Summary
V3 arbetsflöde är en western blot förfarande med fläckfria geler. Den fläckfria tekniken gör det möjligt för forskare att visualisera proteinseparationskvaliteten, för att verifiera överföringseffektiviteten, och viktigast av allt, validera förändringen i proteinet av intresse med hjälp av total proteink kvantifiering som en pålitlig lastkontroll.
Abstract
Den västra fläcken är en mycket användbar och allmänt antagen labbteknik, men dess utförande är utmanande. Arbetsflödet karakteriseras ofta som en "svart låda" eftersom en experimentalist inte vet om det har utförts framgångsrikt förrän det sista av flera steg. Dessutom utmanas kvaliteten på västerländska fläckar ibland på grund av bristen på effektiva verktyg för kvalitetskontroll under hela den västra blottningsprocessen. Här beskriver vi V3 västra arbetsflödet, som tillämpar fläckfri teknik för att ta itu med de stora problemen i samband med det traditionella västra fläckprotokollet. Detta arbetsflöde gör det möjligt för forskare: 1) att köra en gel på ca 20-30 min; 2) att visualisera provseparationskvaliteten inom 5 minuter efter gelkörningen, 3) att överföra proteiner på 3-10 min; 4) att kvantitativt kontrollera överföringseffektiviteten, och viktigast av allt 5) för att validera förändringar i nivån av proteinet av intresse med hjälp av total proteinbelastningskontroll. Detta nya tillvägagångssätt eliminerar behovet av att strippa och reproducera fläcken för hushållningsproteiner som β-aktin, β-tubulin, GAPDH, etc. V3-fläckfria arbetsflödet gör den västra fläckprocessen snabbare, transparent, mer kvantitativ och pålitlig.
Introduction
Western blot är en mycket användbar teknik9, men det finns två stora utmaningar med västerländsk blotting: lång och arbetsintensiv process och datakvalitet. Ett traditionellt protokoll kräver ca 2 dagar. Det innebär många steg inklusive provberedning, gelgjutning, proteinelektrofores och överföring, membranblockering följt av antikroppsinkubation, avbildning och ganska ofta strippning, återgivning och slutligen dataanalys. Under hela denna process finns det inga pålitliga och flexibla verktyg för processkontroll. Som sådan kan fel införas i varje steg, och dessa fel har potential att generera dataartefakter. Därför är lastningskontroller nödvändiga i västra blotting för att identifiera och korrigera för felen. Lastningskontrollen görs vanligtvis genom att kontrollera proteinnivån för ett referensprotein i varje prov för att se om det presenteras på samma sätt. Människor använder ofta hushållningsproteiner, β-aktin, β-tubulin, GAPDH, som lastkontroll.
Kvaliteten på västerländska fläckar beror på tillförlitlig lastkontroll. Men det finns två legitima farhågor när man använder hushållningsproteiner för lastningskontroll: 1) är den antikroppsbaserade immundetectionen av hushållningsproteinbanden ofta mättade och därför kan man inte skilja lastskillnaderna mellanproverna 30; 2) Städproteinuttrycksnivån kan variera i proverna under vissa experimentella förhållanden, till exempel siRNA-behandling, celldöd, celldidelning etc.11,28,3,6,10,21. På grund av dessa farhågor kräver vetenskapliga tidskrifter nu att "för kvantitativa jämförelser bör lämpliga reagenser, kontroller och bildframställningsmetoder med linjära signalintervall användas" (Naturriktlinje). På samma sätt ber redaktörer från Journal of Clinical Investigation om mer tillförlitliga lastkontroller24. Av dessa skäl måste ett hushållningsprotein valideras för att kunna användas som lastkontroll. För det första måste man se till att den mäts i immunodetectionmetodens linjära dynamiska intervall14,29. För det andra måste man se till att det uttrycks konsekvent i alla prover26,31,25,19,20.
En alternativ lösning till en tillförlitlig lastkontroll är att använda total proteinmätning från fläcken. Vissa forskare har färgat uppblåstheterna med totala proteinfläckar, såsom Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S och fläckfri teknik, för att mäta den totala proteinsignalen i varje körfält som lastkontroll16,20,13,27,1,4,12. Den totala proteinbelastningskontrollen undviker fallgroparna i samband med hushållningsproteiner. För det första är det en sann återspegling av mängden protein som laddas för varje prov. För det andra uppvisar den totala proteinfläcken utmärkt linjärt dynamiskt intervall i det gemensamma belastningsområdet för western blot-analys (10-50 μg protein i ett komplext celllyat) och skiljer noggrant lastskillnaden mellanproverna 12.
Fläckfri teknik är en ny total proteinfärgningsmetod där en unik förening blandas i akrylamidgellösning och fördelas jämnt i den gjutna gelén. När elektroforesen är klar utsätts gelén för UV-ljus i minst 1 minut så att fläckföreningen reagerar med tryptofanresterna i proteinet. Proteinerna blir upphetsande under UV-ljus för att ge en stark fluorescerande signal som kan visualiseras och kvantifieras i en fläckfri aktiverad imager som ChemiDoc MP-systemet. Den fläckfria föreningen själv absorberar dock inte UV-ljus, vilket resulterar i låg bakgrund av gelbilden. Modifieringen av tryptofanresterna är irreversibel och proteiner kan visualiseras inte bara i gelén utan också på fläcken när som helst efter proteinöverföring.
Den fläckfria tekniken tillämpas i V3 Western Workflow (figur 1) för att ta itu med de stora klagomålen om det traditionella arbetsflödet, särskilt problemen med att använda städproteiner som lastkontroller. Med hjälp av detta arbetsflöde kan man: 1) köra en gel på ca 20-30 min, 2) kontrollera provintegritet och proteinseparationskvalitet på 5 minuter efter gelkörning; 3) överföra proteiner på 3-10 min; 4) kontrollera överföringseffektiviteten kvantitativt, och 5) viktigast av allt, validera förändringar i nivån av proteinet av intresse med hjälp av total proteinbelastningskontroll.
Protocol
1. Förberedelse av proteinprov
(Ett typiskt förfarande för att extrahera proteiner från cellkulturen beskrivs)
- Placera HeLa-cellkulturrätten i is och tvätta cellerna med iskallt Tris-buffrat saltlösning (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).
- Aspirera TBS, tillsätt sedan 1 ml per 100 mm skål iskall RIPA-buffert (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0, 5% natriumdeoxycholat, 0, 1% SDS) kompletterad med fosfatas och proteashämmare.
- Skrapa av vidhäftande celler från skålen med en kall plastcellsskrapa; överför försiktigt cellfjädringen till ett förkylt mikrocentrifugrör.
- Håll konstant omrörning i 30 min vid 4 °C på en rotator.
- Snurra vid 16 000 x g i 20 min i en 4 °C förkyld centrifuge.
- Ta försiktigt bort röret från centrifugen och lägg det på is. Överför supernaten till ett nytt rör som hålls på is och kassera pelleten.
- Ta bort en liten volym (10-20 μl) lysat för att utföra en proteinanalys. Bestäm proteinkoncentrationen för varje prov med hjälp av RC DC-analyssatsen.
- Vid behov, alikvot proteinproverna för långtidslagring vid -20 °C. Upprepa frys- och upptiningscykler orsakar proteinnedbrytning och bör undvikas.
- Ta cirka 20 μg av varje prov, tillsätt en lika stor volym 2x Laemmli provbuffert (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,004% bromophenol blå, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8).
- Värm varje celllyat i provbuffert vid 95 °C i 5 minuter.
- Centrifugera vid 16 000 x g i en mikrocentrifug i 1 min.
2. Gel Elektrofores med fläckfria geler (~30 min)
- Ta ett kriterium TGX Alla KD fläckfria prefabricerade geler (en midi-formatgel), ta bort kammen och tejpen från botten av kassetten.
- Placera kassetten i kriteriecellen och fyll den integrerade övre buffertkammaren med 60 ml löpbuffert (25 mM Tris, 190 mM glycin, 0,1% SDS, pH 8,3). Skölj brunnarna med löpbuffert.
- Fyll varje halva av den nedre bufferttanken med 400 ml löpbuffert till den markerade fyllningslinjen.
- Ladda proteinproverna och lämpliga proteinmarkörer.
- Placera locket på tanken och rikta in de färgkodade bananpluggarna med motsvarande uttag på locket.
- Kör gelén i ~30 min på 200 V eller 20 min vid 300 V.
3. Fläckfri gelavbildning med Chemidoc MP-systemet för att kontrollera proteinseparationskvaliteten (~ 5 min)
- Ta bort gelkassetten från cellen. Använd gelkassettöppningsverktyget i Criterion Cell-locket för att öppna kassetten och lossa gelén.
- Applicera ett par milliliter vatten i mitten av UV-provbrickan på ChemiDoc MP-avbildaren. Lyft försiktigt upp gelén från kassetten och lägg den på brickan.
- Starta Image Lab-programvaran och fånga den fläckfria gelbilden( Figur 1A) med följande inställningar:
Tillämpning: fläckfri gel
Aktiveringstid för gel: 1 min
Bildområde: kriteriegel
Bildexponeringstid: automatiskt optimerad för de mest intensiva banden - Ta bort gelén från provbrickan och fortsätt omedelbart för att överföra steget.
4. Proteinöverföring med Trans-Blot Turbo System (~ 10 min)
- Öppna ett Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Pack; placera bottenstacken (som inkluderar membranet) på basen av överföringskassetten.
- Placera gelén ovanpå membranet, placera toppstapeln på gelén och rulla ut bubblor.
- Placera locket på kassettbasen och vrid ratten för att låsa den.
- Sätt i kassetten i blotterfacket.
- Starta överföringen genom att välja ett förinkoppat Turbo-program och välja Kriteriumgelstorlek (midi) och tryck sedan på RUN. En typisk körning tar bara 7 min.
- När överföringen är över demonterar du den fördärvarsmörgåsen och placerar både fläcken och gelén i en behållare med avjoniserat vatten.
5. Fläckfri gel och fläckavbildning med Chemidoc MP-systemet för att kontrollera proteinöverföringseffektivitet och kvalitet (~ 5 min)
- Placera gelen efter överföringen på provbrickan på ChemiDoc MP-avbildaren.
- Starta Image Lab-programvaran och fånga den fläckfria bilden av gelén efter överföringen (figur 1B) med följande inställningar:
Tillämpning: fläckfri gel
Aktiveringstid för gel: ingen
Bildområde: kriteriegel
Bildexponeringstid: samma till exponeringstiden för föröverföringsgelbilden - Ta bort gelén från provbrickan och avbilda sedan fläcken (bild 1C) med följande inställningar. Håll fläcken våt med några droppar vatten eller TBST vid avbildning.
Tillämpning: fläckfri fläck
Bildområde: kriteriegel
Bildexponeringstid: automatiskt optimerad för de mest intensiva banden - Ta bort blottingmembranet från provbrickan och placera det i en behållare med TBST (0,1% Interpolering 20 i TBS).
6. Antikroppsinkubation
- Blockera genom att placera fläcken i en lösning av 3% bovint serumalbumin (BSA) i TBST vid rumstemperatur i 1 timme.
- Inkubera fläcken över natten vid 4 °C i den lösning som innehåller musens primära antikropp som höjts mot det första målproteinet och kaninantikroppen som höjts mot det andra målproteinet.
- Häll ut lösningen som innehåller den primära antikroppen. Tvätta sedan fläcken genom att agitera i 20 ml TBST i 5 minuter. Upprepa 4x för totalt 5 tvättar.
- Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur i den sekundära antikroppslösningen som innehåller en Dylight 650 konjugerad goat-antimusantikropp och en Dylight 549 konjugerad goat-anti-rabbit antikropp.
- Häll ut lösningen som innehåller den primära antikroppen. Tvätta sedan fläcken genom att agitera i 20 ml TBST i 5 minuter. Upprepa 4x för totalt 5 tvättar.
7. Bild- och dataanalys av Image Lab Software - Total Protein Normalization (~5 min)
- Skaffa en fluorescerande bild av fläcken (figur 1E) genom att öppna ett nytt flerkanalsprotokoll, konfigurera tre fluorescerande kanaler och kör protokollet.
Kanal 1:
Tillämpning: fläckdylight 650
Bildområde: kriteriegel
Bildexponeringstid: automatiskt optimerad för de mest intensiva banden
Kanal 2:
Tillämpning: fläckdylight 549
Bildområde: kriteriegel
Bildexponeringstid: automatiskt optimerad för de mest intensiva banden
Kanal 3:
Tillämpning: fläckfri fläck
Bildområde: kriteriegel Exponeringstid för bild: automatiskt optimerad för de mest intensiva banden - Klicka på ikonen Normalisering i rutan Analysverktyg och klicka på Ja för att identifiera körfält och band.
- Välj och använd "Lanes and Bands tools" för att göra justeringar på körfält och band vid behov.
- Välj fläckfri bild som normaliseringskanal.
- Välj MW Analysis Tools och tilldela MW standardbanor genom att markera rutorna under dem.
- Om du vill visa de normaliserade volymerna klickar du på analystabellen i verktygsfältet. Alla beräkningar utförs automatiskt av programvaran, inklusive normaliseringsfaktorn och normaliserade volymer. Värdena för målproteinbandsintensitet justeras nu för variation i proteinbelastningen. Detta möjliggör exakta jämförelser av målproteiner bland proverna.
Representative Results
1. Bedömning av provintegritet, proteinseparationskvalitet och överföringseffektivitet med fläckfria gelbilder.
Protein extrakt från HeLa celler separerades vid 300 V i 20 min på en 18-brunn Criterion AnyKD TGX fläckfri gel. Proteinproverna laddades 3x vid fyra olika mängder (körfält 1-3, 40 μg; Körfält 4-6, 30 μg; Körfält 7-9, 20 μg; Körfält 10-12, 10 μg). Gelén aktiverades under UV-ljus i 1 min. Bild 2A visar gelbilden som förvärvats direkt efter proteinseparationen. Proteinprovets integritet(t.ex. nedbrytning) och separationskvalitet(t.ex. proteinutfällning) kan bedömas visuellt med denna gelbild. Proteiner överfördes sedan i 7 minuter till ett nitrocellulosamembran med Trans-Blot Turbo. Bild 2B visar den fläckfria bilden av gelén efter överföringen. Båda bilderna förvärvades med samma exponeringstid (6,8 sek). Körfält 3 och 12 valdes ut för att mäta överföringseffektiviteten. Med hjälp av volymverktyget i Image Lab-programvaran ritades en rektangulär låda (blå) för att täcka körfält 3 och 12 på båda gelbilderna. Beräkningen baserad på volymvärdena från dessa rutor visade att överföringseffektiviteten för båda körfälten var 80 %(figur 2C). I detta experiment valdes AnyKD TGX-gelen för att studera små till medelstora målproteiner och den optimerades inte för överföring av stora proteiner. Att optimera överföringseffektiviteten skulle kräva användning av lägre procentuell gel(t.ex. 4-20%) och/eller en justering av överföringstiden för att underlätta överföringen av stora proteiner. 2. Fläckfri total proteinbelastningskontroll är ett tillförlitligt alternativ till städningskontroll i västra blotting för att kvantifiera en liten förändring av proteinnivån av intresse.
MCM-7 är en DNA-licensreplikationsfaktor vars nivå minskar med 20-50% i lymfablastoida cellinjer (LCL) efter bestrålningsbehandling. I detta experiment separerades lysates (30 μg vardera) av fyra kontroll- och bestrålningsbehandlade lymfablastoidcelllinjekulturer (LCL) på en 12-brunnskriteriet AnyKD TGX fläckfri gel. Gelén aktiverades i 1 min under UV-ljus och överfördes av Trans-Blot Turbo till ett PVDF-membran för immunblottning. Hushållningsproteinet GAPDH (grön) undersöktes med en kaninantikropp (Cell Signaling Technology, USA, 1:2,500) och en Dylight 549 konjugerad Goat-anti-rabbit antikropp (Rockland, USA, 1:20,000). Proteinet av intresse MCM-7 (röd) sonderades med hjälp av en musantikropp (Abcam, USA, 1:1,000) och en Dylight 649 konjugerad Goat-anti-mouse antikropp (Rockland, 1:10,000).
Figur 3A visar en multiplex fluorescerande bild av totala proteiner (blå), MCM-7 (röd) och GAPDH (grön) som detekteras i fyra kontroll- och bestrålningsbehandlade LCL-prover. Figur 3B är en fläckfri bild av samma fläck som visar de totala proteinmönstren i varje prov (30 μg). Bildlabbets programvara valde provbanorna (blå lådor) för att mäta MCM-7, GAPDH och den totala proteinvolymen i varje körfält. MCM-7 nivåer normaliserades antingen mot fläckfria totala protein mätning eller mot GAPDH. De normaliserade MCM-7 proteinnivåerna analyserades statistiskt och den genomsnittliga MCM-7 proteinbandsvolymen och standardavvikelsen (n=4) presenteras i diagrammet (Figur 3C). Båda normaliseringsmetoderna visade en liten minskning (ca 25%) i MCM-7 proteinnivåer efter bestrålningsbehandling. Data med den totala proteinnormaliseringen uppvisade en mindre standardavvikelse än den med GAPDH som lastkontroll.
Figur 1. V3 Västra arbetsflöde. V3-arbetsflödet visas i den vänstra kolumnen i 4 steg. De viktigaste instrumenten och reagenserna som används i arbetsflödet visas i varje steg. Den beräknade tiden för varje steg ingår också. Den högra kolumnen visar att minst 4 bilder kan genereras i V3-arbetsflödet. Användningen av varje data beskrivs. De fläckfria bilderna av förtransfergelen, gelen efter överföringen och fläcken (A, B, C) kan inte genereras lätt med traditionella västerländska blottingtekniker; Dessa bilder och data ger viktig information och kontrollpunkter längs proceduren för att förbättra forskarens kontroll och reproducerbarhet av västra fläckarbetsflödet. Målproteinsignalerna kan fångas antingen på en chemiluminescent blotbild (D) om en HRP-konjugerad sekundär antikropp applicerades vid detektion eller på en fluorescerande fläckbild (E) om multiplexerande fluorescerande västra blotting utfördes för att upptäcka mer än ett målprotein samtidigt på samma fläck.
Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Fläckfria bilder av föröverförings- och postöverföringsgeler i V3:s västra arbetsflöde för att bedöma provintegritet, separationskvalitet och överföringseffektivitet. A)Förtransfer gel fläckfri bild. (B) Efter överföring gel fläckfri bild. C)Mätning av proteinöverföringseffektivitet.
Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Jämföra fläckfri total proteinmätning med GAPDH immunodetection som lastkontroller för att normalisera nivån av protein av intresse. (A)Fluorescerande western blot bild. (B)Fläckfri fläckbild. C)Normaliserade MCM-7 proteinnivåer.
Klicka här om du vill visa större bild.
Discussion
V3 fläckfria protokollet som beskrivs ovan är för multiplexerande fluorescerande västra blotting. Det kan också appliceras i västra blotting med hjälp av chemiluminescent detektion. I multiplex fluorescerande västra fläck protokollet förvärvas de fläckfria fläckarna vid två tidpunkter: 1) direkt efter proteinöverföring; 2) vid multiplex fluorescerande bildbehandling steg efter antikropp inkubation. Den första fläckfria bilden används för att beräkna överföringseffektiviteten och den andra fläckfria bilden används som laddningskontroll. När den chemiluminescerande metoden tillämpas är det inte möjligt att ta en multiplexbild för de fläckfria och målproteinsignalerna, eftersom den chemiluminescerande signalen också kommer att dyka upp i den fläckfria kanalen. I det här fallet rekommenderar vi att du använder den fläckfria bilden som tas direkt efter proteinöverföringssteget för lastkontroll och normaliseringsanalys.
V3:s västra arbetsflöde ger följande unika fördelar jämfört med det traditionella western blot-arbetsflödet som använder hushållningsproteiner som lastningskontroller:
För det första ger V3-arbetsflödet en praktisk, bekväm och mer tillförlitlig lastkontroll för att validera förändringarna i nivån på proteinet av intresse. V3-protokollet använder en total proteinbelastningskontroll för att normalisera nivån på det protein som är av intresse mätt i varje prov. Det undviker två fallgropar av att använda hushållningsproteinerna som lastkontroller: mättad immundetection och inkonsekventa städproteinuttrycksnivåer bland proverna under vissa experimentella förhållanden. Strippning och återebråelse av steg med antikroppar riktade mot hushållning är inte längre nödvändiga. Med hjälp av fläckfri teknik finns det inget behov av att fläcka och avfärga en fläck med fläckar som Coomassie eller Sypro Ruby för total proteinmätning. Det tar bara några sekunder att få en fläckbild och ca 5 min att göra total proteinnormalisering med Image Lab-programvara.
För det andra gör V3-arbetsflödet det möjligt för forskare att ta bättre kontroll över det västra förfarandet eftersom det gör proceduren mer transparent och introducerar flera kontrollpunkter för kvalitetskontroll. Med hjälp av fläckfri teknik kan forskare visualisera sina proteinprover på både gelén och fläcken. Forskare kan bedöma proteinprovets integritet (försämrad eller inte), separationskvalitet (fälld eller inte), överföringseffektivitet och överföringskvalitet (till och med överföring eller inte). Dessa kontrollpunkter hjälper forskare att avsluta experimentet när de ser stora brister i processen och undvika att slösa tid på dåliga prover och fläckar. Denna teknik hjälper också forskare att bedöma om det finns en betydande mängd proteinförlust efter membranborttagning och om fläcken är lämplig för att reproducera ett annat mål 4.
Här är några tips för att säkerställa god erfarenhet och kvalitetsdata med V3 western workflow.
- Avbilda gelén direkt efter gelkörning. Blötlägg inte gelén i någon buffert före den första avbildningen i proceduren eftersom den kan tvätta bort fläckföreningen.
- Använd samma bildområde för att hämta alla bilder i protokollet. Detta gör det möjligt för programvaran att överlagra bilder för dataanalys, till exempel total proteinnormalisering.
- Håll exponeringstiden konsekvent vid avbildning av föröverförings- och efteröverföringsgelerna. Detta gör det möjligt för programvaran att kvantitativt mäta överföringseffektiviteten.
- Håll membranet vått med några droppar vatten eller TBST när du förvärvar fläckbilden. Detta kommer att undvika eventuella smutsiga bakgrundsproblem för målproteindetektering.
- Använd lågfluorescerande PVDF-membran för multiplexering av fluorescerande västra blotting.
Det är viktigt att notera att den fläckfria molekylen efter UV-aktivering är oåterkalleligt bunden till tryptofanrester. Denna irreversibla modifiering kan potentiellt påverka antigenigenkänning vid användning av monoklonala antikroppar om epitopen innehåller tryptofan. Polyklonala antikroppar påverkas sannolikt inte eftersom de känner igen flera epitoper på antigenet. Obundna fläckfria molekyler tvättas lätt bort från gelén och membranet och kommer därför inte att störa antikroppsantigeninteraktioner.
Sammanfattningsvis gör V3:s västra arbetsflöde den västra fläckprocessen snabbare, mer transparent, kvantitativ och mer tillförlitlig. Forskare kan nu enkelt tillämpa total proteinbelastningskontroll i ett västerländskt fläckexperiment för att göra sina data mer tillförlitliga. V3-fläckfria arbetsflödet har antagits av ett antal laboratorier, och deras publikationer har visat att tidskrifter accepterar fläckfria data som laddningskontroll i västrafläcken 22,17,7,8,5,23,18,15.
Disclosures
Författarna Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond och Ning Liu är anställda vid Bio-Rad Laboratories, Inc.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi och Jeff Durban för deras kritiska granskning och redigering av detta manuskript. Författarna tackar också Allison Schwartz för tekniskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
| Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
| EQUIPMENT | |||
| Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
| ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 | |
References
- Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).
- Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia. J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).
- Castaño, Z., Kypta, R. M. Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation. Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).
- Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).
- Dittmer, A., Dittmer, J. Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).
- Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers. J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).
- Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).
- Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis. Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).
- Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis. Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).
- Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage. DNA Repair. , (2013).
- Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark. Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).
- Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).
- Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian. , (2012).
- Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. Identification and validation of rice reference proteins for western blotting. J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).
- Liu, N. K., Xu, X. M. Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).
- Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans. J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).
- Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).
- Neill, U. S. All Data are not created Equal. J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).
- Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).
- Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro. BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots. Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).
- Welinder, C., Ekblad, L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis. J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).
- You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease. Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).
