskelfibrene. 3 viser typiske linieskanninger (XT), der genereres med denne form for gnist analyse Disse xy billeder bruges til at beregne gnist frekvenser og plot henfald profil for dette svar. Figur. Konfokal scanning linje er placeret direkte under densarcolemmal membran (figur 3A). Tidsserier for gnist begivenheder er fanget og den angivne ROIs (område af interesse) kunne identificeres med vores kunder udviklet, semi-automatisk "Spark Fit"-programmet (figur 3B). 3C viser en typisk Spark Fit analyse af amplitude og kinetik givet ^{Ca2 +} gnist. Ca ^{2 +} gnist intensitet beregnes som amplituden ændring af Fluo-4-AM-signaler (Δ F / F _0, hvor F er peak Fluo-4 intensitet og F ₀ er den hvilende Fluo-4 intensitet før gnist opstår). Varigheden af ​​den gnist er repræsenteret ved FDHM (fulde varighed af en halv størrelse), og stigningen tid samt tid til at toppe kan også beregnes. En typisk 3D (tredimensionel) repræsentation kan ske fra bestemte ROI'er at vise ^{Ca2 +} intensitet ændring (figur 3D). Figur 4 viser billeder i ^{Ca2 +} gnistlinescans fra skelet muskelfibre under forskellige fysiologiske og patofysiologiske tilstande. Line scanning (XT) udgaven af Ca ^{2 +} gnister produkter fra sunde, unge (3 måneder) vildtype muskel (figur 4A), og alderen (22 måneder) muskel (figur 4B). Bemærk den reducerede signal, der opstår i alderen muskelfibre. De unge MDX muskelfibre vise robuste Ca ^{2 +} gnister (figur 4C). Figur 5 viser Ca ^{2 +} gnister (xy billeder) fra extensor digitorum longus (EDL) muskelfibre fra vild type (fig. 5A) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS) sygdom, en motor neuron sygdom med karakteristisk muskelatrofi og beskadigede mitokondrier (figur 5B). De Ca ^{2 +} intensiteter er show ved Fluo-4 signaler (grøn, venstre paneler) og mitokondrier respiratoriske tilstande er vist ved TMRE signaler (rød, højre paneler). Bemærk, at than beskadigede mitokondrier (miste TMRE signal) Havne robuste Ca ^{2 +} gnister.

Figur 1. Skematisk protokol af calcium gnister vurdering intakte skelet muskelfibre. Skematisk protokol af calcium gnister vurdering intakte skelet muskelfibre. Dette viser trinvis procedure for at opnå intakte FDB muskelfibre til analyse og opsætning af perfusionssystem at fremkalde osmotisk stress på fibre. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Repræsentant Ca ^{2 +} gnister (XY billeder) episoder af skelet FDB muskelfibre. Den midterste spor viser tidslinjen og de ​​tilsvarende xy billeder (top paneler) den sekventielle osmotiske forandringer tryk i protokollerne. Øverst til venstre panel - fiber behandlet med Isotonisk Tyrodeopløsning, top midterste panel - fiber behandlet med Hypotonisk Tyrodeopløsning og øverste højre panel - fiber returneres til behandling med Isotonisk Tyrodeopløsning. Et repræsentativt histogram af gnist episoder observeret med xy imaging vises på bunden. Klik her for at se større billede .

Figur 3. Repræsentant Ca ^{2 +} spa RKS (line scanner XT billeder) og Spark Fit analyse (A) Konfokal linje scanning (rød stiplet linie) er placeret lige under sarcolemmal membran af muskelfiber. (B) Osmotisk stress fremkaldt diskrete Ca ^{2 +} gnister præsenteres som linje-scanning (XT) mode. (C) Spark analyse med Spark Fit algoritme til at demonstrere Ca ^{2 +} intensitet (Δ F / F _0), som er proportional med den SR ^{Ca2 +} frigive flux, og kinetik (varighed, repræsenteret FDHM). (D) Tre-dimensionel afbildning af en Fluo-4 line scan billede, der viser de osmotiske stress-fremkaldte gnister i spatio-temporale tilstand og deres intensitet. Klik her for at se større billede .

/ Ftp_upload/50898/50898fig4.jpg "width =" 600px "/>
Figur 4.. Repræsentative Ca ^{2 +} gnister i muskel fysiologiske og patofysiologiske tilstande som reaktion på osmotisk stress (A) linieskanninger (XT billeder) af Ca ^{2 +} gnister stammer fra unge (3 måneder) sunde FDB muskelfibre. (B) gnister fra alderen ( 22 måneder) FDB muskelfibre og (C) gnister fra unge (3 måneder) dystrofisk MDX mus FDB muskel. Klik her for at se større billede .

Figur 5. Repræsentant Ca ^{2 +} gnister (XY billeder) fra FDB muskler i reaktion på osmotisk stress. (A 2 + gnister (XY billeder) fra vildtype FDB muskler og (B) Ca ^{2 +} gnister fra Als muskler. FDB muskelfibre samtidigt mærket med Fluo-04:00 (Ca ^{2 +,} grønne signaler, venstre paneler) og TMRE (mitokondrie, røde signaler på de rigtige paneler). Billederne viser transienter før og efter osmotiske trykændringer. Klik her for at se større billede .

Discussion

Denne metode til vurdering af Ca ^{2 +} gnister i intakt skeletmuskulatur er et nyttigt værktøj for muskel fysiologi og sygdom forskning. Vi viste, at ^{Ca2 +} gnist reaktion blev ændret i forskellige forhold, herunder muskeldystrofi ¹¹ ældning ^{_18, 19,} samt i amyotrofisk lateral sklerose ^20. Vores seneste undersøgelse viste også funktionel kobling mellem IP _3-receptoren og RyR repræsenterer en kritisk komponent, der bidrager til Ca ^{2 +} gnister aktivering i skelet muskelfibre ^21. Flere andre forskergrupper også tilpasset denne teknik til at udforske de funktionelle aktiviteter og effekten af gen rednings strategier dystrofiske muskler ^12, og forbinde Ca ^{2 +} gnist signalering til ændret redoxstress i nogle sygdomstilstande ^13,22. Det faktum, at membran deformation af osmotisk stress at lindre undertrykkelse af DHPR om RYR tilsvalates pænt med den afgørende rolle, som fysisk interaktion (kobling) af DHPR-RYR i modulerende Ca ^{2 +} gnister i at differentiere skeletmuskulatur ^23, og dermed disse resultater yderligere indblande Ca ^{2 +} gnister som vigtige fysiologiske begivenheder. Yderligere ekspansion af denne teknik at anvende nogle fysiologiske eller inhibitorer til at modulere Ca ^{2 +} gnister vil give indsigtsfulde oplysninger om Ca ^{2 +} signalering i cellerne ^24.

Den mest kritiske trin i vores analyse er at isolere og identificere intakte muskelfibre under mikroskop før Ca ^{2 +} farvestof lastning. Et afgørende skridt i denne protokol er den collagenasefordøjelse tid og temperatur som at ændre disse betingelser kan potentielt gøre skade cellemembranen under fiber isolation. En fiber skal være solidt fastgjort til bunden af ​​Delta TPG retter og vise intakt morfologi med karakteristisk lige, stang-lignende udseende, størrelse på 70-100 _6, m (længde) og 8-18 um (cross diameter), ensartede riller mønster og en glat sarcolemmal membran for at være nyttige for Ca ^{2 +} gnister måling. En forbedring på tidligere begrænsninger af dataindsamling tager målinger på flere brændplaner inden for hver fiber at fange de mest præcise målinger mulige af de Ca ^{2 +} gnister. Selvom vi bruger en brugerdefineret-afledt "Spark Fit" algoritme til at analysere gnist frekvens, dynamik og egenskaber er tilgængelige for offentlige domæne til analyse gnist parametre karakteristika såsom "SparkMaster" i ImageJ ¹⁷ lignende programmer. Mindre ændringer af denne metode kan give en bedre visualisering af Ca ^{2 +} gnister i andre vævstyper, der reagerer på osmotisk stress medieret aktivering af Ca ^{2 +} frigivelse fra den ryanodine receptoren.

Visualisering af lokale og globale Ca ^{2 +} signaler i voksne skelet muskelfibre er et meget nyttigt værktøj for muskelfysiologi og hjerte-kar-forskning. Udvidelse af denne metode til påvisning af Ca ^{2 +} gnister i skeletmuskulatur sammen med forskellige dyremodeller human sygdom forskning og implementering af de magtfulde molekylærbiologiske metoder (fx gen overekspression eller gendæmpning) af skal producere enorme oplysninger om regulering af Ca ^{2 +} signalering i menneskers sundhed og sygdomme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation