Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Published: December 20, 2013 doi: 10.3791/50950
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität
* These authors contributed equally

Abstract

Cellulosomes הם קומפלקסי multienzyme בדידים בשימוש על ידי קבוצת משנה של חיידקים אנאירוביים ופטריות לעכל מצעי lignocellulosic. הרכבה של האנזימים על חלבון פיגום noncatalytic בבימויו של אינטראקציות בין בני משפחה של זוגות הקולטן ליגנד נלווים הכוללים מודולים cohesin וdockerin אינטראקציה. חזק מאוד מחייב בין cohesin ותוצאות מודולים dockerin בקבועי דיסוציאציה בpicomolar הנמוכה לטווח nanomolar, שעלולה לעכב מדויקות מדידות מחוץ לשיעור בשיטות בתפזורת קונבנציונלית. כוח ספקטרוסקופיה מולקולה בודדת (SMFS) עם מיקרוסקופ הכוח האטומי מודדת את התגובה של ביומולקולות פרט לכוח, וזאת בניגוד לשיטות אחרות מולקולה בודדת מניפולציה (כלומר פינצטה אופטית), היא אופטימלי לחקר אינטראקציות רצפטור ליגנד זיקה גבוהה בגלל היכולת שלו לחקור את עתיר כוח המשטר (> 120 PN). כאן אנו מציגים הפרוטוקול המלא שלנו ללימוד Cellulמכלולי חלבון osomal ברמת המולקולה בודדת. באמצעות הטופולוגיה חלבון נגזרת מcellulosome הילידים, שעבדנו עם האנזים-dockerin ופחמימות מחייבים מודול-cohesin (CBM-cohesin) חלבוני היתוך, כל אחד עם קבוצת תיאול החופשית נגישה בשאריות ציסטאין מהונדסות. אנו מציגים פרוטוקול קיבוע משטח ספציפי לאתר שלנו, יחד עם המדידה שלנו והליך ניתוח הנתונים לקבלת פרמטרים המחייבים מפורטים למתחם הזיקה גבוהה. אנו מדגימים כיצד לכמת את הכוחות יחיד משנה התגלגלות, כוחות קרע מורכבים, הקינטית מחוץ לשיעורים, ורוחב פוטנציאלי של כריכה היטב. היישום המוצלח של שיטות אלה באפיון האינטראקציה cohesin-dockerin אחראית על הרכבה של קומפלקסי cellulolytic multidomain מתואר נוסף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyl dimethyl ethoxysilane ABCR GmbH AB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimide Rapp Polymer 13 5000-65-35
TCEP Disulfide reducing gel Thermo Scientific, Pierce 77712 www.thermoscientific.com/pierce
Tris(hydroxymethyl)aminomethane
BioLever mini silicon nitride cantilevers Olympus BL-AC40TS-C2 Soft batches
XYZ Piezoelectric actuators Physik Instrumente GmbH
Infrared “broad spectrum” IR laser Superlum
MFP-3D AFM Controller Asylum Research
Igor Pro 6.31 Wavemetrics Data acquisition and analysis
Sodium chloride
Calcium chloride
pH Meter
Sodium borate
Tweezers
Cover glasses Thermo Scientific, Menzel-Gläser 24 mm diameter, 0.5 mm thickness
PTFE sample holder custom made
Sonicator bath
Ethanol analytical purity
Sulfuric acid (concentrated) analytical purity
Hydrogen peroxide (30%) analytical purity
Orbital shaker
Toluene analytical purity
Filter paper
Glass slides
Microtubes
Micropipettes
Centrifuge suitable for microtubes
Rotator
Petri dishes
Beakers
Optical microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
  2. Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).
  3. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  4. Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  5. Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
  6. Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
  7. Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  8. Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
  9. Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  12. Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
  13. Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).
  14. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
  15. Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
  16. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  17. Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
  18. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
  19. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  20. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  21. Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
  22. Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
  23. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  24. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).
  25. Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
  26. Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
  27. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
  28. Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
  29. Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
  30. Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
  31. Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
  32. Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
  33. Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
  34. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  35. Dietz, H., Rief, M. Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).
  36. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
  37. Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).
חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jobst, M. A., Schoeler, C.,… More

Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (82), e50950, doi:10.3791/50950 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter