Summary
Qui descriviamo una procedura per l'immagine di complessi virali in liquido a risoluzione nanometrica usando un microscopio elettronico a trasmissione.
Abstract
I ricercatori utilizzano regolarmente microscopi elettronici a trasmissione (TM) per esaminare entità biologiche e valutare nuovi materiali. Qui descriviamo un'applicazione aggiuntiva per questi strumenti: la visualizzazione di assemblaggi virali in un ambiente liquido. Questo metodo eccitante e nuovo di visualizzazione delle strutture biologiche utilizza un porta campioni a base microfluidica recentemente sviluppato. Il nostro video articolo dimostra come assemblare e utilizzare un supporto microfluidico per immagini campioni liquidi all'interno di un TEM. In particolare, utilizziamo il rotavirus simiano particelle a doppio strato (DSP) come sistema modello. Descriviamo anche passaggi per rivestire la superficie della camera liquida con biofilm di affinità che lether DLP alla finestra di visualizzazione. Questo ci consente di immaginiare gli assiemi in modo adatto per la determinazione della struttura 3D. Quindi, presentiamo un primo scorcio di particelle subvirali in un ambiente liquido nativo.
Introduction
Un obiettivo comune di biologi e ingegneri è quello di comprendere il funzionamento interno delle macchine molecolari. I microscopi elettronici a trasmissione (TEM) sono strumenti ideali per visualizzare questi dettagli intricati a risoluzione quasi atomica1-2. Al fine di sostenere il sistema ad alto vuoto di un TEM, i campioni biologici sono tipicamente incorporati in sottili pellicole di ghiacciovitreo 3,zuccheri 4,sali di metallopesante 5o qualche combinazionedi essi 6. Di conseguenza, le immagini di campioni incorporati possono rivelare solo istantanee limitate di processi dinamici.
I primi tentativi di mantenere campioni biologici idratati in camere liquide ambientali furono intrapresi da Parsons e colleghi utilizzando stadi di pompaggio differenziali. I modelli di diffrazione elettronica dei cristalli di catalasi non macchiati sono stati registrati con successo con una risoluzione di 3 Å in uno statoidratato 7-8. Inoltre, i domini lipidici separati in fase potrebbero essere esaminati in membrane idratate di erytrocitiumani 9-10. Tuttavia, il movimento causato dalla diffusione del liquido e dalla sua interferenza con il fascio di elettroni, ha portato a una grave perdita di risoluzione e ulteriori esperimenti utilizzando campioni biologici non sono stati tentati fino a poco tempo fa.
Sono stati introdotti supporti di campioni microfluidici di nuova sviluppo che utilizzano microchip semiconduttori per formare una camera ambientale micro-scalata. Questi dispositivi possono mantenere i campioni in liquido mentre sono posizionati in una colonnaTEM 11-12. Questa svolta tecnica nell'imaging TEM ha permesso ai ricercatori di vedere, per la prima volta, eventi progressivi a livello molecolare13. Ci riferiamo a questa nuova modalità come"microscopia molecolare in situ" in quanto gli esperimenti possono ora essere eseguiti "all'interno" della colonnaEM 14-15. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di immaginiare gli assemblaggi biologici in liquido al fine di osservare i loro comportamenti dinamici a risoluzione nanometrica. La logica alla base della tecnica sviluppata è registrare osservazioni in tempo reale ed esaminare nuove proprietà dei macchinari biologici in soluzione. Questa metodologia espande l'uso dei TEM per scopi più ampi in biologia cellulare e molecolare12-16.
Nell'attuale articolo video, presentiamo un protocollo completo per assemblare e utilizzare un porta campioni microfluidici disponibile in commercio. Questi supporti specializzati utilizzano microchip di nitruro di silicio prodotti con distanziali integrati per formare una camera liquida che racchiude volumi minimi di soluzione. Finestre sottili e trasparenti vengono incise nei microchip per scopi di imaging12. Dimostriamo l'uso corretto di un supporto microfluidico per esaminare le particelle a doppio strato del rotavirus simiano (DSP) in liquido utilizzando un TEM. Per garantire che gli assemblaggi biologici, come i DSP, non si disffondono rapidamente su grandi distanze durante l'imaging, utilizziamo l'approccio Affinity Capture per li intempare sulla superficie della camera microfluidica16. Questo passaggio di cattura molecolare ha un grande vantaggio rispetto alle tecniche alternative per l'imaging di campioni biologici in liquido perché consente l'acquisizione di immagini che verranno utilizzate per le routine di elaborazione a valle. Questo passaggio di acquisizione utilizzato in combinazione con l'imaging microfluidico è unico per le nostreprocedure 17. I lettori che utilizzano applicazioni di biologia strutturale utilizzando camere di imaging TEM o microfluidiche possono considerare l'uso di tecniche di cattura dell'affinità quando le osservazioni dinamiche a livello molecolare sono l'obiettivo finale.
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Protocol
1. Preparare i dispositivi di acquisizioneaffinità 16
- Pulire gli E-chips di nitruro di silicio incubandoli in 15 ml di acetone per 2 minuti seguiti da 15 ml di metanolo per 2 min(Figura 1A). Lasciare asciugare i trucioli sotto il flusso d'aria laminare.
- Incubare i trucioli essiccati su una piastra di agitazione riscaldata (senza mescolare) per 1,5 ore a 150 °C, quindi lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Utilizzare siringhe Hamilton per comporre miscele lipidiche in piccoli tubi di vetro per contenere il 25% di cloroformio, 55% DLPC (1,2-dilauroil-fosfocolina) in cloroformio (1 mg/ml) e 20% lipide Ni-NTA (1,2-dioleoil-iminodiacetico acido-succinil-nichel sale) in cloroformio (1 mg/ml) per un volume totale di 40 μl.
- Applicare un'aliquota di 1 μl della miscela su ogni goccia di 15 μl di acqua Milli-Q su un pezzo di Parafilm in una piastra di Petri umida (Figura 1B). Incubare campioni sul ghiaccio per almeno 60 minuti.
2. Cattura macromolecole17
- Posizionare un E-chip con un distanziale integrato di 150 nm sopra un campione monostrato e incubare per 1 min(Figura 1C).
- Sollevare delicatamente il truciolo dal campione e aggiungere un'aliquota di 3 μl di proteina A. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente(Figura 1D).
- Asciugare la goccia in eccesso usando Whatman #1 carta da filtro e aggiungere immediatamente un'aliquota di 3 μl di soluzione anticorpale. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione in eccesso utilizzando una siringa Hamilton e aggiungere immediatamente un'aliquota di 1 μl di DSP rotavirus (0,1 mg/ml) in soluzione tampone contenente 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 e 10 mM CaCl2. Incubare per almeno 2 minuti a temperatura ambiente. La preparazione dei DPP è stata descritta in precedenza18.
3. Assemblare la camera microfluidica e caricare il portabocca in situ
- Caricare l'E-chip umido contenente il campione virale nella punta del portacampioni microfluidico. Scarica a bagliore un secondo chip elettronico piatto per 1 minuto quindi caricato sopra il chip del distanziale(Figura 2, pannelli 1-5).
- In alternativa, per aumentare il contrasto delle macromolecole biologiche, è possibile aggiungere macchie di metallipesanti (ad esempio lo 0,2% di formato uro-ranil) ai campioni bagnati prima di posizionare il secondo chip E sul campione bagnato. Tuttavia, il chip elettronico contenente il campione dovrà essere lavato con acqua Milli-Q prima di aggiungere il reagente di contrasto.
- Mettere insieme l'intero assieme per formare un involucro sigillato, tenuto in posizione meccanicamente all'interno del supporto da 3 viti di ottone(Figura 2,pannelli 6-8).
- Dopo il montaggio, la punta del supporto viene pompata a10-6 Torr utilizzando una stazione di pompaggio a secco turbopompata prima di posizionare il supporto all'interno del TEM.
4. Imaging in liquido utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione
- Caricare il porta campioni in situ in un microscopio elettronico a trasmissione (FEI Company) dotato di filamento LaB6 e operante a 120 kV.
- Accendere il filamento TEM e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio rispetto al campione utilizzando la funzione wobbler per inclinare il campione da -15° a +15° avanti e indietro nella colonna. Questa procedura regola lo stadio nella direzione z per aiutare a tenere conto del corretto spessore della camera liquida. Questo passaggio garantisce inoltre che durante la registrazione delle immagini si usi un ingrandimento accurato.
- Registrare prima le immagini lungo i bordi e nelle regioni angolari della camera microfluidica. Queste aree contengono in genere la soluzione più sottile. Registra immagini di campioni in condizioni a basso consumo (1-3 elettroni/Å2)utilizzando una telecamera CCD. Utilizzare ingrandimenti nominali da 6.000X a 30.000X.
- Determinare il valore di defocalizzazione corretto concentrandosi sul bordo della camera fluidica. Utilizzare un valore di -1,5 μm per registrare immagini con ingrandimento 30.000X. Se si incontra una soluzione spessa o se l'agente di contrasto non viene utilizzato nella preparazione del campione, utilizzare valori di defocus più elevati nell'intervallo da -2 a -4 μm.
- Per garantire che la soluzione sia contenuta nella camera microfluidica durante gli esperimenti, mettere a fuoco il fascio di elettroni fino a quando le bolle non si formano nel liquido all'interno del dispositivo.
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Representative Results
Le immagini rappresentative dei DSP in liquido che utilizzano chip elettronici scaricati in bagliore (Figura 3A) mostrano meno DSP in una determinata area di visualizzazione, presumibilmente a causa della diffusione, rispetto ai DSP arricchiti sui dispositivi Affinity Capture (Figura 3B). L'aggiunta di formato uranil nella camera di imaging migliora il contrasto del campione e quindi la visibilità dei singoli DSP in soluzione(Figura 3C,pannello superiore). Un migliore contrasto consente l'elaborazione delle immagini a valle, ad esempio la media delle particelle(Figura 3C, pannello inferiore) e le routine di ricostruzione 3D(Figura 3C, inserto) come descritto inprecedenza 17. In breve, per la ricostruzione 3D abbiamo selezionato 600 particelle di DSP utilizzando il pacchetto software SPIDER19. Particelle selezionate sono state perfezionate rispetto a un modello iniziale del rotavirus DLP20 che è stato filtrato con risoluzione 80 Å. Abbiamo utilizzato il pacchetto software RELION21 per calcolare una ricostruzione 3D con una risoluzione di circa 25 Å. La nostra mappa 3D è in buoni accordi con il modello iniziale e con una ricostruzione crio-EM indipendente che è stata calcolata utilizzando gli stessi parametri e il campione DLP17.
Figura 1. Preparazione di microchip di nitruro di silicio per l'imaging liquido. A)I microchip di nitruro di silicio vengono puliti immergendosi per 2 minuti in acetone seguito da 2 minuti in metanolo per rimuovere il fotoresist residuo utilizzato nel processo di fabbricazione. B)I campioni monostrato lipidici vengono preparati su gocce di acqua Milli-Q aggiunte a Parafilm in una piastra di Petriumida 17. C)I microchip puliti vengono posizionati sopra i monostrati e rimossi dopo una fase di incubazione di 1 minuto. D) Gli adattatorimolecolari (cioè la proteina A e gli anticorpi in soluzione) vengono aggiunti direttamente ai trucioli rivestiti monostrato e la soluzione in eccesso viene rimossa prima di aggiungere DSP. Il chip del campione bagnato viene quindi caricato nel supporto microfluidico.
Figura 2. Assemblaggio della camera liquida di un portabocca microfluidico. La punta della camera del campione viene assemblata aggiungendo raccordi ad anello O alla punta vuota (passaggi 1-2). Il truciolo del campione bagnato contenente distanziale integrato viene delicatamente posizionato nei raccordi lavorati all'interno della punta del supporto (passaggi 3-4). Un chip piatto scaricato incandescente viene posizionato sopra il chip del campione (passaggio 5). L'assieme viene quindi rivestito con una piastra metallica(passo 6)che viene tenuta in posizione da 3 viti in ottone (gradini 7-8).
Figura 3. Risultati rappresentativi per le DSP in liquido. A) I microchip scaricati con bagliore legano pochissimi DSP in soluzione rispetto ai microchip decorati con affinità (B). Barre di scala, 2 μm. C)Immagine rappresentativa (pannello superiore) e ricostruzione 3D (inserto) di DSP in liquido contenente reagente di contrasto. Barra di scala, 150 nm. Il diametro della ricostruzione è di 80 nm. Le medie di classe delle DSP in liquido (pannello inferiore) rivelano caratteristiche ben definite lungo la loro superficie esterna. I singoli pannelli sono a 110 nm.
Figura 4. Risultati rappresentativi per la formazione di bolle in campioni liquidi nel TEM. Immagini di bolle formate in campioni liquidi dopo l'esposizione continua del fascio di elettroni a 5 elettroni/Å2 per circa 2 min(A)e 5 min(B). La barra di scala è di 100 nm.
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Discussion
Nel nostro lavoro presentato, abbiamo utilizzato l'approccio di acquisizione dell'affinità per tether rotavirus DLL a una piattaforma microfluidica. Ciò ha permesso l'imaging in situ di complessi macromolecolari in un microambiente liquido. L'approccio di cattura è significativo rispetto ad altre tecniche di imaging microfluidico perché localizza campioni biologici nella finestra di imaging per negare grandi problemi diffusivi che sorgono durante la registrazione di immagini in liquido. Tuttavia, uno dei passaggi più critici del nostro protocollo prevede il trasferimento del biofilm lipidico sulla superficie del microchip. Se il monostrato lipidico non riesce a diffondersi uniformemente sulla griglia, ciò si tradurrà in un esperimento difettoso. Un'indicazione di un passaggio di trasferimento scadente è che gruppi virali poco o nessun sarà legato al chip fluidico. Una limitazione nella fase di trasferimento è la stabilità termica in relazione alla fluidità dello strato lipidico. Se la fase di trasferimento è inadeguata, come valutato dalla diffusione irregolare della goccia, gli strati lipidici devono incubare sul ghiaccio più a lungo o in una stanza fredda priva di vibrazioni. Inoltre, la piastra di Petri deve essere adeguatamente sigillata con Parafilm per mantenere la corretta umidità.
Un eccesso di complessi virali o proteine dell'adattatore nei campioni di microchip può portare a un eccessivo raggruppamento delle particelle. Questa è una limitazione nel protocollo che può essere facilmente gestita. Per ridurre al minimo l'effetto clustering, i fattori proteici possono essere incubati per un periodo di tempo più breve o il campione del virus deve essere ulteriormente diluito. Se viene rilevato un eccesso di proteine non specifiche, l'inclusione di imidazolo appena preparato (circa 50 mM) nella soluzione tampone può diminuire lo sfondo. L'uso di imidazolo fresco è un passo cruciale nel protocollo. Allo stesso modo, non sovraccaricare i chip con proteine purificate in quanto ciò non garantirà un legame specifico e si tradurrà in un esperimento difettoso. Le immagini conterranno un eccesso di proteine di fondo e non saranno adatte per le routine di elaborazione a valle. Un intervallo di concentrazione ottimale per le proteine purificate è di circa 0,01-0,1 mg/ml. Tuttavia, se questo intervallo non fornisce il livello previsto di particelle, la concentrazione del campione dovrebbe essere aumentata fino a raggiungere un livello ottimale. Un arricchimento delle particelle virali dovrebbe avvenire rispetto ai campioni di controllo negativi privi di adattatori molecolari, come gli anticorpi. Piccole quantità di legame non specifico nel controllo negativo possono verificarsi raramente, tuttavia, i microchip decorati con affinità dovrebbero sempre servire ad arricchire le particelle virali. Nel caso del rotavirus, attualmente non esiste un sistema genetico inverso per introdurre i Suoi tag nelle proteine capsidi come mezzo per catturare direttamente complessi virali su superfici decorate con Ni-NTA. I ribosomi con tag, tuttavia, sono stati reclutati con successo dai lisati batterici su chip elettronici decorati con Ni-NTA per esperimenti di imaging liquido16. Fornendo così prove, anche se limitate a questo punto, che le interazioni biologiche native si verifichino nelle cellule liquide mentre si trovano in una colonna TEM.
L'uso di detergenti, glicerolo e alti livelli di saccarosio deve essere evitato per l'imaging in situ. L'uso di questi reagenti creerà artefatti nelle immagini EM che includono un eccessivo gorgogliamento e funzionalità tenete nelle particelle, con conseguente scarsa qualità delle immagini. Se questi reagenti vengono utilizzati in preparati antivirus, il campione può essere dializzato in una soluzione tampone priva di questi componenti. I dispositivi Affinity Capture possono resistere a un certo grado di detergenti per un breve periodo di tempo, anche se questo deve essere determinato caso per caso. Si prega di fare riferimento all'elenco dei reagenti compatibili precedentementedescritti 22.
Per consentire routine di elaborazione delle immagini a valle, è possibile aggiungere una bassa concentrazione di reagente di contrasto alla camera microfluidica. Questo reagente non fissa campioni proteici, come le tradizionali procedure dicolorazione 17. Per assicurarsi che il liquido sia presente nella camera di imaging durante tutto il corso del tempo degli esperimenti, mettere a fuoco il fascio di elettroni fino a quando non si verifica la formazione di bolle (Figura 4). Questa è una semplice misura per indicare che i campioni rimangono idratati. I campioni liquidi incontrano gravi danni entro 2 minuti(Figura 4A)dall'esposizione continua del fascio di elettroni a 5 elettroni/Å2. L'esposizione prolungata continua del fascio di elettroni per 5 minuti(figura 4B)e oltre a questo dosaggio si tradurrà in un'eccessiva formazione di bolle nell'area di imaging.
La microscopia molecolare in situ utilizzata in combinazione con i dispositivi Affinity Capture consente l'esame di complessi biologici in soluzione utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Questi progressi tecnici sono resi possibili dall'uso di supporti per campioni microfluidici di nuova sviluppo. Tali dispositivi utilizzano sottili membrane di nitruro di silicio per formare una camera di imaging micro-scalata. Basandoci sul lavoro pionieristico di Parsons e colleghi7-10, forniamo una strategia utile per immaginiamo i singoli assiemi virali in soluzione. Il protocollo qui descritto spiega metodologie compatibili con le routine di elaborazione delle immagini a particella singola e i calcoli di ricostruzione 3D. Le applicazioni future che saranno il risultato della padronanza di queste tecniche possono includere l'imaging live-EM di macromolecole. Prevediamo che l'imaging in situ possa rivelare passaggi per l'assemblaggio virale, la regolazione della trascrizione o l'invasione delle cellule ospiti. In sintesi, l'uso di questi protocolli dovrebbe consentire ai ricercatori di studiare i processi dinamici in soluzione in modo completamente nuovo.
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Disclosures
L'autrice, Madeline J. Dukes, è un dipendente della Protochips, Inc.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il Dr. Michael J. Friedlander, direttore del Virginia Tech Carilion Research Institute per aver incoraggiato i nostri sforzi di ricerca. Questo progetto è stato sostenuto da fondi di sviluppo per S.M.M e D.F.K. e in parte dall'iniziativa Nano-Bio dell'Institute for Critical Technology and Applied Science di Virginia Tech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
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