無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Summary

直接カルシウム火花を測定する方法は、ここにある説明のCa ^{2 +}の基本単位は、無傷の骨格筋線維の筋小胞体からの放出。この方法では、孤立した筋線維におけるリアノジン受容体からのCa ^{2 +}放出の浸透圧ストレス媒介トリガを利用しています。ダイナミクスおよび細胞内Ca ^{2 +}シグナル伝達の恒常性能力は、健康および疾患における筋肉機能を評価するために使用することができる。

Abstract

恒常性のCa ^{2 +シグナル}伝達を維持することは、生細胞における根本的な生理学的プロセスである。 Ca ^{2 +}の火花は、非常に筋小胞体（SR）膜上のチャネルを解放する^+（のRyR）CAリアノジン受容体を介したCa ^{2 +}放出事象^2をローカライズされた表示される横紋筋線維内Ca ^{2 +}シグナル伝達の基本単位である。適切な評価筋のCa ^{2 +}の火花が健康で病気にかかった横紋筋の細胞内Ca ^{2 +}ハンドリング性に関する情報を提供することができる。のCa ^{2 +の}イベントは、一般に静止心筋細胞に見られる火花が、それらはほとんど骨格筋線維休止に観察されない、したがって、骨格筋線維における火花を生成し、分析する方法が必要である。

ここで詳述Fを使用して孤立した屈筋digitormブレビス（FDB）筋線維中のCa ^{2 +}スパークを測定するための実験的なプロトコルですluorescentのCa ^{2 +}ウインカ及びレーザー走査共焦点顕微鏡。このアプローチでは、単離されたFDB繊維は等張生理溶液への復帰に続いて、過渡低浸透圧ストレスにさらされている。これらの条件下で、ロバスト性Ca ^{2 +応答}は、若い健康なFDB筋線維の筋細胞膜に隣接して検出される火花。改変されたCa ^{2 +応答}をジストロフィーまたはエージング骨格筋線維が検出された火花。このアプローチは、最近、膜脱制限シグナリングイノシトールの間のクロストーク（1,4,5） -三リン酸を受容体（IP ₃ R）が関与することを示したとのRyRは、Ca骨格筋における^{2 +}スパークの活性化に貢献しています。要約すると、浸透圧ストレスを用いた我々の研究は^{、2 +}スパークがこの細胞内応答は、生理学における筋肉のシグナル伝達機構を反映していることを示し、筋ジストロフィー（mdxマウス）または筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルを含む老化/疾患状態のCaを誘導した（ALSモデル）。

Introduction

細胞内遊離Ca ^{2 +（}の[Ca ^{2 +]} _i）の （レビューのためにステュッツマンとマットソン^1を参照）などの神経細胞、心臓、骨格筋及び平滑筋などの興奮性細胞における複数の細胞機能を調節汎用性と重要な二次メッセンジャーである。筋小胞体（SR）とT-細管の間のCa ^{2 +}動員およびクロストークを調節（TT）膜は、筋生理学の基本的な調節因子である。さらに、のCa ^{2 +}シグナル伝達における変化は、様々な筋疾患における収縮機能不全の根本的なメカニズムであることが示された。

Ca ^{2 +}の火花が筋小胞体（SR）膜²上のリアノジン受容体（のRyR）チャネルの開口に起因する小学校のCa ^{2 +}放出イベントをローカライズされています。心筋では、火花は、Ca ^{2 +}によって誘発されるCa ^{2 +}のRELEによるのRyR2チャネルの開口部を通って自然発生的に起こるASE（CICR）メカニズム^3-5。骨格筋では、TTのRyR1は厳密膜^6,7の電圧センサによって制御される。完全な骨格筋線維で休ん条件でこのようにCa ^{2 +}の火花が抑制されることはほとんど検出されません。最近まで、のRyR1上の電圧センサーの抑制を切り離すために様々な化学的または機械的な「スキニング」の方法によって破壊およびCa ²に対して許可する必要が筋細胞膜は^、+、骨格筋^8,9で検出されるイベントの口火を切る。一つの方法は、以前に、サポニン界面活性剤¹⁰による筋線維の膜の透過化を必要とする。

2003年には、一過性の低浸透ストレスや高浸透圧ストレスのどちらかが^{2 +は}完全な筋線維¹¹内の筋細胞膜に隣接火花周辺カルシウムを誘導できることを発見しました。この方法は、日時のCa ^{2 +}の分子機構および変調を研究するために改変されている12月16日 。ここでは、完全な骨格筋におけるCa ^{2 +}スパークの誘導、検出および分析のための我々の実験的アプローチの詳細を概説しています。また、骨格筋、 例えば、スパーク周波数及び振幅のRyRチャネルの開口確率を反映する（ΔF/F0、中の個々のCa ^{2 +}スパークの元素の特性を定量化するために使用することができる私達の特注のスパーク解析プログラムを提示し、 SRの内側のCa ^{2 +}負荷）;ピークまでの時間（立ち上がり時間）と期間（FDHM、火花の半最大振幅で全期間）だけでなく、Ca ^{2 +}の火花の空間分布。また、我々はそのような筋ジストロフィーや筋萎縮性側索硬化症などの骨格筋における様々な病態生理学的状態に変更されたCa ^{2 +}の火花を結ぶ証拠を提示します。

この技術の利点は、比較的せきを切る中のCa ^{2 +を}測定する能力を含む生理学的に近い条件でのCa ^{2 +}スパークの記録を可能にする代わりに、筋線維剥離の老化細胞は、。さらに、当社のカスタム設計されたプログラムは、筋線維に関連して、スパークの特性をより正確に計算しています。

Protocol

1。浸透圧ストレス灌流システムの設定

図1は、カルシウムの概略プロトコルは無傷骨格筋線維における評価を火花である。

1. 2つのチャネルの最小値を含む灌流システムの出口先端部を位置決めすることができる三軸（XYZ）マイクロマニピュレーターを設定する。これは付属の3使い捨てルアー注射器の筒を作ることができる-ようにルアー - 洛活栓および/ ​​または灌流液の流れのオン·オフを切り替えることができます。これらの灌流チャネルは> 0.2ミリメートルの直径を有する単一チップを介して灌流溶液の> 1 ml /分を送達することができるべきである。
2. 灌流システム、低張タイロードソリューションと等張タイロード溶液による1、その他の2つのチャンネルをロードします。

2。マウスから無傷シングル屈筋屈筋ブレビス（FDB）筋線維の準備

1. マウスEUから足を削除する足首関節以上で脚を切断することで重い解剖ハサミを使用して、NIHおよび動物実験委員会のガイドラインに従ってthanized。
2. 足底面を上にして最小のCa ^{2 +}タイロード溶液を満たし解剖室に足を固定。
3. 腱を切断し、ゆっくりと周囲の組織から筋肉を分離するために腱を引き上げて、FDBを分析。
4. 筋肉の深層内の個々の数字にそれが枝遠位腱を切断することで解剖を完了します。
5. 筋線維への追加ダメージを回避し、コラゲナーゼ消化液の融解したアリコートと管内に配置するために、その腱を通して鉗子でピックアップしてFDBの筋肉を移し、37℃に予熱
6. 160 rpmの速度で60〜90分間、37℃でオービタルシェーカー上で直立し、FDBを含むチューブをインキュベートします。この筋束解離プロトコルは、実験動物の異なる株について試験される必要がある特に、膜の損傷を受けやすいもの疾患/変異型繊維について。
7. 等張タイロード液の700μlのチューブに消化されたFDBを移し、ゆっくりとヒントを除去するクリーンなかみそりの刃で切断を経由して徐々に直径が減少する200ミリリットル、マイクロピペットチップの一連の筋肉を数回描画することにより、繊維を解放するために粉砕する200ミリリットルのマイクロピペットの。病気から特に弱い筋肉の損傷繊維を回避するために、先端が繊維束が付着せずに通過させるのに十分なだけ大きいことを確認してください。あまりにも小さい開口部からバンドルを強制しないでください。
8. 優しくタップして再懸濁FDB繊維をチューブにして、等張の1ミリリットルを含む35ミリメートルデルタのTPG皿の中央にカット200ミリリットルマイクロピペットで70ミリリットル（総繊維の1月10日）を引き出すことで、FDB繊維をプレートアウトお皿全体に拡散を低減するためにタイロードソリューション。
9. Dに完全な単繊維の数を決定解剖顕微鏡を用いてっぽい。皿の上の3-4そのまま繊維を得るために、FDB繊維の追加の分量を追加します。
10. 4℃でさらに孤立した筋線維を保存し、6時間以内に使用しています。

3。フルオ4 AM色素添加およびCa ^{2 +}イメージング（スパークス測定）

1. 、10ミリリットルのFluo-4 AMの株式（1 mM）を有するチューブに播種FDB繊維と皿から等張タイロード溶液500mlを転送混ぜて10 mMの最終のFluo-4 AM濃度に皿に戻って追加します。あるいは、プルロン酸染料積載効率を高めるために使用することができる。
2. 暗所で室温で60分間ロードします。
3. 丁寧にカットされていない200ミリリットルのプラスチックのマイクロピペットの先端で皿からのFluo-4 AM-含む等張タイロード溶液500mlを描くことによって、繊維を洗浄し、新鮮な等張タイロード液の等容量の交換してください。
4. このプロセスを3回繰り返します。
5. ミトコンドリア機能を可視化するために、Isoto 500mlのを転送する5ミリリットルTMRE株式（1 mM）を持つチューブにFDB繊維と皿からタイロードソリューションNIC、混合し、50 nMの最終濃度皿に戻って追加します。
6. 10分間室温でインキュベートする。
7. 丁寧にカットされていない200ミリリットルと皿のプラスチック製マイクロピペットチップからTMRE-含む等張タイロード溶液500mlを描くことによって、繊維を洗浄し、新鮮な等張タイロード液の等容量の交換してください。
8. このプロセスを3回繰り返します。
9. 共焦点顕微鏡にお皿を転送し、明確なストライエーションと実験のための円滑な筋細胞膜とそのまま繊維を選択します。
10. マイクロマニピュレータコントロールを使用して、離れてターゲット筋線維から中心から灌流システム400〜500ミクロンの先端を置きます。
11. FDB繊維が所定の位置に留まることを確認するために等張タイロード溶液の流れを開始します。
12. 40X油浸対物レンズとのFluo-4 AMからの蛍光シグナルを記録してのFluo-4 AMを励起アルゴンレーザー（励起波長488 nm）を記録発光信号（波長510から580ナノメートル）。蛍光シグナルの強度は、細胞内Ca ^{2 +}濃度（[Ca ^{2 +]} _i）の相対レベルに比例する。
13. ファイバ上に浸透圧ストレスを生成するための細胞外溶液の浸透圧を変化させることによってのCa ^{2 +}過渡電流を誘導する。最初に腫れを誘導するために100秒間低張タイロード液（170ミリオスモル）で、次に等張タイロード液（290ミリオスモル）（60秒のベースライン·コレクション）で繊維を灌流して。等張タイロード溶液でFDB繊維をバック灌流。一般的には、一つだけ浸透圧ショックは1デルタTPGディッシュ内の単一の完全な繊維と火花イベントデータ収集のための最後の10分に適用されます。
14. 166 LPS（毎秒線、Eaはスキャン速度のxyの二次元画像の時系列を使用してのCa ^{2 +}スパークの空間的局在レコード（ 図2）。等張性（1分の条件毎に3.08秒/フレームで得られた512画素）で構成chの線）、低張応力（100秒）後、低張応力（5分）。オフライン分析のためのストア信号は、実験終了後のCa ^{2 +}スパークの分布および頻度を評価した。
15. 新しい皿の上に新しい繊維を発見およびCa ^{2 +}過渡を誘導するために同じ浸透圧ショックプロトコールに従ってください。直接筋細胞膜の下に配置共焦点走査線を1分間（ つまり 3万ライン）のCA ^{2 +}トランジェントを記録するために、共焦点ラインスキャン（XT）モード（長さ512ピクセル、2ミリ秒/ラインスキャンのサンプルレートを使用します（ 図3 ）。個々のCa ^{2 +}スパークの大きさと速度論の分析のためのラインスキャンの1分間隔で3つの連続シリーズ（）を記録するために、異なる焦点面にラインスキャンを変更します。

4。データ解析

1. 多数の収集XTラインスキャンは、振幅（F / F _{0、F 0は}休んでのCa ^{2 +}蛍光である）、 すなわち 、個々のCa ^{2 +}の形態および動態パラメータを火花評価するためにトレース、立ち上がり時間、ピークまでの時間、継続時間（FDHM 、半分の大きさで、全期間）、および記録された火花の空間幅（FWHM、半分の大きさでの全幅）。これらのパラメータは、例えば、Ca ^{2 +}フラックス（振幅）としてRYRのCa ^{2 +}チャネルの基本的なゲーティング特性を表し、RYRs（持続時間）のゲーティング動態。
2. 以前に^11,16説明したように、画像処理言語IDL（インタラクティブデータ言語）で作成されたカスタム開発、半自動アルゴリズムでデジタル画像データを分析します。のCa ^{2 +}のユニークな動態は浸透圧ストレスによってFDB線維に誘起されたCa ^{2 +}スパークの場合に放出するので^{、2 +}スパークのCaイベントの手動および自動化された機能を組み合わせた方がよいこれらのカスタム·ビルドの画像解析プログラム¹¹で識別して処理。それは手動でいくつかの筋疾患モデルにおいてROI（関心領域）を識別するために必要なとき、このアルゴリズムは非常に有用である。 ROIが定義されると、アルゴリズムが自動的にし、Excelファイルにエクスポートすることができ、上述のスパークパラメータを導出できた。あるいは、公共利用可能な画像処理ソフトウェア、ImageJの中には、例えば SparkMasterのCa ^{2 +}スパークの動力学的特性及び骨格筋¹⁷におけるそれらの空間分布を定義するために使用することができる。

Representative Results

以前の研究では、末梢のCa ^{2 +}誘起過渡低浸透圧ストレスが無傷筋線維¹¹内の筋細胞膜に隣接火花ことを示した。1は滑らか筋細胞膜および特性明確な条線との完全なシングル筋繊維のイメージを示します。 図2は、典型的なCa ^{2 +}の^を示しています（XY画像など）火花が若く、健康なマウスからのFDB筋線維を膨潤低浸透溶液による一過性の（100秒）処理によって誘導された。筋線維を元のボリュームに収縮する、堅牢なCa ^{2 +}の火花応答は直接筋線維の筋細胞膜下になります。これらのx-y画像はスパーク頻度を計算し、この応答の減衰プロファイルをプロットするために使用される。3スパーク分析のこのモードで生成された典型的なライン走査（XT）を 示す 。共焦点走査線が直接の下に位置しています筋細胞膜（ 図3A）。スパーク事象の時系列が取得され、指定されたROI（関心領域）は、我々のカスタム開発された、半自動「スパークフィット」プログラム（ 図3B）を用いて同定することができた。 図3Cは、振幅の典型的なスパークフィット分析を示すと指定されたCa ^{2 +}の^火花の動態。のCa ^{2 +}スパーク強度のFluo-4 AM信号の振幅変化（FピークのFluo-4強度であり、F _0は、スパークが発生する前に、休止のFluo-4強度ΔF / F _0）として算出される。スパークの持続時間はFDHM（半分の大きさの全期間）で表され、立ち上がり時間、ならびにピークまでの時間も計算することができる。典型的な3D（三次元）表現は、Ca ^{2 +}の強度変化（ 図3D）を表示するように指定されたROIから作製することができる。 図4は、Ca ^{2 +}スパークの画像を示してい異なる生理学的および病態生理学的状態の下で骨格筋線維のラインスキャン。健康で、若い（3ヶ月）由来の野生型筋肉（ 図4A）、および高齢者（22ヶ月）の筋肉（ 図4B）のCa ^{2 +}スパークのラインスキャン（XT）シリーズ。高齢者の筋線維で発生減少した信号に注意してください。若いのmdx筋線維は、堅牢性Ca ^{2 +}スパーク（ 図4C）を表示する図5は、野生型（ 図5A）および筋萎縮性側索硬化症（ALS）から伸筋長指（EDL）筋線維からのCa ^{2 +}スパーク（ のxy画像）を示している病気、特徴的な筋萎縮および損傷したミトコンドリア（ 図5B）と運動ニューロン疾患。 Ca ^{2 +}の強度があるFluo-4の信号（緑、左のパネル）、および呼吸状態がTMRE信号（赤、右パネル）で示されているミトコンドリアによるショーです。そのTに注意してください彼は強固なCa ^{2 +}の火花を保有（TMRE信号を失う）ミトコンドリアを損傷した。

図1。カルシウムの概略プロトコルは、完全な骨格筋線維の評価が火花。カルシウムの概略プロトコルはそのまま骨格筋線維に評価を火花。これは、分析し、繊維上に浸透圧ストレスを誘導する灌流システムのセットアップのための完全なのFDB筋線維を得るために、段階的な手順を示している。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。代表のCa ^{2 +}スパーク（XY画像）骨格のFDB筋線維のエピソード。真ん中のトレースは、プロトコルにおけるシーケンシャル浸透圧の変化に対するタイムラインと対応するX-Yの画像（上のパネル）を示している。左上のパネルには、 - 等張タイロード溶液で処理された繊維、トップ中央のパネル - 低張タイロード溶液で処理された繊維であり、右上のパネル - 繊維等張タイロード溶液による処理に戻った。 XYイメージングで観察スパークエピソードの代表ヒストグラムを一番下に表示されます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。代表のCa ^{2 +}スパ RKS（ラインXT画像をスキャン）し、フィット分析スパーク（A）の共焦点ラインスキャン（赤い破線）は右筋線維の筋細胞膜の下に配置され、（B）浸透圧ストレスが^{2 +}スパークは、ラインスキャンとして提示されている個別のカルシウム誘発（XT）モード。のCa ^{2 +}フラックスを放出SRに比例した強度のCa ^{2 +（ΔF} / F _0）を示すために、（C）スパークフィットアルゴリズムでスパーク分析および動力学（FDHMとして表される持続時間）。 （D）時空間モードとその強度の浸透圧ストレス誘発火花を示すのFluo-4ラインスキャン画像の3次元プロット。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図4。浸透圧ストレスに応答した筋肉の代表のCa ^{2 +}スパークの生理学的および病態生理学的状態の若者から派生したのCa ^{2 +}スパークの（A）ラインスキャン（XT画像）（3ヶ月）、健康のFDB筋線維;（B）は、（高齢者から火花22ヶ月）のFDB筋線維と（C）は 、若い（3ヶ月）ジストロフィーmdxマウスのFDB筋肉から火花。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図5。代表のCa ^{2 +}浸透圧ストレスに応答したFDBの筋肉から火花（XY画像）。（ 、（B）のCa ^{2 +}スパークからオング>）のCa ^{2 +}スパーク（XY画像）。同時にフルオ4 AMで標識のFDB筋線維（Ca ^{2 +を} 、緑色のシグナル、左のパネル）およびTMRE（ミトコンドリア、右のパネルに赤の信号）。画像は、浸透圧が変化する前と後のトランジェントを示しています。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

完全な骨格筋中のCa ^{2 +}スパークを評価するこの方法は、筋肉の生理学および病気の研究のための便利なツールです。我々は、Ca ^{2 +}スパーク応答は_^18、19、ならびに筋萎縮性側索硬化症²⁰に老化、筋ジストロフィー¹¹を含む、異なる条件で変更されたことを示した。我々の最近の研究はまた、骨格筋線維の活性化を²¹で火花のCa ^{2 +}に寄与する重要な成分を表すIP ₃受容体とのRyRとの間の機能的結合を明らかにした。いくつかの他の研究グループはまた、いくつかの疾患状態^13,22における変化したレドックスストレスへのシグナリングスパーク機能活性およびジストロフィー筋¹²の遺伝子レスキュー戦略の有効性を調査、およびCa ^{2 +を}リンクするために、この手法を適応。浸透圧ストレスによる膜変形がRYR対応にDHPRの抑制を緩和するという事実latesうまく骨格筋^23の差別化中のCa ^{2 +}スパークの調節におけるDHPR-RYRの物理的相互作用（結合）の重要な役割を持つ。したがって、これらの知見をさらにCa ^{2 +}の火花のような重要な生理学的事象を巻き込む。 Ca ^{2 +}の火花を変調するために、いくつかの生理学的な作用物質または阻害剤を適用するには、この技術の更なる拡大が細胞²⁴にCa ^{2 +}シグナル伝達に関する洞察力に富んだ情報を提供します。

我々のアッセイの最も重要なステップは、Ca ^{2 +}色素負荷の前に、顕微鏡下で、無傷の筋肉繊維を分離して識別することである。これらの条件を変更する可能性の繊維の分離時に細胞膜損傷をレンダリングすることができるように、このプロトコルOne重要なステップは、コラゲナーゼ消化時間および温度である。繊維がしっかりと_デルタTPGの皿の底部に取り付けられ、特徴ストレート、棒状の外観、70〜100のサイズで完全な形態を示している必要があり6、M（長さ）と8月18日であっ（クロス直径）、均一なストライエーションパターンおよびCa ^{2 +}スパークの測定に有用であることがスムーズな筋細胞膜。データ収集の以前の制限時の改善は、Ca ^{2 +}スパークの可能な限り最も正確な測定値を取り込むために、各ファイバ内のいくつかの焦点面で測定を取っている。我々は、スパーク周波数、ダイナミクス特性を分析するために、カスタム由来「スパークフィット」アルゴリズムを使用していますが、同じようなプログラムは、ImageJの¹⁷の「SparkMaster」として火花パラメータ特性を分析するため、パブリックドメインで使用できます。このメソッドへのわずかな修正は⁺リアノジン受容体から放出浸透ストレスは、Ca ²のトリガ媒介に反応する他の組織型中のCa ²のよりよい可視化⁺スパークされる可能性があります。

成人の骨格筋線維のローカルおよびグローバルのCa ^{2 +}シグナルの可視化は、FO非常に便利なツールです。R筋肉生理学、循環器病研究。共にヒト疾患の研究および強力な分子生物学的手法（例えば、遺伝子の過剰発現または遺伝子サイレンシング）の実装の ​​異なる動物モデルを用いた骨格筋におけるCa ^{2 +}スパークの検出のためのこの方法の拡張は、Ca ^{2 +}の調節に関する膨大な情報を生成する必要が人の健康や病気におけるシグナリング。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation