Abstract
Cellulosomes הם קומפלקסי multienzyme בדידים בשימוש על ידי קבוצת משנה של חיידקים אנאירוביים ופטריות לעכל מצעי lignocellulosic. הרכבה של האנזימים על חלבון פיגום noncatalytic בבימויו של אינטראקציות בין בני משפחה של זוגות הקולטן ליגנד נלווים הכוללים מודולים cohesin וdockerin אינטראקציה. חזק מאוד מחייב בין cohesin ותוצאות מודולים dockerin בקבועי דיסוציאציה בpicomolar הנמוכה לטווח nanomolar, שעלולה לעכב מדויקות מדידות מחוץ לשיעור בשיטות בתפזורת קונבנציונלית. כוח ספקטרוסקופיה מולקולה בודדת (SMFS) עם מיקרוסקופ הכוח האטומי מודדת את התגובה של ביומולקולות פרט לכוח, וזאת בניגוד לשיטות אחרות מולקולה בודדת מניפולציה (כלומר פינצטה אופטית), היא אופטימלי לחקר אינטראקציות רצפטור ליגנד זיקה גבוהה בגלל היכולת שלו לחקור את עתיר כוח המשטר (> 120 PN). כאן אנו מציגים הפרוטוקול המלא שלנו ללימוד Cellulמכלולי חלבון osomal ברמת המולקולה בודדת. באמצעות הטופולוגיה חלבון נגזרת מcellulosome הילידים, שעבדנו עם האנזים-dockerin ופחמימות מחייבים מודול-cohesin (CBM-cohesin) חלבוני היתוך, כל אחד עם קבוצת תיאול החופשית נגישה בשאריות ציסטאין מהונדסות. אנו מציגים פרוטוקול קיבוע משטח ספציפי לאתר שלנו, יחד עם המדידה שלנו והליך ניתוח הנתונים לקבלת פרמטרים המחייבים מפורטים למתחם הזיקה גבוהה. אנו מדגימים כיצד לכמת את הכוחות יחיד משנה התגלגלות, כוחות קרע מורכבים, הקינטית מחוץ לשיעורים, ורוחב פוטנציאלי של כריכה היטב. היישום המוצלח של שיטות אלה באפיון האינטראקציה cohesin-dockerin אחראית על הרכבה של קומפלקסי cellulolytic multidomain מתואר נוסף.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3-Aminopropyl dimethyl ethoxysilane | ABCR GmbH | AB110423 | |
5 kDa NHS-PEG-maleimide | Rapp Polymer | 13 5000-65-35 | |
TCEP Disulfide reducing gel | Thermo Scientific, Pierce | 77712 | www.thermoscientific.com/pierce |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | |||
BioLever mini silicon nitride cantilevers | Olympus | BL-AC40TS-C2 | Soft batches |
XYZ Piezoelectric actuators | Physik Instrumente GmbH | ||
Infrared “broad spectrum” IR laser | Superlum | ||
MFP-3D AFM Controller | Asylum Research | ||
Igor Pro 6.31 | Wavemetrics | Data acquisition and analysis | |
Sodium chloride | |||
Calcium chloride | |||
pH Meter | |||
Sodium borate | |||
Tweezers | |||
Cover glasses | Thermo Scientific, Menzel-Gläser | 24 mm diameter, 0.5 mm thickness | |
PTFE sample holder | custom made | ||
Sonicator bath | |||
Ethanol | analytical purity | ||
Sulfuric acid (concentrated) | analytical purity | ||
Hydrogen peroxide (30%) | analytical purity | ||
Orbital shaker | |||
Toluene | analytical purity | ||
Filter paper | |||
Glass slides | |||
Microtubes | |||
Micropipettes | |||
Centrifuge | suitable for microtubes | ||
Rotator | |||
Petri dishes | |||
Beakers | |||
Optical microscope |
References
- Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
- Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J.
From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008). - Binnig, G., Quate, C. F.
Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986). - Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
- Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
- Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
- Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
- Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
- Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Stahl, S. W., Nash, M. A., et al.
Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012). - Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
- Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E.
B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007). - Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
- Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
- Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
- Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
- Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F.
Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994). - Marko, J. F., Siggia, E. D.
Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995). - Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
- Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
- Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
- Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
- Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
- Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
- Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
- Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
- Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
- Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
- Dietz, H., Rief, M.
Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006). - Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
- Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).