Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Reproduceerbaar Paraplegie door thoracale aorta-occlusie in een muizenmodel van Spinal Cord ischemie-reperfusie

doi: 10.3791/50910 Published: March 3, 2014

Summary

Het gebrek aan mechanistische begrip van ruggenmerg ischemie-reperfusie schade heeft verder aanvullingen gehinderd dwarslaesie na een hoog risico aorta operaties te voorkomen. Daarom is de ontwikkeling van diermodellen noodzakelijk. Dit manuscript toont reproduceerbare onderste extremiteit verlamming na thoracale aorta-occlusie in een muismodel.

Abstract

Achtergrond
Onderste extremiteit verlamming blijft aorta interventies bemoeilijken. Het gebrek aan begrip van de onderliggende pathologie heeft vooruitgang belemmerd om het optreden deze blessures verlagen. Het huidige model toont reproduceerbare onderste extremiteit verlamming na thoracale aorta-occlusie.

Methoden
Volwassen mannelijke C57BL6 muizen werden verdoofd met isofluraan. Via een cervicosternal incisie werd de aorta blootgelegd. De thoracale aorta en linker subclavia slagaders werden geïdentificeerd zonder entree in pleuraholte. Skeletkenmerken van deze slagaders werd gevolgd door onmiddellijke sluiting (Sham) of occlusie gedurende 4 minuten (matig ischemie) of 8 min (verlengde ischemie). De sternotomy en de huid werden gesloten en de muis werd overgebracht naar de aarde bed voor herstel. Na herstel, werd functionele analyse verkregen bij 12 uur intervallen tot 48 uur.

Resultaten
Muizen die sham operatie ondergingen toonde geen waarneembare achterste ledematen tekort. Muizen blootgesteld aan matige ischemie gedurende 4 minuten had minimale functionele tekort van 12 uur gevolgd door progressie naar volledige verlamming op 48 uur. Muizen blootgesteld aan langdurige ischemie hadden een onmiddellijke verlamming zonder waarneembare achterste ledematen beweging op elk punt in de postoperatieve periode. Er was geen waargenomen intraoperatieve of postoperatieve mortaliteit.

Conclusie
Reproduceerbare onderste extremiteit verlamming onmiddellijke of latere kan worden bereikt in een muismodel. Bovendien, met een mediane sternotomie en zorgvuldige dissectie, hoge overleving en reproduceerbaarheid worden bereikt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Onderste extremiteit verlamming blijft thoracoabdominal interventies bemoeilijken. De verwonding, bekend als ruggenmerg ischemie-reperfusie schade (SCIR), resulteert in verlamming bij tot 20% van risicopatiënten 1. Chirurgische toevoegsels zoals linker hart bypass, lumbale cerbrospinal vocht afvoeren, onderkoeld circulatiestilstand en intercostale slagader reimplantation hebben de incidentie van deze complicatie 2 verminderd, maar veel te veel patiënten blijven worden beïnvloed.

Klinisch, ruggenmerg ischemie en reperfusie letsel wordt gezien als onmiddellijke of latere verlamming na ingrijpen 3. Echter, ons begrip van deze schade verstikt door een gebrek aan mechanistische detail. Daardoor aantal opties beschikbaar om de schade verzwakken nadat deze zich heeft voorgedaan.

We hebben dus aangeworven een klein dier, muizen, model van ruggenmerg ischemie en reperfusie letsel aanbeter te karakteriseren de pathogenese. De meerderheid van de studies tot op heden hebben gebruikt grotere diermodellen voor deze blessure, namelijk rat 4, 5 konijnen, varkens en 6 modellen karakteriseren. Deze zijn echter beperkt door de kosten, complexiteit, variabele reproduceerbaarheid, en vooral, gebrek aan beschikbare technieken voor genetische manipulatie. De meest betrouwbare van deze gepubliceerde diermodellen gaat infrarenale kruis klemming van de abdominale aorta bij konijnen. Echter, de menselijke anterior spinale neuronen ontlenen vaakst hun bloedvoorziening van meer proximale takken 7. Variabele vasculaire anatomie van het ruggenmerg in deze modellen voegt tot moeilijkheden bij de overgang de resultaten voor klinische toepassingen.

Dit manuscript presenteert een model voor onmiddellijke of vertraagde dwarslaesie na thoracale aorta-occlusie die klinisch relevant en makkelijk te gebruiken. Blootstelling van de aortaboog via mini sternotomijn is minder invasief en kan uitlokken zeer reproduceerbare resultaten met minimale morbiditeit en mortaliteit. Hoewel dit model niet zonder problemen en technische nuances, deze kunnen worden overwonnen met zorgvuldige dissectie en weefsel gebruik om een ​​model van verlamming die gemakkelijk kan worden uitgevoerd produceren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Preoperatieve voorbereiding en Anesthesie

  1. Zorg ervoor dat steriele techniek gedurende de hele procedure. Lay-out van alle instrumenten.
  2. Zet de temperatuurregelaar bed vóór verdoving inductie zodat het kan opwarmen tot de geschikte temperatuur (36,5 ° C). Schakel de laser Doppler perfusie monitor, zodat het kan opstarten tijdens de inductie.
  3. Plaats de muis in de inductie kamer.
    1. Toezicht op de ademfrequentie van de muis tijdens inductie zorgvuldig.
    2. Zodra de ademfrequentie visueel is vertraagd, verwijdert u de muis uit de inductie kamer.
    3. Voer teen knijpen om toereikendheid van verdoving te beoordelen.
  4. Met de muis goed verdoofd, plaats muis in rugligging.
  5. Steek gezicht in neuskegel en zet alle ledematen aan het verwarmingssysteem tafel.
    1. Besteed speciale aandacht om ervoor te zorgen dat de uiteinden zijn vastgezet in anatomische positie, zonder deviatiaan een kant. Als de muis niet goed is geplaatst, is het moeilijk om interne thoracale ader doorsnijding tijdens sternotomie voorkomen.
  6. Het gebruik van clippers of commercieel verkrijgbare ontharingscrème, verwijdert haar vanaf de middellijn thorax en links onderste extremiteit buikoppervlakte.
    1. Bij gebruik van ontharingscrème, voorkomen dat ijs in de plaats voor meer dan 30 seconden, kan als alkali brandwonden optreden.
  7. Titreer vluchtige verdoving vaporizer concentratie geschikte anesthesie te onderhouden.
    1. Verwachte verdamper fracties zijn tussen 1-5% met behulp van isofluraan met hoog debiet O 2.
    2. Vluchtige verdoving vaporizer concentratie dient te worden getitreerd om anesthesie te behouden tijdens chirurgische stimulatie met behoud van spontane ademhaling.

2. Rectale Probe Laser Doppler Placement

  1. Plaats gesmeerd rectale sonde in het rectum van de muis. Veilig op zijn plaats om OperAting bed.
  2. Stel de verwarming bed voor een doel rectale temperatuur van 36,5 ° C.
  3. Maak kleine incisie boven dijslagader van muis en ontleden huid weg van het onderhuidse weefsel.
  4. Plaats laser Doppler sonde dan liesslagader.
  5. Pas sonde posities tot de perfusie-monitor registreert meer dan 800 perfusie-eenheden.
    1. Stevig veilige sonde op zijn plaats. Onjuist beveiligd sondes kunnen vals lage perfusie metingen.

3. Dissectie van aortaboog / subclavia

  1. Maak een 2 cm incisie in de huid boven het borstbeen en voorzichtig ontleden huid weg van het onderhuidse weefsel.
  2. Ontleden de submandibulaire klier gratis.
    1. Als bloeden optreedt, kan zachte druk worden aangebracht met een wattenstaafje.
    2. Verdeel de submandibulaire klier door middellijn in het avasculaire vlak.
  3. Til borstbeen met een pincet en het gebruik van de scissors maken 1 cm middellijn sternotomie door de middellijn van het sternum. Afwijkingen van middellijn kan leiden tot interne borstslagader bloeding die moeilijk te controleren zijn.
  4. Plaats 5-0 terugtrekken hechtingen aan iedere kant aan de rand van het borstbeen en trekken borstbeen zijdelings vastzetten hechtingen aan de operationele bed. Vermijd het plaatsen van het terugtrekken hechtingen te lateraal te pneumothoraces voorkomen.
  5. Met behulp van stompe dissectie gratis riem spieren langs de luchtpijp. De linker band spier kan worden verdeeld met een schaar blootstelling verbeteren.
  6. Ontleden gratis de zwezerik van het omringende weefsel. Ga door stompe dissectie tot de grote vaten worden gevisualiseerd. Wees uiterst voorzichtig om ingang in de pleuraholte te voorkomen.
  7. Plaats vasculaire klemmen op aortaboog en linker subclavia.
  8. Controleer distale stroom adequaat heeft verstoord. Dit wordt beschouwd als een reductie> 90% in perfusie eenheden.
    1. Doorgaan occlusie voor desirood voor 4-8 minuten.
  9. Verwijder vasculaire klem en controleer hemostase vóór sluiting van de borst.

4. Sluiting van sternotomy en Skin

  1. Verwijder het terugtrekken hechting aan de linkerkant van de muis.
  2. Sluit de sternotomie met de juiste retractie hechtdraad.
    1. Een enkele sternal hechting (met behulp van de eerder geplaatste retractie steek) is voldoende voor borstbeen sluiting. Het plaatsen van een andere steek is onnodig en verhoogt risico van pneumothorax en bloeding.
  3. Nauw huid met stromend 5-0 steek.

5. Herstel en Postoperatieve Assessment

  1. Breng de muis naar herstel kooi. Kooi moet op een verwarmingselement aan de omgevingstemperatuur van het herstel kamer te verhogen en warmteverlies aan de omgeving worden geplaatst.
  2. Nauwlettend toezien op de muis op tekenen ademnood of epileptische activiteit. Dien een pijnstiller per instelling richtlijnen. Euthanasienize muizen onmiddellijk als inbeslagneming of ademhalingsproblemen waargenomen.
    1. CO 2 kamer euthanasie is onze voorkeur methode. Cervicale dislocatie is een andere optie als CO 2 is niet beschikbaar.
    2. Volledig herstel kan worden verwacht in 1-2 uur, afhankelijk van de lengte van vluchtige anesthetica en gebruikte concentratie.
  3. De terugkeer van de muis naar de normale kooi. Plaats het voedsel en water plaats op de vloer van de kooi.
  4. Beoordelen neurologische toestand bij 12 uur met tussenpozen gebruik Basso Muis Schaal voor Locomotion 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Muizen onderging veinzerijchirurgie (n = 3) of aorta-afsluitinrichting 4 (n = 3) tot 8 min (n = 3). Postoperatief muizen werden beoordeeld door de Basso Muis Score (figuur 1). Muizen die sham operatie ondergingen hadden geen waarneembare functionele tekorten op enig moment na de operatie. Muizen blootgesteld aan matige ischemie (4 min) had bijna normale achterste ledematen functie om 12 uur met progressieve functionele achteruitgang tot volledige verlamming met 48 uur. Muizen in langdurige ischemie groep (8min) had volledige verlamming na een operatie, zonder enige vergoeding in aanmerking functie (figuur 2).

Figuur 1
Figuur 1. Basso score voor Hind Limb Motor Function 8. Scoren voor achterste ledematen neurologische dysfunctie gerangschikt van 0 (geen functie) tot 9 (normaal functiop). Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2. Postoperatieve Hind-Limb Function. De ernst van neurologische tekort werd vastgesteld mbv de Basso Muis Schaal op 12 uur postoperatief intervallen tot 48 uur. Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Paraplegie secundair aan ruggemerg ischemie reperfusie is het resultaat van een complex van slecht begrepen pathologieën 9. Hoewel dit wordt meestal gezien na thoracoabdominal aortachirurgie, een grote andere beledigingen zoals aorta dissecties, trauma, embolische fenomenen, vasculitis, en systemische hypotensie 10 leiden paraplegie. Om een ​​beter begrip van deze schade te krijgen en zorgen voor toekomstige doelstellingen van deze schade op te heffen, hebben diermodellen een noodzaak geworden.

Patiënten die lijden aan deze complicatie vertonen ofwel een onmiddellijke of vertraagde verlamming. Dit model en anderen adequaat evenwijdig 11 de bimodale verdeling van verlamming klinisch gezien. Terwijl matige ischemie (4 min) produceerde een vertraagde verlamming, langdurige ischemie (8 min) resulteerde in een onmiddellijke en permanente verlamming.

Het gepresenteerde model heeft voordelen in vergelijking met die die alateral thoracotomie 12,13. De mediane sternotomie exposure verlaat de borstholte intact en elimineert de noodzaak voor tracheale intubatie of herstel van onderdruk in de pleuraholte. Klinisch, wordt de sternotomie geassocieerd met veel minder postoperatieve pijn in dan de laterale thoracotomie en misschien postoperatieve pijnstillende eisen verminderen.

Dit model is niet zonder beperkingen. Net als bij andere modellen, muizen chirurgie heeft een leercurve en goede chirurgische techniek is noodzakelijk. Muizen kunnen snel bezwijken als dissectie niet wordt gedaan met zorg. De meest voorkomende oorzaken van intra-operatieve sterfte bloeding of pneumothorax. Om potentieel fatale bloeding te voorkomen dat de sternotomie moeten worden gemaakt middellijn. Als de sternotomie te lateraal wordt gemaakt van een transactie van interne borstslagaders en daaropvolgende bloeding optreden. Bovendien kunnen ruwe dissectie van dalende aorta en subclavia resulteren in bloedingen het zal moeilijkheden zijnt of onmogelijk te controleren. Pneumothorax zijn een ander potentieel dodelijke complicatie. Die typisch voorkomen bij de plaatsing van het terugtrekken hechtingen of dissectie van de aorta. Als terugtrekken hechtingen zijn plaats te lateraal of de aortaboog wordt niet ontleed met zorg een pneumothorax kan optreden en zijn universeel fataal.

Verdere stappen moeten worden gebruikt om de reproduceerbaarheid te waarborgen. Normothermia kritisch. Tijdens de operatie muizen worden gehouden zo dicht tot 36,5 ° C mogelijk. Zelfs milde hypothermie is in getoond om significante neuroprotectieve effecten in het ruggemerg en takt modellen 14,15 hebben. Bovendien moet laser Doppler-metingen nauwkeurig worden gecontroleerd en muizen met slechts 90% vermindering van de distale stroom moeten worden opgenomen ter vergelijking. Onvolledige occlusie van de aorta of subclavia slagaders resulteert in hogere distale stromen en resultaten zijn zeer variabel.

Concluderend, het muizenmodel van lower extremiteit verlamming gepresenteerd probleemloos kunnen worden, waardoor zeer reproduceerbare resultaten. Toepassingen van dit model kan de onderzoeker voorzien van een middel om de onmiddellijke en vertraagde verlamming bestuderen. Bovendien zou de goedkeuring van dit model blijken uiteindelijk in de bestrijding van deze verwoestende complicatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

We willen graag de Thoraxchirurgie Stichting voor Onderzoek en Onderwijs bedanken voor hun financiële steun van dit project.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VMS Anesthesia Machine MDS Matrx
Isoflurane Vet One 13985-528-60 2.0% through nose cone 
Induction Chamber Vet Equip 941444
Heating Bed Vestavia Scientific
Lazer Doppler Monitor Moor Instruments VMS-LDF1
5-0 Suture, Polyester Surgidac VD-551 Taper Needle
Microdissecting Clips Biomedical Research Instruments 14-1030, 14-1060
Surgical Instruments Fine Surgical Instruments Forceps, needle holder

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J. Vasc. Surg. 48, 47-53 (2008).
  2. Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen. Thorac. Cardiovasc. Surg. 59, 79-90 (2011).
  3. Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann. Thorac. Surg. 83, 1345-1355 (2007).
  4. Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27, 1850-1858 (1996).
  5. Naslund, T. C., Hollier, L. H., Money, S. R., Facundus, E. C., Skenderis, B. S. Protecting the ischemic spinal cord during aortic clamping. The influence of anesthetics and hypothermia. Ann. Surg. 409-515 (1992).
  6. Qayumi, A. K., Janusz, M. T., Lyster, D. M., Gillespie, K. D. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J. Invest. Surg. 10, 47-52 (1997).
  7. Lang-Lazdunski, L., Matsushita, K., Hirt, L., Waeber, C., Vonsattel, J. P., Moskowitz, M. A., Dietrich, W. D. Spinal Cord Ischemia: Development of a model in the mouse. Stroke. 31, 208-213 (2000).
  8. Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J. Neurotrauma. 23, 635-659 (2006).
  9. Kwon, B. K., Tetzlaff, W., Grauer, J. N., Beiner, J., Vaccaro, A. R. Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine. J. 4, 451-464 (2004).
  10. Cheshire, W. P., Santos, C. C., Massey, E. W., Howard, J. F. Spinal cord infarction: etiology and outcome. Neurology. 47, 321-330 (1996).
  11. Kakinohana, M., et al. Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice. Stroke. 42, (8), 2302-2307 (2011).
  12. Wang, Z., Yang, W., Britz, G. W., Lombard, F. W., Warner, D. S., Sheng, H. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J. Neurosci. Methods. 189, 246-251 (2010).
  13. model of ischemic spinal cord injury with delayed paralysis caused by aortic cross-clamping. Anesthesiology. 113, 880-891 (2010).
  14. Kang, J., et al. The effects of systemic hypothermia on a murine model of thoracic aortic ischemia reperfusion. J. Vasc. Surg. 52, 435-443 (2010).
  15. Li, J., Benashski, S., McCullough, L. D. Post-stroke hypothermia provides neuroprotection through inhibition of AMP-activated protein kinase. J. Neurotrauma. 28, (7), 1281-1288 (2011).
Reproduceerbaar Paraplegie door thoracale aorta-occlusie in een muizenmodel van Spinal Cord ischemie-reperfusie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).More

Bell, M. T., Reece, T. B., Smith, P. D., Mares, J., Weyant, M. J., Cleveland Jr., J. C., Freeman, K. A., Fullerton, D. A., Puskas, F. Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion. J. Vis. Exp. (85), e50910, doi:10.3791/50910 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter