Summary
سير العمل V3 هو إجراء لطخة الغربية باستخدام المواد الهلامية خالية من وصمة عار. تسمح التكنولوجيا الخالية من البقع للباحثين بتصور جودة فصل البروتين ، والتحقق من كفاءة النقل ، والأهم من ذلك ، التحقق من صحة التغيير في البروتين المثير للاهتمام باستخدام التحديد الكمي الكلي للبروتين كتحكم موثوق به في التحميل.
Abstract
البقعة الغربية هي تقنية مختبر مفيدة جدا ومعتمدة على نطاق واسع ، ولكن تنفيذها صعب. غالبا ما يوصف سير العمل بأنه "صندوق أسود" لأن التجريبي لا يعرف ما إذا كان قد تم تنفيذه بنجاح حتى آخر عدة خطوات. وعلاوة على ذلك، يتم تحدي جودة البيانات الغربية بسبب عدم وجود أدوات فعالة لمراقبة الجودة في جميع أنحاء عملية النشاف الغربية. هنا نحن نصف سير العمل الغربي V3 ، الذي يطبق تقنية خالية من البقع لمعالجة المخاوف الرئيسية المرتبطة ببروتوكول البقع الغربية التقليدية. هذا سير العمل يسمح للباحثين: 1) لتشغيل هلام في حوالي 20-30 دقيقة. 2) لتصور نوعية فصل العينة في غضون 5 دقائق بعد تشغيل هلام؛ 3) لنقل البروتينات في 3-10 دقيقة. 4) للتحقق من كفاءة النقل كميا؛ والأهم من ذلك 5) للتحقق من صحة التغيرات في مستوى البروتين من الفائدة باستخدام مجموع البروتين تحميل التحكم. هذا النهج الجديد يلغي الحاجة إلى تجريد وإعادة مسحة لبروتينات التدبير المنزلي مثل β أكتين، β-توبولين، GAPDH، الخ سير العمل V3 خالية من وصمة عار يجعل عملية لطخة الغربية أسرع وشفافة وأكثر كمية وموثوق بها.
Introduction
لطخة الغربية هي تقنية مفيدة جدا9، ومع ذلك ، هناك تحديان رئيسيان مع النشاف الغربي : عملية طويلة وكثيفة العمالة وجودة البيانات. بروتوكول التقليدية يتطلب حوالي 2 أيام. وهو ينطوي على العديد من الخطوات بما في ذلك إعداد العينة ، صب الجل ، البروتين الكهربائي ونقله ، حجب الأغشية يليه حضانة الأجسام المضادة ، والتصوير ، وفي كثير من الأحيان تجريد ، إعادة التجريد ، وأخيرا تحليل البيانات. طوال هذه العملية، لا توجد أدوات موثوقة ومرنة للتحكم في العملية. على هذا النحو، يمكن إدخال الأخطاء في كل خطوة، وهذه الأخطاء لديها القدرة على توليد البيانات الفنية؛ لذلك، عناصر تحكم التحميل ضرورية في النشاف الغربية لتحديد وتصحيح الأخطاء. عادة ما يتم التحكم في التحميل عن طريق التحقق من مستوى البروتين المرجعي في كل عينة لمعرفة ما إذا كان يتم تقديمه بالتساوي. الناس غالبا ما تستخدم بروتينات التدبير المنزلي، مثل β-أكتين، β-توبولين، GAPDH، والتحكم في التحميل.
تعتمد جودة بيانات البقع الغربية على التحكم الموثوق في التحميل. ولكن هناك شاغلان مشروعان عند استخدام بروتينات التدبير المنزلي لضوابط التحميل: 1) غالبا ما يكون التخميل المناعي القائم على الأجسام المضادة لعصابات بروتين التدبير المنزلي مشبعا وبالتالي لا يمكن للمرء التمييز بين اختلافات التحميل بينالعينات 30؛ 1) 2) قد يختلف مستوى التعبير البروتين التدبير المنزلي في العينات في ظل ظروف تجريبية معينة ، على سبيل المثال ، علاج سيرنا ، موت الخلية ، تمايز الخلية ، الخ11،28،3،6،10،21. وبسبب هذه المخاوف، تشترط المجلات العلمية الآن أنه "من أجل المقارنات الكمية، ينبغي استخدام الكواشف المناسبة والضوابط وطرق التصوير ذات نطاقات الإشارات الخطية" (المبادئ التوجيهية للطبيعة). وبالمثل، المحررين من مجلة التحقيق السريري يطلبون ضوابط تحميل أكثر موثوقية24. لهذه الأسباب، يحتاج بروتين التدبير المنزلي إلى التحقق من صحته من أجل استخدامه كتحكم في التحميل. أولا ، يجب على المرء التأكد من أنه يقاس في النطاق الديناميكي الخطي لطريقة التقييد المناعي14،29. ثانيا، على المرء أن يتأكد من التعبير عنها باستمرار في جميعالعينات 26,31,25,19,20.
الحل البديل للتحكم في التحميل الموثوق به هو استخدام قياس البروتين الكلي من البقعة. وقد لطخت بعض الباحثين البقع مع بقع البروتين الكلي، مثل كوماسي، فلامنغو بينك، سيبرو روبي، أميدو الأسود، بونسو S، والتكنولوجيا الخالية من البقع، لقياس إشارة البروتين الكلي في كل حارة كما التحكم في التحميل16،20،13،27،1،4،12. التحكم في تحميل البروتين الكلي يتجنب المزالق المرتبطة بروتينات التدبير المنزلي. أولا، هو انعكاس حقيقي لكمية البروتين المحملة لكل عينة. ثانيا، وصمة البروتين الكلية معارض ممتازة مجموعة ديناميكية خطية في نطاق التحميل المشترك لتحليل لطخة الغربية (10-50 ميكروجرام بروتين من lysate خلية معقدة) ويميز بدقة الفرق التحميل بينالعينات 12.
التكنولوجيا الخالية من البقع هي طريقة جديدة لتلطيخ البروتين الكلي حيث يتم خلط مركب فريد من نوعه في محلول هلام الأكريلاميد ويتم توزيعه بالتساوي في الجل المصبوب. بعد اكتمال الكهربائي، يتعرض الجل للأشعة فوق البنفسجية لمدة لا تقل عن دقيقة واحدة بحيث يتفاعل مركب البقع مع بقايا التربتوفان في البروتين. تصبح البروتينات مثيرة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لإعطاء إشارة فلورية قوية يمكن تصورها وقياسها كميا في صور ممكنة خالية من البقع مثل نظام ChemiDoc MP. ومع ذلك، فإن المركب الخالي من البقع نفسه لا يمتص ضوء الأشعة فوق البنفسجية، مما يؤدي إلى خلفية منخفضة لصورة الجل. تعديل بقايا التربتوفان لا رجعة فيه ويمكن تصور البروتينات ليس فقط في الجل ولكن أيضا على وصمة عار في أي وقت بعد نقل البروتين.
يتم تطبيق التكنولوجيا الخالية من البقع في سير العمل الغربي V3 (الشكل 1) لمعالجة الشكاوى الرئيسية حول سير العمل التقليدي ، وخاصة المخاوف المتعلقة باستخدام بروتينات التدبير المنزلي كعناصر تحكم في التحميل. باستخدام هذا سير العمل، يمكن للمرء أن: 1) تشغيل هلام في حوالي 20-30 دقيقة، 2) التحقق من سلامة العينة وجودة فصل البروتين في 5 دقائق بعد تشغيل هلام. 3) نقل البروتينات في 3-10 دقيقة. 4) التحقق من كفاءة النقل كميا؛ و 5) والأهم من ذلك، التحقق من صحة التغيرات في مستوى البروتين من الفائدة باستخدام مجموع البروتين تحميل التحكم.
Protocol
1. البروتين عينة الإعدادية
(وصف إجراء نموذجي لاستخراج البروتينات من زراعة الخلايا)
- ضع طبق زراعة خلايا HeLa في الثلج واغسل الخلايا بمحلول ملحي عازل من Tris البارد (TBS؛ 20 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5، 150 mM NaCl).
- أسبيرات TBS، ثم إضافة 1 مل لكل 100 ملم طبق الجليد الباردة RIPA العازلة (50 mM تريس-HCl pH 8.0، 150 mM NaCl، 1٪ NP-40، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم، 0.1٪ SDS) تكملها مثبطات فوسفاتاز وبروتياسي.
- كشط الخلايا الملتصقة من الطبق باستخدام مكشطة الخلايا البلاستيكية الباردة. نقل تعليق الخلية برفق إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المبردة مسبقا.
- الحفاظ على الهياج المستمر لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية على الدوار.
- تدور في 16000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية الطرد المركزي المبردة مسبقا.
- إزالة أنبوب بلطف من الطرد المركزي ومكان على الجليد. نقل supernatant إلى أنبوب جديد أبقى على الجليد، والتخلص من بيليه.
- إزالة حجم صغير (10-20 ميكرولتر) من اليزلات لإجراء فحص البروتين. تحديد تركيز البروتين لكل عينة باستخدام مجموعة المقايسة RC DC.
- إذا لزم الأمر، aliquot عينات البروتين للتخزين على المدى الطويل في -20 درجة مئوية. تكرار دورات التجميد والذوبان يسبب تدهور البروتين وينبغي تجنبها.
- تأخذ حوالي 20 ميكروغرام من كل عينة، إضافة حجم متساو من 2x Laemmli عينة المخزن المؤقت (4٪ SDS، 10٪ 2-mercaptoethanol، 20٪ الجلسرين، 0.004٪ بروموفينول الأزرق، 125 mM تريس-HCl، درجة الحموضة 6.8).
- سخني كل خلية في عينة عازلة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- جهاز طرد مركزي 16000 x g في جهاز طرد مركزي صغير لمدة دقيقة واحدة.
2. جل إلكتروفورسيس مع المواد الهلامية الخالية من البقع (~ 30 دقيقة)
- اتخاذ معيار TGX أي KD هلام مسبق الصب خالية من وصمة عار (هلام تنسيق ميدي)، وإزالة المشط والشريط من الجزء السفلي من كاسيت.
- ضع الكاسيت في خلية Standard واملأ غرفة المخزن المؤقت العلوي المدمجة بحاجز تشغيل 60 مل (25 مللي متر تريس، 190 مللي متر غليسين، 0.1٪ SDS، pH 8.3). شطف الآبار مع تشغيل العازلة.
- املأ كل نصف خزان المخزن المؤقت السفلي بحاجز يعمل 400 مل إلى خط التعبئة المميز.
- تحميل عينات البروتين وعلامات البروتين المناسبة.
- ضع الغطاء على الخزان، ومحاذاة مقابس الموز المرمزة بالألوان مع الرافعات المقابلة على الغطاء.
- تشغيل هلام ل~ 30 دقيقة في 200 V أو 20 دقيقة في 300 V.
3. التصوير هلام خالية من وصمة عار باستخدام نظام النائب Chemidoc للتحقق من جودة فصل البروتين (~ 5 دقيقة)
- إزالة كاسيت هلام من الخلية. استخدام أداة فتح كاسيت هلام في غطاء الخلية المعيار للقضاء فتح كاسيت والإفراج عن هلام.
- تطبيق بضع ملليلترات من الماء إلى مركز علبة عينة الأشعة فوق البنفسجية من الصور النائب ChemiDoc. ارفع الجل بعناية من الكاسيت وضعه على الدرج.
- إطلاق برنامج مختبر الصور والتقاط صورة هلام خالية من وصمة عار (الشكل 1A) مع الإعدادات التالية:
التطبيق: هلام خالية من وصمة عار
جل وقت التنشيط: 1 دقيقة
منطقة التصوير: جل المعيار
وقت التعرض للصور: تم تحسينه تلقائيا للنطاقات الأكثر كثافة - إزالة هلام من علبة العينة والمضي قدما على الفور لنقل الخطوة.
4. نقل البروتين مع نظام توربو عبر بلوت (~ 10 دقيقة)
- فتح عبر بلوت توربو ميدي PVDF حزمة نقل; ضع المكدس السفلي (الذي يتضمن الغشاء) على قاعدة كاسيت النقل.
- وضع الجل على رأس الغشاء، ووضع كومة أعلى على هلام، وطرح فقاعات.
- ضع الغطاء على قاعدة الكاسيت ثم قم بتشغيل القرص لقفله.
- أدخل الكاسيت في خليج النشاف.
- بدء نقل عن طريق تحديد برنامج توربو مسبقا واختيار معيار حجم هلام (ميدي)، ومن ثم اضغط RUN. يستغرق الركض النموذجي 7 دقائق فقط.
- عندما ينتهي النقل، قم بتفكيك شطيرة النشاف وضع كل من البقعة والجل في وعاء مع الماء المتأين.
5. خالية من وصمة عار جل والتصوير بلوت باستخدام نظام النائب Chemidoc للتحقق من كفاءة نقل البروتين والجودة (~ 5 دقيقة)
- ضع جل ما بعد النقل على صينية عينة من صور النائب ChemiDoc.
- إطلاق برنامج مختبر الصور والتقاط صورة خالية من وصمة عار من هلام ما بعد النقل (الشكل 1B) مع الإعدادات التالية:
التطبيق: هلام خالية من وصمة عار
جل وقت التنشيط: لا شيء
منطقة التصوير: جل المعيار
وقت التعرض للصورة: نفس الوقت مع وقت التعرض لصورة هلام ما قبل النقل - إزالة هلام من علبة العينة ومن ثم صورة وصمة عار (الشكل 1C) مع الإعدادات التالية. الحفاظ على لطخة الرطب مع بضع قطرات من الماء أو TBST عند التصوير.
التطبيق: وصمة عار خالية من وصمة عار
منطقة التصوير: جل المعيار
وقت التعرض للصور: تم تحسينه تلقائيا للنطاقات الأكثر كثافة - إزالة غشاء النشاف من علبة العينة ووضعه في وعاء مع TBST (0.1٪ توين 20 في TBS).
6. احتضان الأجسام المضادة
- كتلة عن طريق وضع وصمة عار في حل من 3٪ ألبوم مصل البقر (BSA) في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- احتضان لطخة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية الماوس التي أثيرت ضد البروتين الهدف الأول والأجسام المضادة الأولية أرنب أثار ضد البروتين الهدف الثاني.
- صب خارج الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية. بعد ذلك، اغسل البقعة عن طريق التحريض في 20 مل من TBST لمدة 5 دقائق. كرر 4x لما مجموعه 5 يغسل.
- احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في حل الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على Dylight 650 الأجسام المضادة للفأرة الماعز المترافقة و Dylight 549 الأجسام المضادة للأرانب المترافقة.
- صب خارج الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية. بعد ذلك، اغسل البقعة عن طريق التحريض في 20 مل من TBST لمدة 5 دقائق. كرر 4x لما مجموعه 5 يغسل.
7. التصوير وتحليل البيانات بواسطة برنامج مختبر الصور - تطبيع البروتين الكلي (~ 5 دقائق)
- الحصول على صورة فلورية متعددة من لطخة (الشكل 1E) عن طريق فتح بروتوكول متعدد القنوات الجديدة، وتكوين ثلاث قنوات الفلورسنت وتشغيل البروتوكول.
القناة 1:
التطبيق: لطخة دايلايت 650
منطقة التصوير: جل المعيار
وقت التعرض للصور: تم تحسينه تلقائيا للنطاقات الأكثر كثافة
القناة الثانية:
التطبيق: لطخة دايلايت 549
منطقة التصوير: جل المعيار
وقت التعرض للصور: تم تحسينه تلقائيا للنطاقات الأكثر كثافة
القناة الثالثة:
التطبيق: وصمة عار خالية من وصمة عار
منطقة التصوير: معيار هلام صورة التعرض الوقت: الأمثل تلقائيا لأشد العصابات - انقر فوق رمز التطبيع من مربع أداة التحليل وانقر فوق نعم للكشف عن الممرات والنطاقات.
- حدد واستخدم "أدوات الممرات والنطاقات" لإجراء تعديلات على الممرات والنطاقات إذا لزم الأمر.
- حدد الصورة الخالية من البقع كقناة التطبيع.
- حدد أدوات تحليل MW وعين مسارات MW القياسية عن طريق تحديد المربعات الموجودة أسفلها.
- لعرض وحدات التخزين التي تم تسويتها، انقر فوق جدول التحليل على شريط الأدوات. سيتم تنفيذ كافة العمليات الحسابية تلقائيا بواسطة البرنامج، بما في ذلك عامل التطبيع ووحدات التخزين العادية. يتم الآن تعديل قيم كثافة نطاق البروتين المستهدف للتنوع في حمولة البروتين. وهذا سيسمح بإجراء مقارنات دقيقة للبروتينات المستهدفة بين العينات.
Representative Results
1. تقييم سلامة العينة وجودة فصل البروتين وكفاءة النقل مع صور هلام خالية من البقع.
تم فصل استخراج البروتين من خلايا هيلا في 300 V لمدة 20 دقيقة على هلام معيار AnyKD TGX الخالي من البقع من 18 بئرا. تم تحميل عينات البروتين 3x في أربع كميات مختلفة (Lanes 1-3، 40 ميكروغرام؛ حارات 4-6، 30 ميكروغرام؛ حارات 7-9، 20 ميكروغرام؛ الممرات 10-12، 10 ميكروغرام). تم تنشيط الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقة واحدة. الشكل 2A يظهر صورة هلام المكتسبة مباشرة بعد فصل البروتين. يمكن تقييم سلامة عينة البروتين(مثل التدهور) وجودة الفصل(مثل هطول البروتين) بصريا باستخدام هذه الصورة الهلامية. ثم تم نقل البروتينات لمدة 7 دقائق إلى غشاء النيتروسليلوز باستخدام توربو Trans-Blot. يظهر الشكل 2B الصورة الخالية من البقع لجل ما بعد النقل. تم الحصول على الصورتين بنفس وقت التعرض (6.8 ثانية). وقد تم اختيار حارة 3 و 12 لقياس كفاءة النقل. باستخدام أداة وحدة التخزين في برنامج Image Lab ، تم رسم مربع مستطيل (أزرق) لتغطية الممر 3 و 12 على كل من الصور الهلامية. وقد أشار الحساب الذي يستند إلى قيم الحجم من هذه المربعات إلى أن كفاءة نقل كلا الممرين كانت 80٪(الشكل 2C). في هذه التجربة، تم اختيار هلام AnyKD TGX لدراسة البروتينات المستهدفة الصغيرة والمتوسطة الحجم ولم يتم تحسينه لنقل البروتينات الكبيرة. ويتطلب تحسين كفاءة النقل استخدام هلام أقل نسبة مئوية(على سبيل المثال 4-20٪) و / أو تعديل وقت النقل لتسهيل نقل البروتينات الكبيرة. 2. خالية من وصمة عار مجموع التحكم في تحميل البروتين هو بديل موثوق به للتدبير المنزلي تحميل التحكم في النشاف الغربية لتحديد تغيير طفيف في مستوى البروتين من الفائدة.
MCM-7 هو عامل تكرار ترخيص الحمض النووي ينخفض مستوى الذي بنسبة 20-50٪ في خطوط الخلايا الليمفاوية (LCL) بعد علاج التشعيع. في هذه التجربة، تم فصل الlysates (30 ميكروغرام لكل منهما) من أربع زراعة خط الخلية الليمفاوية المعالجة بالإشعاع (LCL) على هلام خال من البقع من المعيار 12 جيدا AnyKD TGX. تم تنشيط الجل لمدة دقيقة واحدة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ونقله بواسطة Trans-Blot Turbo إلى غشاء PVDF للبلط المناعي. تم فحص بروتين التدبير المنزلي GAPDH (الأخضر) مع الأجسام المضادة أرنب (تكنولوجيا الإشارات الخلية، الولايات المتحدة الأمريكية، 1:2،500) وDelight 549 المقترنة الماعز المضادة للأرانب الأجسام المضادة (روكلاند، الولايات المتحدة الأمريكية، 1:20،000). تم فحص البروتين من الفائدة MCM-7 (الأحمر) باستخدام الأجسام المضادة الماوس (Abcam، الولايات المتحدة الأمريكية، 1:1،000) و دايلايت 649 الماعز المترافقة المضادة للفأرة (روكلاند، 1:10،000).
ويبين الشكل 3A صورة فلورية متعددة الفلورسنت لمجموع البروتينات (الأزرق) وMM-7 (الأحمر) و GAPDH (الأخضر) التي تم اكتشافها في أربع عينات LCL المعالجة بالتحكم والتشعيع. الشكل 3B هو صورة خالية من البقع من نفس البقعة التي تظهر أنماط البروتين الكلي في كل عينة (30 ميكروغرام). اختار برنامج مختبر الصور ممرات العينة (المربعات الزرقاء) لقياس MCM-7 و GAPDH وإجمالي حجم البروتين في كل حارة. تم تطبيع مستويات MCM-7 إما ضد قياس البروتين الكلي الخالي من البقع أو ضد GAPDH. تم تحليل مستويات البروتين MCM-7 العادية إحصائيا ويتم عرض متوسط حجم نطاق البروتين MCM-7 والانحراف المعياري (n = 4) في الرسم البياني(الشكل 3C). وكشفت طريقتا التطبيع عن انخفاض طفيف (حوالي 25 في المائة) في النسبة المئوية للفترة 2000-2003. في مستويات البروتين MCM-7 بعد العلاج التشعيع. أظهرت البيانات مع تطبيع البروتين الكلي انحراف معياري أصغر من ذلك مع GAPDH كتحكم في التحميل.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 V3 سير العمل الغربية. يتم تصوير سير عمل V3 في العمود الأيسر في 4 خطوات. يتم عرض الأجهزة والكواشف الرئيسية المستخدمة في سير العمل في كل خطوة. كما يشمل الوقت المقدر لكل خطوة. يظهر العمود الأيمن أنه يمكن إنشاء 4 صور كحد أدنى في سير عمل V3. يتم وصف استخدام كل قطعة من البيانات. الصور الخالية من البقع من هلام ما قبل النقل ، هلام ما بعد النقل ، ولطخة (A ، B ، C) لا يمكن إنشاؤها بسهولة مع تقنيات النشاف الغربية التقليدية . توفر هذه الصور والبيانات معلومات ونقاط تفتيش مهمة على طول الإجراء لتحسين سيطرة العالم وقابلية إعادة إنتاجه لسير العمل الغربي. يمكن التقاط إشارات البروتين المستهدفة إما على صورة لطخة chemiluminescent(D)إذا تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية اقتران HRP في الكشف أو على صورة لطخة فلورية(E)إذا تم إجراء النشاف الغربي الفلوري المتعدد للكشف عن أكثر من بروتين مستهدف واحد في وقت واحد على نفس البقعة.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم صور خالية من البقع من المواد الهلامية قبل النقل وما بعد النقل في سير العمل الغربي V3 لتقييم سلامة العينة وجودة الفصل وكفاءة النقل. (أ) صورة هلام pretransfer خالية من وصمة عار. (ب) صورة هلام ما بعد النقل خالية من وصمة عار. (ج)قياس كفاءة نقل البروتين.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن مقارنة قياس البروتين الكلي الخالي من البقع بالانعتطاف المناعي GAPDH كعناصر تحكم في التحميل لتطبيع مستوى البروتين المثير للاهتمام. (أ) صورة لطخة الغربية الفلورسنت. (ب) صورة لطخة خالية من البقع. (ج) تطبيع مستويات البروتين MCM-7.
انقر هنا لعرض صورة أكبر.
Discussion
بروتوكول V3 خالية من وصمة عار المذكورة أعلاه هو لمتعددة النشاف الفلورسنت الغربية. ويمكن أيضا أن تطبق في النشاف الغربية باستخدام الكشف chemiluminescent. في بروتوكول لطخة الفلورسنت الغربية متعددة ، يتم الحصول على صور البقع الخالية من البقع في نقطتين زمنيتين: 1) مباشرة بعد نقل البروتين؛ 1) بعد نقل البروتين مباشرة؛ 1) بعد نقل البروتين مباشرة. 2) في خطوة التصوير الفلوري متعددة بعد حضانة الأجسام المضادة. يتم استخدام الصورة الأولى الخالية من البقع لحساب كفاءة النقل ويتم استخدام الصورة الثانية الخالية من البقع كتحكم في التحميل. عندما يتم تطبيق طريقة chemiluminescent، فإنه ليس من الممكن أن تأخذ صورة متعددة للإشارات البروتين خالية من وصمة عار والهدف، لأن إشارة chemiluminescent سوف تظهر في قناة خالية من وصمة عار أيضا. في هذه الحالة، نوصي باستخدام الصورة الخالية من البقع التي تم التقاطها مباشرة بعد خطوة نقل البروتين لتحميل التحكم وتحليل التطبيع.
يوفر سير العمل الغربي V3 الفوائد الفريدة التالية مقارنة بسير العمل الغربي التقليدي الذي يستخدم بروتينات التدبير المنزلي كعناصر تحكم في التحميل:
أولا، يوفر سير عمل V3 تحكم تحميل عملي ومريح وأكثر موثوقية للتحقق من صحة التغييرات في مستوى البروتين ذي الاهتمام. يستخدم بروتوكول V3 التحكم الكامل في تحميل البروتين لتطبيع مستوى البروتين الذي يتم قياسه في كل عينة. فإنه يتجنب اثنين من المزالق من استخدام البروتينات التدبير المنزلي كضوابط التحميل: التشبع المناعي ومستويات التعبير عن البروتين التدبير المنزلي غير متناسقة بين العينات في ظل ظروف تجريبية معينة. لم تعد خطوات تجريد وإعادة التجعيد بالأجسام المضادة الموجهة ضد التدبير المنزلي ضرورية. باستخدام التكنولوجيا الخالية من البقع ، ليست هناك حاجة لتلطيخ وإزالة وصمة عار مع بقع مثل Coomassie أو Sypro Ruby لقياس البروتين الكلي. يستغرق بضع ثوان فقط للحصول على صورة لطخة وحوالي 5 دقائق للقيام تطبيع البروتين الكلي باستخدام برنامج مختبر الصور.
ثانيا، يسمح سير عمل V3 للعلماء بالتحكم بشكل أفضل في الإجراء الغربي لأنه يجعل الإجراء أكثر شفافية ويدخل العديد من نقاط التفتيش لمراقبة الجودة. بمساعدة التكنولوجيا الخالية من البقع ، يمكن للباحثين تصور عينات البروتين الخاصة بهم على كل من الجل والبقعة. يمكن للعلماء تقييم سلامة عينة البروتين (المتدهورة أم لا)، ونوعية الفصل (عجلت أم لا)، وكفاءة النقل وجودة النقل (حتى نقل أم لا). تساعد نقاط التفتيش هذه الأبحاث على إنهاء التجربة عند رؤية عيوب كبيرة في العملية وتجنب إضاعة الوقت على العينات والبقع الفقيرة. هذه التكنولوجيا تساعد أيضا العلماء على تقييم ما إذا كان هناك كمية كبيرة من فقدان البروتين بعد تجريد الغشاء وما إذا كانت وصمة عار مناسبة ل reprobing هدف مختلف 4.
إليك بعض النصائح لضمان خبرة جيدة وبيانات ذات جودة عالية باستخدام سير العمل الغربي V3.
- صورة هلام مباشرة بعد تشغيل هلام. لا نقع الجل في أي عازلة قبل التصوير الأول في الإجراء لأنها قد تغسل المركب وصمة عار.
- استخدم نفس منطقة التصوير للحصول على كافة الصور في البروتوكول. وهذا سيسمح للبرنامج لتراكب الصور لتحليل البيانات مثل تطبيع البروتين الكلي.
- حافظ على وقت التعرض ثابتا عند تصوير المواد الهلامية السابقة للتحويل والمواد الهلامية اللاحقة للنقل. وهذا سيسمح للبرنامج بقياس كفاءة النقل كميا.
- الحفاظ على الغشاء الرطب مع بضع قطرات من الماء أو TBST عند الحصول على صورة لطخة. وهذا سوف تجنب المشاكل الخلفية القذرة المحتملة للكشف عن البروتين الهدف.
- استخدام منخفضة الفلورسنت PVDF غشاء لمتعددة النشاف الفلورسنت الغربية.
من المهم ملاحظة أن جزيء خالية من وصمة عار بعد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية لا رجعة فيه ملزمة بقايا التربتوفان. هذا التعديل لا رجعة فيه قد تؤثر على التعرف على مستضد عند استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة إذا كان الظهارة يحتوي على التربتوفان. من غير المرجح أن تتأثر الأجسام المضادة متعددة النسيلة لأنها تتعرف على عدة أسطح على المستضد. يتم غسل الجزيئات الخالية من البقع غير المنضمة بسهولة من الجل والغشاء وبالتالي لن تتداخل مع التفاعلات المضادة للمضاد.
في الختام، سير العمل الغربي V3 يجعل عملية لطخة الغربية أسرع وأكثر شفافية وكمية وأكثر موثوقية. يمكن للباحثين الآن بسهولة تطبيق التحكم الكامل في تحميل البروتين في تجربة لطخة غربية لجعل بياناتهم أكثر جدارة بالثقة. وقد اعتمد سير العمل V3 خالية من وصمة عار من قبل عدد من المختبرات، ومنشوراتها أظهرت أن المجلات تقبل البيانات الخالية من البقع والتحكم في التحميل في لطخةالغربية 22،17،7،8،5،23،18،15.
Disclosures
المؤلفون، أنطون بوش، جوناثان كون، كينيث أوه، مات هاموند، ونينغ ليو هم موظفون في مختبرات بيو راد، وشركة
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور وولف ديتر ستالز، والدكتور آرنو ريمي، والدكتور أنطون بوش، والدكتورة باتريشيا بياتي، وتوم ديفيز، وكريس سيموني، وجيف ديربان على مراجعتهم النقدية وتحريرهم لهذه المخطوطة. كما يشكر المؤلفون أليسون شوارتز على الدعم التقني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 | |
References
- Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).
- Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia. J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).
- Castaño, Z., Kypta, R. M. Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation. Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).
- Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).
- Dittmer, A., Dittmer, J. Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).
- Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers. J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).
- Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).
- Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis. Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).
- Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis. Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).
- Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage. DNA Repair. , (2013).
- Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark. Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).
- Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).
- Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian. , (2012).
- Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. Identification and validation of rice reference proteins for western blotting. J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).
- Liu, N. K., Xu, X. M. Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).
- Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans. J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).
- Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).
- Neill, U. S. All Data are not created Equal. J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).
- Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).
- Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro. BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots. Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).
- Welinder, C., Ekblad, L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis. J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).
- You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease. Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).
