Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Summary

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Abstract

In dit protocol bieden wij een methode om dendritische cellen (DC) en epitheelcellen (TEC) isoleren van de humane thymus. DC en TEC zijn de belangrijkste antigeen presenterende cel (APC) soorten gevonden in een normale thymus en het is bekend dat ze verschillende rollen spelen tijdens de thymus selectie. Deze cellen zijn gelokaliseerd in verschillende micro-omgevingen in de thymus en elke soort APC maakt slechts een kleine populatie van cellen. Om verder inzicht in de biologie van deze celtypen karakterisatie van deze celpopulaties is zeer wenselijk maar door hun lage frequentie, isolatie van een van deze celtypen vereist een efficiënte en reproduceerbare werkwijze. Dit protocol detailleert een methode die geschikt zijn voor karakterisatie van diverse cellulaire eigenschappen te verkrijgen. Thymusweefsel mechanisch verstoord en na verschillende stappen van enzymatische digestie, wordt het resulterende celsuspensie verrijkt met een Percoll dichtheid centrifugatie stap. Voor isolatie van myeloïde DC (CD 11 c <sup> +), cellen van de lage-dichtheid-fractie (LDF) worden immunoselected door magnetische celsortering. Verrijking van TEC populaties (MTES, Ctec) wordt bereikt door depletie van hematopoietische (CD45 ^hi cellen) van de lage-dichtheid Percoll celfractie waardoor hun verdere isolering via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met specifieke cel markers. De geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen.

Introduction

De thymus is het orgaan waarin T cel ontwikkeling optreedt. De relatieve en absolute omvang afneemt met de leeftijd als het achtereenvolgens wordt vervangen door vet hoewel thymus activiteit nog kan worden gedetecteerd in de ouderdom. Het belang van de immuunrespons aangetoond in de vroege jaren 1960 ^1.

De T-cel repertoire wordt gevormd door de interactie van T-celreceptoren met peptide-MHC complexen op verschillende soorten thymus APC, die leven of dood cues de ontwikkeling T-cellen, wat resulteert in een functioneel en grotendeels zelfverdraagzaam T cel repertoire ^2.

Ongeveer 98% van de cellen in de humane thymus ontwikkelen T genoemd thymocyten cellen. De resterende 2% bestaat uit een aantal verschillende celtypen, waaronder een verscheidenheid van TEC (corticale, medullair, subcapsulaire), myeloïde en plasmacytoïde DC (mDC PDC), macrofagen, B cellen, volwassen re-circulerende T-cellen, granulocyten, fibroblasts, endotheelcellen en zeer zeldzame epitheliale cellen met een expressie fenotype lijkt op die van cellen van andere weefsels zoals spieren, neuronen en respiratoire epitheel (figuur 1). Van deze, TEC en DC zijn de belangrijkste APC soorten gevonden in een normale thymus. In de afgelopen jaren is de zuivering van deze APC types voor cultuur en moleculaire profiel kreeg meer en meer belangstelling. Door hun lage frequentie, isolatie van een van deze celtypen voor gedetailleerde analyse vereist een efficiënt, reproduceerbaar en kosten-effectieve procedure. De hier gepresenteerde methode is een wijziging van eerder gepubliceerde studies ^3,4.

Zoals bij andere weefsels, kunnen cellen extractie uit de thymus worden bereikt door enzymatisch opsplitsing van de cel-cel en cel-matrix interacties netwerken, om een ​​suspensie van afzonderlijke cellen te verkrijgen. Er zijn bepaalde parameters, zoals goede dissociatie efficiëntie, celopbrengst, leefbaarheid en behoud van cellen en celurface markers die cruciaal zijn en moeten worden geoptimaliseerd voor de succesvolle isolatie van deze zeldzame celpopulaties.

In dit protocol wordt isolatie van DC en TEC subsets uitgevoerd door een enkele celsuspensie van weefsel door mechanische verbreking en enzymatische digestie. We gebruiken Collagenase Een van Clostridium histolyticum, die een uitgebalanceerde verhouding van verschillende enzym activiteiten heeft, af te breken de inheemse collageen, dat het weefsel bij elkaar houdt. DNase I is in de enzymoplossing naar cel aggregatie te verminderen door vrij DNA van dode cellen (thymocyten zijn zeer gevoelig). We hebben bovendien een alternatieve benadering van de typische enzymatische digestie weefsel met mechanische en enzymatische weefselbehandelelektrode bijgestaan ​​door een weefsel Dissociator. De celsuspensie wordt dan onderworpen aan een Percoll dichtheid centrifugatie voor verrijking van lage dichtheid fractie (LDF) cellen. Van deze fractie van de cellen, kan DC door kleuring f worden geïsoleerdof DC-oppervlaktemerkers (bijvoorbeeld CD 11 c ⁺⁾ en met behulp van magnetische scheiding of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). In tegenstelling tot de lymfoïde cellen die de meeste cellen in de thymus, hoeft TEC CD45 niet tot expressie op een hoog niveau, maar positief voor de epitheliale cel adhesie molecuul EpCAM. CTEC kunnen worden onderscheiden van medullaire TEC door de expressie van een toch ongedefinieerde antigeen herkend door de CDR-2 (corticale dendritische reticulocyten-2) antilichaam ^4,5 en iets lager EpCAM-expressie. De differentiële co-expressie van EpCAM en CDR2 maakt de efficiënte isolatie van deze TEC subsets via high-speed celsortering ^6.

De hier gepresenteerde protocol geoptimaliseerd voor menselijke thymus weefsel. De duur van de procedure is gebaseerd op de hoeveelheid weefsel en het vermogen van de experimentator en de snelheid van de cel sorteerder als FACS sortering wordt gebruikt. Normaal gesproken kan het protocol voor de isolatie van DC binnen 5-6 Uur en voor de isolatie van VEG 8-10 uur. De isolatie van DC en TEC subsets van thymusweefsel is tijd gevoelig. Hoe sneller de isolatieprocedure, hoe beter de toestand van de cellen. Tenslotte kunnen de geïsoleerde cellen worden voor verder onderzoek als vergelijkende studies van mRNA en eiwitexpressie PCR experimenten eiwitisolatie, moleculaire profiel (dwz transcriptomics, micro RNA-analyse) en celkweek ^6.

Ethiek Verklaring

Om te kunnen werken met menselijke thymus weefsel moet de onderzoeker om goedkeuring te verkrijgen van de lokale ethische commissie of de verantwoordelijke overheden als een geïnformeerde schriftelijke toestemming van de donor (of meestal zijn of haar ouders, omdat weefsel wordt meestal verkregen uit minderjarig kinderen). Bovendien moeten alle menselijke weefsels worden behandeld als potentieel infectieus en passende maatregelen moeten worden genomen, zoals het werken met handschoenen, etc.

Protocol

1. Voorbereiding van gereedschap, Enzyme Solutions, en Buffers

Voer de volgende voorbereidende stappen voor het begin van het protocol.

1. Gereedschap
   Schone, droge en autoclaaf de volgende hulpprogramma's en bewaar ze in een steriele verpakking tot het gebruik.
   1. Kleine scherpe schaar met ofwel gebogen of rechte tips voor het snijden van de thymus weefsel. Kleine gebogen pincet met gekartelde tips voor het omgaan met het weefsel.
   2. 50 ml Oak Ridge Centrifugeglazen, PC, voor de Percoll dichtheid centrifugeren stap.
2. Enzymoplossingen
   Bereid de collagenase / DNase I enzym mix (2 mg collagenase / ml en 0,1 mg DNase I / ml) als volgt:
   1. Los 500 mg gelyofiliseerd collagenase A (Roche) in 250 ml RPMI 1640 effen (zonder FCS) een 2 mg / ml collagenase oplossing. Collagenase is heel moeilijk op te lossen, dus het is aangeraden om het te verlaten enige tijd op een roller-shaker bij kamertemperatuur.
   2. Los 100 mg DNase I (Roche) in10 ml steriel gedistilleerd water. 2,5 ml porties kunnen bij -20 ° C worden bewaard Voeg 2,5 ml van de 10 mg DNase I oplossing in de 2 mg collagenase A oplossing.
   3. Steriel filter de Collagenase / DNase mix met een Stericup filtereenheid (0,22 pm). Bewaren in 10-20 ml porties bij -20 ° C tot gebruik.
3. Buffers en oplossingen
   1. 1,5 M NaCl stockoplossing: Los NaCl in steriel gedestilleerd water tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 M. Filtreer de oplossing door een 0,22 urn filter en opslag bij kamertemperatuur.
   2. 10x MACS buffer: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-vrij)} met 5% BSA en 20 mM EDTA. Filtreer steriel de oplossing met een 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C. Voorafgaand aan het gebruik bereiden een 1x oplossing door verdunning van de 10x voorraad om 1x in koude steriele 1x PBS.
   3. FACS buffer: 1x PBS ^{(Ca2 +} / ^{Mg2 +-vrij)} bevattende 1% BSA en 0,02% _NaN3.
   4. FACS buffer voor celsortering: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg

2. Bereiding van de Tissue

De verwerking van het weefsel moet worden uitgevoerd met steriele reagentia en werken in een laminaire flowkast. Voordat de procedure begint, bereiden de volgende reagentia en apparatuur:

1. 1. Verwarm de volgende RT: RPMI 1640 compleet medium (RPMI 1640, 10% foetaal kalf serum, 1% pen / strep), RPMI 1640 vlakte, Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-vrij} PBS en 2x Collagenase / DNase enzym oplossing.
   2. Warme thermische incubator met rotatie-eenheid 37 ° C en koel vaste hoek rotor centrifuge bij 4 ° C.
   3. Bereid een doos met ijs.

Opmerking: de duur van deze stap hangt af van de conditie en grootte van het weefsel. Ongeveer 20-30 min is redelijke termijn nodig is voor een middelgrote stuk tissue in goede staat (~ 5 cm breed).

2. Plaats weefsel in een petrischaal met steriele PBS en afspoelen eventueel resterende bloed.
   1. Voeg verse PBS om weefsel te voorkomen drogen en behulp van een tang en schaar schoon het weefsel van bloedstolsels, bindweefsel en vetweefsel en een deel dat niet gezond uitziet.
   2. Zorg ervoor necrotisch weefsel dat het enig vuil zal toenemen verwijderen.
   3. Na het reinigen, wegen weefsel ter referentie.
   4. Snijd het weefsel in ongeveer 1 cm ³ stuks / blokken. Voeg genoeg PBS om het weefsel te dekken.

Opmerking: Voor de reproduceerbaarheid van de resultaten, moet het weefsel in stukken van gelijke grootte worden gesneden.

3. De achterkant van een steriele injectiespuit (10-20 ml) druk uitoefenen (niet te hard of langdurige) op de thymusweefsel stukken. Deze procedure zal het grootste deel van thymocyten verwijderen, waardoor het volume weefsel verminderen later worden verteerd. Voer deze stap uit op ijs en werken snel.
4. De oplossing zal zichtbaar troebel als thymocytes worden vrijgegeven. Roer het gerecht zachtjes en vervolgens met behulp van een pipet 5 ml of een glas afzuiger verwijder het supernatant dat de thymocytes zorg niet aan het weefsel stukken per ongeluk te zuigen.

Tip: Een steriele celkweek schraper kan worden gebruikt om alle weefselstukken concentreren aan een zijde van de schotel kantelt de schaal (45 ° angle) en zuig de supernatant. Vervangen met verse PBS en herhaal deze procedure tot de bovenste is relatief transparant. Voer laatste wassen met RPMI vlakte.

5. Hak weefsel stukken met behulp van een scherpe schaar (zo fijn mogelijk, moeten fragmenten tenminste 2-4 mm). De fragmenten klein genoeg om een ​​pipet 5 ml te betreden.

3. Voorbereiding van enkele celsuspensie van Thymus Tissue

Hiertwee alternatieve benaderingen voor deze stap worden beschreven. De eerste aanpak beschrijft een typische enzymatische weefsel spijsvertering (paragraaf 3.1), terwijl de tweede behelst mechanische en enzymatische weefsel behandeling bijgestaan ​​door een tissue Dissociator (paragraaf 3.2).

Dit protocol is geoptimaliseerd voor de behandeling van weefsel monsters van 5 g. Voor grotere of kleinere weefselmonsters, dienovereenkomstig aan enzym volumes.

3.1 Typische enzymatische digestie weefsel een enkele celsuspensie te vinden

1. Plaats puree weefsel in 50 ml buizen met 10 ml collagenase / DNase oplossing per 5 g weefsel. Voeg RPMI duidelijk tot een totaal volume van 20 ml.

Opmerking: in een 50 ml buisje verteren tot 10 g weefsel. Pas enzym volume dienovereenkomstig.

2. Incubeer het weefsel suspensie 40 minuten bij 37 ° C onder langzame rotatie in een thermische incubator.

Opmerking:

3. Het enzym oplossing zal troebel worden als cellen vrijkomen in het. Aan het einde van de digestie, centrifugebuis van 110 g gedurende 2 minuten om weefsel fragmenten sedimenteren.
4. Verzamel supernatant van deze vertering ronde. Pellet de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 400 x g. Zuig supernatant en resuspendeer cellen in 10-50 ml RPMI volledig afhankelijk van de grootte van de cel pellet.
5. Houd celsuspensie in 37 ° C incubator met de dop los.
6. Bij grotere aantallen cellen gewenst zijn, kan de vertering stap worden herhaald met de resterende weefsel fragmenten en de eerste en de tweede gepoolde verteren. Ook als TEC worden geïsoleerd, twee rondes van digesties worden uitgevoerd.
7. Verdun een aliquot van de celsuspensie in trypan blauw (1:10-1:100) en tel levensvatbare cellen met een hemocytometer. Houd cellen bij 37 ° C in de incubator tot klaar om verder te gaan naar de Percoll dichtheid centrifugeren (paragraaf 4). Daaropvolgende isolatie van DC subsets (paragraaf 5) zal worden uitgevoerd uit deze cellen.

Opmerking: thymus weefsels kunnen variëren in samenstelling, in het bijzonder met de leeftijd, waarbij de vertering efficiëntie en het genereren van een enkele-celsuspensie beïnvloedt.

9. Voor de verdere isolatie van thymus epitheelcellen (TEC) een derde ronde van enzymatische afbraak is vereist. Hersuspenderen weefsel resten in 10 ml vers Collagenase / DNase oplossing plus 10 ml RPMI vlakte en voeg trypsine / EDTA (01:50 van 2,5% voorraad) in de oplossing.
10. Incubeer bij 37 ° C gedurende 40 minuten onder zacht rotatie. Gedurende de laatste 10 - 15 minuten van de incubatie commentaar FCS (01:05) om de activiteit van trypsine te neutraliseren.
11. Centrifugeer bij 110 xg gedurende 2 min bij RT om het weefsel fragmenten sedimenteren.

12. Verzamel de celsupernatant en gooi de gesedimenteerde weefselfragmenten.
13. Centrifugeer de cel supernatant bij 400 xg gedurende 10 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer celpellet in RPMI compleet.

Tip: Celpellets zijn vrij los, dus zorg bij inlevering / aspireren supernatant.

14. Telling levensvatbare cellen met een hemocytometer. Plaats de cellen in een 37 ° C incubator totdat gaan tot scheiding (deel 4) Percoll. Latere pre-verrijking van TEC cellen door uitputting van CD45 ^hi cellen zullen worden uitgevoerd vanuit deze cellen (hoofdstuk 6).

3.2 Mechanische en enzymatische weefsel behandeling bijgestaan ​​door een tissue Dissociator

7,8 dissociëren.

1. Overdracht 5 g gehakt weefsel stukken (stap 2.5) in een C Tube met 10 ml collagenase / DNase oplossing.
2. Adapt C buis op het weefsel Dissociator and run programma m_spleen_02 (10 sec). Herhaal dit programma 4-5x (40-50 sec).
3. Incubeer met zachte rotatie gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
4. Centrifugeer bij 110 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
5. Verzamel supernatant en ga als in stap 3.1.4. Voeg 10 ml vers Collagenase / DNase oplossing.
6. Adapt C buis op het weefsel Dissociator and run programma m_spleen_01 (56 sec).
7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten onder zacht rotatie.
8. Centrifugeer bij 110 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
9. CollecT-cel supernatant en pellet de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 400 x g. Ga als in stap 3.1.4.
10. Zoals beschreven in 3.1.9 een derde ronde van digestie is nodig voor de daaropvolgende isolatie van thymus epitheelcellen (TEC). Hiervoor resuspendeer weefsel resten in 10 ml vers collagenase / DNase oplossing plus trypsine / EDTA (1:50 verdunning leverbaar 2,5%)
11. Incubeer bij 37 ° C gedurende nog 20 minuten onder zacht rotatie. Voeg FCS (01:05) en incubeer verdere 10 minuten.

Opmerking: Met deze aanpak, na deze laatste digestiestap het weefsel wordt meestal volledig gescheiden en geen onverteerd weefsel fragmenten worden waargenomen.

12. Ga als in stappen 3.1.11-3.1.14.

4. Verrijking van LDF van cellen met behulp Percoll dichtheid Scheiding

Na enzymatische digestie van het weefsel, worden totale thymus cel suspensies onderworpen aan een Percoll dichtheid centrifugation stap te verrijken voor de LDF cellen. De LDF van cellen wordt sterk verrijkt voor APC. Zowel DC en TEC worden gedetecteerd in deze fractie van de cellen.

1. Gebruik enkele celsuspensie verkregen uit de 1 ^e en 2 ^e verteert voor mDC isolatie (samengevoegde cellen, zie stap 3.1.8) of ^3e digest (voor TEC isolatie) (3.1.14). Centrifugeer celsuspensie verkregen uit digestie stap 400 xg gedurende 10 minuten.
2. Bereid een Percoll oplossing met een uiteindelijke dichtheid van 1,07 g / ml tijdens de wasstap (zie voorbeeld in onderstaande tabel).

   Bereiding van Percoll oplossing tot een uiteindelijke dichtheid van 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
   Buis Nee	1	2	3	4
   Onverdund Percoll (ρ = 1,130) (ml)	2.96	5.92	8.88	11.84
   1,5 M NaCl (ml)	0.6	1.20	1.8	2.4
   gedestilleerd H2 O (ml)	2.44	4.88	7.32	9.76
   Volume van de uiteindelijke werken verdunning	6 ml	12 ml	18 ml	24 ml

3. Het aantal Percoll buizen afhankelijk van het aantal cellen bepaald in stap 3.1.8 en / of 3.1.14. Combineer de steriele oplossingen en meng. Voor een optimale isolatie, kan 0.6-1 x 10 ⁹ cellen per buis van Percoll worden geladen. Combineer de steriele oplossingen en meng.

Tip: Percoll is lichtgevoelig en bovendien koud moet worden bewaard. Maak eerst het mengsel dat het NaCl en _H2O (RT) en voeg onverdund Percoll duur, net voor het resuspenderen van de cellen in de Percoll oplossing.

tent "> NB: Percoll dichtheid kan variëren tussen de verschillende leveranciers en batches Als de dichtheid van de onverdunde Percoll oplossing is niet gelijk aan 1,130 g / ml, gebruik dan de instructies van de fabrikant om de exacte bedragen van Percoll en H ₂ O te berekenen vereist om een ​​uiteindelijke dichtheid van 1,07 g / ml te krijgen.

4. Resuspendeer tot 1 x 10 ⁹ cellen in 6 ml van de bereide Percoll oplossing (ρ = 1.07), meng voldoende om een homogene suspensie te krijgen, en transfer naar een 50 ml Oak Ridge polycarbonaat schroefdop centrifugebuis.
5. Layer voorzichtig 30 ml RPMI compleet per buis met een pipet bovenop de Percoll oplossing / celsuspensie. Laad het medium langzaam, zodat het blijft bovenop de suspensie en verzorgen de laag niet te verstoren.
6. Weeg de buizen om ervoor te zorgen dat zij dezelfde gewichten, zodat ze in balans tijdens het centrifugeren. Als ze niet voorzichtig meer medium toe te voegen aan de lichtere buis (onder sterile voorwaarden).
7. Breng zorgvuldig de buizen naar een vooraf gekoelde centrifuge met vaste hoek rotor en centrifugeren bij 3.500 g gedurende 35 min bij 4 ° C met de rem uit. Zorg ervoor dat de temperatuur van de centrifuge niet hoger dan 4 ° C.
8. Verwijder buizen uit de centrifuge en voorzichtig verzamel de verrijkte APC, gevonden op interfase tussen Percoll midden (lage-dichtheid-fractie) van elke buis met behulp van een steriele Pasteur pipet. Overdracht cellen in een 50 ml buis met koud RPMI compleet. Vul de buis om te verdunnen de resterende Percoll.
9. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 min bij 300 xg bij 4 ° C. Gooi supernatant en herhaal wassen.
10. Resuspendeer de celpellet in middelgrote en bepaalt het aantal cellen (met trypan blauw en een hemocytometer). In onze ervaring, het percentage van de cellen LDF ongeveer 2-20% van de totale enkelvoudige celsuspensie verkregen na enzymdigestie. Een typische yfield van de lage dichtheid verrijkte cellen (van een jonge thymus, bereik 1 dag-2 jaar) is 1x10 ⁸ cellen per 1 x 10 ^9, wat neerkomt op een 10% van de alleenstaande totale celsuspensie cellen.

NB: In dit stadium kunt u zien dat cellen geaggregeerd in de suspensie (vooral met monsters van kinderen van oudere leeftijd). Celklonten zijn indicatie van celdood en resultaat van de introductie van DNA van de stervende cellen die cellen aan elkaar kunnen plakken. In dat geval voegt DNase I in het monster (50 ug / ml) en incubeer voor maximaal 20 minuten bij kamertemperatuur (voorzichtig omkeren elke 5 minuten) het vrije DNA-moleculen verteren.

5. Isolatie van Thymic mDC

Na APC verrijking (via Percoll scheiding) kan mDC efficiënt worden geïsoleerd van de LDF na de eerste en tweede ronde van enzymatische ontsluitingen. Het volgende protocol is een aangepaste versie van magnetische celscheiding voor de isolatie van mDC (CD11c

1. Centrifugeer APC verrijkte cellen geisoleerd uit de enkele celsuspensie verkregen uit de samengevoegde eerste en tweede enzymatische digestie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer celpellet in 100 pl MACS buffer per 10 ⁷ cellen.
2. Voeg 5 ul van CD11c-PE antilichaam per 10 ⁷ cellen.

Opmerking: Titratie-experimenten worden aanbevolen voor optimale resultaten.

3. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
4. Was de cellen door toevoeging van 1-2 ml MACS buffer per 10 ⁷ cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten.
5. Zuig supernatant volledig Resuspendeer maximaal 10 ⁷ cellen in 80 ui MACS-buffer.
6. Voeg 20 ul anti-PE microbolletjes per 10 ⁷ cellen.
7. Meng goed (Do Not Vortex) en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht.
8. Herhalen als in stap 5.4. Resuspendeer tot 10 ⁸ cellen in 500 pi buffer.
9. Eventueel filter celsuspensie met een 40 um cel zeef om vuil en celaggregaten die de stroom van de kolom kan belemmeren te verwijderen.
10. Gebruik een LS kolom sinds thymus celsuspensies stromen beter door de LS kolommen. Bereid LS kolom volgens de instructies van de fabrikant. Pipet celsuspensie langzaam in de kolom vermijden genereren bubbels. Gebruik een kolom voor elk 1 x 10 ⁸ cellen.
11. Waskolom volgens de instructies van de fabrikant. Verwijder kolom magneet en plaats deze in een steriele 12 ml ronde bodem polypropyleen buis. Voeg 3 ml MACS buffer op de kolom en verzamel magnetisch gemerkte cellen door het plaatsen en stevig de zuiger in de kolom.
12. Verzamel de geëlueerde fractie die de CD11c ⁺ mDC en centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 minuten.
13. Bepaal het aantal cellen en bevestig zuiverheid van de geselecteerde cel populatiesdoor flowcytometrische analyse. Stelde merkers omvatten CD45, CD11c en HLA-DR.

Opmerking: CD 11 c ⁺ mDC kunnen ook worden geïsoleerd met behulp van een FACS sorter.

6. Verrijking van CD45 ^{lo / neg} Cellen voor Cell Sorting van TEC

Voor isolatie van TEC, de cellen kunnen vooraf worden verrijkt door uitputting van CD45 ^hi cellen met behulp van CD45 microbeads, om te versnellen hun isolement via cel sortering.

Gebruik enkele celsuspensie verkregen uit de ^3e digestiestap (3.1.14) en vervolgens gescheiden op Percoll centrifugeren.

1. Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer celpellet in 80 ui MACS buffer per 10 ⁷ cellen.
2. Gebruik CD45 microkorrels 1/3 van de aanbevolen hoeveelheid (6,7 pl) per 10 ⁷ cellen.

Opmerking: Door het gebruik van een lager bedragvan de microbolletjes we vooraf verrijken cellen voor zowel CD45 ^lo en CD45 ^negatieve cellen. Titratie wordt aanbevolen voor een optimaal resultaat.

3. Meng goed door voorzichtig flicking de buis (Do Not Vortex) en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
4. Wash ongebonden microkorrels door toevoeging van 10 ml MACS-buffer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 xg bij 4 ° C. Aspireren supernatans volledig.
5. Resuspendeer tot 10 ⁸ cellen in 500 pi buffer.
6. Eventueel filter celsuspensie met een 70 um cel zeef om vuil en celaggregaten die de stroom van de kolom kan belemmeren te verwijderen.
7. Gebruik een LS kolom sinds thymus celsuspensies stromen beter door de LS kolommen. Bereid LS kolom volgens de instructies van de fabrikant. Pipet celsuspensie langzaam in de kolom vermijden genereren bubbels. Gebruik een kolom voor elke 10 ⁸ cellen.
8. Verzamel ongelabelde cellen (doorstroom en wassingen) bevattendede CD45 ^{lo / neg} celfractie en wassen kolom volgens de instructies van de fabrikant.
9. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer celpellet in steriele FACS buffer om het aantal cellen te bepalen en verder met kleuring op celsortering.

7. Stain Cellen voor fluorescentie geactiveerde celsortering

1. Voer de FcR blokkeren vóór cel kleuring, om niet-specifiek antilichaam binding reduceren. Incubeer celsuspensie met gepoolde humane immunoglobulinen oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Deze reagentia zijn commercieel verkrijgbaar (bijvoorbeeld Gammunex 10% oplossing).
2. Was de cellen door toevoeging van koude steriele FACS-buffer. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 6 min bij 4 ° C.
3. Gooi supernatant en resuspendeer cellen in koude steriele FACS buffer. Bereid 5 monsters volgens het volgende voorbeeld:
   

   * Scc; enkele kleur controle

   Incubeer de cellen met antilichamen gedurende 30 min op ijs in het donker.
   Tweemaal wassen met FACS-buffer cellen door centrifugeren bij 400 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C.
   Stel de celconcentratie van het monster wordt gesorteerd tot 1 x10 ⁷ cellen / ml (of de concentratie aanbevolen door celsortering faciliteit) met steriele FACS buffer voor celsortering (dwz zonder _NaN3).
   Passeren cel monster door een 70 um cel zeef om elke cel klonten die de cytometer kunnen verstoppen tijdens het sorteren te verwijderen.
   Resuspendeer controlemonsters 200-400 gl buffer. Houd buizen op ijs en beschermd tegen licht.
   Bereid collectie buizen met medium.

   Opmerkingen:

   • Voer titratie van antilichamen voor optimale kleuring.
   • In een monster sorteren, kan tot 50 x 10 ⁶ cellen worden gekleurd in een totaal reactievolume van500 pi.
   • Voer kleuring van het monster te sorteren in 5 ml Falcon polystyreen ronde bodem buizen. De uniforme kleur controles kan worden gekleurd in afzonderlijke putjes van een 96-well plaat.
   • Omdat TEC subsets zijn zeldzaam bevolking, is het raadzaam om een ​​ander positief marker (van hoge frequentie) gebruiken voor elke fluorochroom om de bepaling van de juiste FACS instellingen te vergemakkelijken en ervoor te zorgen dat u de juiste vergoeding indien de keuze van fluorochromen vereist compensatie. Cellen van de CD45 ⁺ fractie kan worden gekleurd met merkers zoals CD45, CD3 en CD8 voor verschillende fluorochromen en na kleuren ongekleurde CD45 ⁺ cellen kunnen worden toegevoegd aan het monster.

   8. Isolatie van TEC door Fluorescence Activated Cell Sorting

   TEC subsets kan worden gesorteerd van de CD45 ^{lo / negatieve} fractie als EpCAM ^hi CDR2 ^- (MTES) of EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   1. Laat het monster with de ongekleurde cellen en de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing om de bevolking van belang in schaal plaatsen aanpassen. Regel de spanning op elke detector zodat de cellen zichtbaar maar ligt in het meest linker deel van het histogram.
   2. Run elke afzonderlijke lood monster en compensatie voor elke kleur aan te passen.
   3. Na het aanpassen van de spanning en de compensatie voor de ongekleurde en enkele gebrandschilderde controles uitvoeren van de steekproef te worden gesorteerd en gebruik gating tools om de bevolking van belang te definiëren. Gebruik een brede voorwaartse en zijwaartse verstrooiing poort naar inclusie van alle stromale cel maten zorgen, terwijl exclusief cel puin.
   4. Op de stip perceel met CD45-Pacific Blue versus Forward Scatter hek aan de CD45 ^lage en CD45 ^negatieve cellen.
   5. Pas deze poort naar een EpCAM versus CDR2 dot plot en bepalen door gating de bevolking te sorteren.
   6. Zodra poorten zijn bepaald, selecteert u de poorten die de bevolking van belang en beginnen te sorteren.

   Opmerking: Bij sortering om cellen te voorkomen dat aan de wanden van de verzamelbuis, de buis kan vooraf worden bekleed met vullen met 50% FCS in PBS en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Gooi de coating oplossing voor het toevoegen collectie media.

   Representative Results

   Als uitgangsmateriaal in dit protocol gebruiken wij thymus weefsel verwijderd uit kinderen die corrigerende cardiovasculaire chirurgie (Ministerie van Borst en Cardiovasculaire Chirurgie, universiteitskliniek Tübingen) verkregen na geïnformeerde toestemming en onder institutionele richtlijnen. Deze afgedankte materiaal kan sterk variëren in grootte 2-30 g of meer. Het aantal mDC en TEC subsets (Ctec en MTES) die worden verkregen afhankelijk van de grootte en de leeftijd van de thymus weefselmonster gebruikt voor isolatie.

   Figuur 2 toont een vrij groot stuk weefsel (~ 9 cm) verkregen van een kind zes jaar oud. Een belangrijke eerste voorbereidende stap in dit protocol is het reinigen van het weefsel ongewenste delen (aangegeven met witte pijlen).

   Thymus weefsel werd behandeld zoals vermeld in de punten 2 en 3.1 van het protocol bij een enkele schorsing cel die werd gescheiden met behulp van een enkele Percoll dichtheid centrifugeren s te verkrijgenTEP Terwijl de enkele celsuspensie bevat ongeveer 3% van de HLA-DR +-cellen (Figuur 3A) na centrifugeren Percoll dit percentage wordt verhoogd in de lage-dichtheid-fractie (LDF), met groot formaat cellen, tot 15-40%, terwijl de hoge dichtheid fractie (HDF) die hoofdzakelijk uniforme kleine thymocyten bestaat bevat nauwelijks dergelijke cellen (Figuur 3B). De fractie van belang (LDF), werd die verrijkt APC vervolgens opgevangen en gewassen cellen voor gebruik in daaropvolgende stappen afzonderlijk verzamelen.

   Terwijl thymus mDC kan worden geïdentificeerd door de expressie van een aantal oppervlakte merkers, waaronder CD11c9, 10, pDC expressie merkers zoals BDCA-2, BDCA-4, CD45RA en CD123 ^11,12. Na verrijking van de LDF cellen, beide celtypen vormen 2-10% van deze fractie, waardoor de efficiënte isolatie ook in grotere aantallen, door magnetische celscheiding of flow sorteren van CD11c ⁺ en BDCA-4 ⁺cellen ^6.

   Figuur 4 toont de efficiënte isolatie van CD11c ⁺ cellen met behulp van de gemodificeerde magnetische cel scheidingsprotocol in hoofdstuk 5 beschreven. Na isolatie van de zuiverheid van de CD11c ⁺ DC was 93% zoals vastgesteld door immunokleuring van geïsoleerde cellen. Gemiddeld, het herstel van geïsoleerde CD11c ⁺ DC is 5 x 10 ⁵ -5 x 10 ⁶ mDC per 10 ⁹ totaal thymus cellen. Tabel 1 toont gegevens uit meerdere afzonderlijke thymus monsters van verschillende leeftijden en weefsel met een range van ingang en een celsuspensies alsmede de totale LDF nummer en de daaropvolgende CD11c ⁺ opbrengst en zuiverheid.

   In de APC verrijkte fractie, slechts ongeveer 0,5% van de cellen CD45 ^lo EpCAM ⁺ of CD45 ^negatieve EpCAM ^+. CTEC en Mtec kunnen worden gesorteerd van de trypsine-verteerd CD45 ^{lo / negatieve} verrijkt stromale cellen als EpCAM ^l o ⁺ CDR2 en EpCAM ^hi CDR2 ^-, respectievelijk getoond in figuur 5.

   
   Figuur 1. Een vereenvoudigd schema van de cellulaire organisatie en de samenstelling van de menselijke thymus. De thymus bestaat uit thymocyten, in verschillende stadia rijping en genoemde een heterogeen cellulair netwerk als de thymus stroma die de thymus milieu. De belangrijkste celtypes van de thymus stroma zijn mDC en PDC, epitheelcellen (onderverdeeld in twee grote categorieën naargelang hun lokalisatie binnen de oorlel: corticale en medullaire) en macrofagen Afkortingen: DC, dendritische cellen, MDC myeloïde dendritische cellen;. PDC, plasmacytoïde dendritische cellen; Mφ, macrofaag, mono, monocyten, Ctec, corticale epitheelcellen; Mtec, medullaire epitheelcellen.

   tent "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
   Figuur 2. Eerste voorbereidende stap van het weefsel voor eencellige voorbereiding. Pijlen wijzen naar de ongewenste weefsel onderdelen die moeten voorafgaande aan de uitvoering van het protocol te worden weggegooid.

   
   Figuur 3. Zuivering van thymus APC. FACS analyse van verschillende stadia van de zuiveringsprocedure. Enkele cel suspensies van thymus weefsel werden verkregen door mechanische verstoring en seriële enzymatische spijsvertering en APC verrijkt (LDF cellen) door Percoll dichtheid scheiding. Cellen voor (A) en na (B) de Percoll dichtheid scheiding werden gekleurd met HLA-DR-PE antilichaam controleren APC verrijking. Percentage bereik van HLA-DR + cellen meestal waargenomen is Aanwijs ed..

   
   Figuur 4. Isolatie van CD11c ⁺ mDC. Thymus weefsel werd gedigereerd met collagenase A / DNase I om een celsuspensie te creëren. CD11c ⁺ mDC vertegenwoordigen slechts een kleine populatie van de enkele cel suspensie (0,6%). Na verrijking van de LDF cellen via Percoll-dichtheidsscheiding het percentage CD11c ⁺ cellen toe tot ~ 9%. De LDF cellen werden gelabeld met CD11c-PE antilichaam en vervolgens geïsoleerd met magnetische korrels (anti-PE). Heranalyse van de CD11c ⁺ bevolking direct na magnetische celscheiding door FACS aangegeven 93% zuiverheid. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

   0951/50951fig5.jpg "/>
   Figuur 5. Verrijking van CD45 ^{lo / negatieve} cellen en daaropvolgende sortering TEC deelverzamelingen. A) Representatieve puntdiagrammen toont percentages CD45 negatieve / vanaf thymus stromale cellen in totaal cel suspensies voor en na Percoll dichtheid scheiding (9% en 16,2%, respectievelijk). B) De LDF cellen werd ontdaan van CD45 ^hi cellen met behulp van magnetische korrels en de TEC subsets gesorteerd van de uitgeputte fractie als EpCAM ^hi CDR2 ^- (MTES) of EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   Monster	Monstertype Antilichaam	Aantal cellen	Totale volume
   1. onbevlekt	controle		1 x 10 6	50 gl
   2.scc *-Pacific Blue	controle	CD45-Pacific Blue	1 x 10 6	50 gl
   3. scc-APC	controle	CD3-APC	1 x 10 6	50 gl
   4.scc-Alexa 488	controle	CD8-Alexa 488	1 x 10 6	50 gl
   5. Celsortering	analyt	CD45-Pacific Blue EpCAM-APC CDR2-Alexa 488	10 x 10 6 - 50 x 10 6	500 pi 10 x 10 6 cellen/100 pi

   CD11c + mDC frequenties, cel opbrengst en zuiverheid van verschillende donoren
   Schenker	Leeftijd	Weefselgewicht	Totaal cellen per monster	LDF cellen per monster	CD11c+%	CD11c + geïsoleerd per monster	CD11c + zuiverheid
   1	5 dagen	7 g	1.45 x 10 9	9.5 x10 7	12.6	2.4 x 10 6	89%
   2	3 jaar	15 g	2 x 10 9	6.5 x10 7	4.3	1,9 x 10 6	81%
   3	21 dagen	9 g	2,6 x 10 9	22 x10 7	10.3	3,6 x 10 6	93%
   4	6 jaar	13 g	1.4 x 10 9	25,4 x10 7	4.2	5,7 x 10 6	82%
   5	5 dagen	6,5 g	1,3 x 10 9	16.2 x10 7	6	2.9 x 10 6	91%
   6	39 dagen	3 g	0,6 x 10 9	8 x10 7	3.4	1,3 x 10 6	80%

   Tabel 1. Aantallen enkele celsuspensie totale cellen afgegeven na twee rondes van digestie en opbrengsten van LDF cellen na Percoll scheiding worden getoond voor isolaties uitgevoerd thymus monsters van zes individuen van verschillende leeftijden en weefselgewicht. Frequenties van mDC werden bepaald door flowcytometrie gebaseerd op CD11c expressie in totaal LDF cellen (APC verrijkt). opbrengst en zuiverheid van CD11c ⁺ cellen na magnetische kraal scheiding worden getoond voor elke individuele donor.

Discussion

De hier beschreven protocol is een modificatie van het protocol gepubliceerd door Gotter c.s. ^4. Kritische stappen in het protocol zijn de initiële toestand en voorbereiding van de weefsels alsmede de Percoll dichtheid scheiding. We raden aan het weefsel zo snel mogelijk na verzameling te verwerken. Het is belangrijk om snel maar grondig werken bij het schoonmaken en snijden van het weefsel. Tijdens de thymocyt wassen in stap 2.3 beschreven, is het cruciaal om de juiste balans te vinden bij het uitoefenen van druk met de achterkant van de zuiger op het weefsel stukken als te krachtig en langdurig druk kan de stromale cellen beschadigen. Gelaagdheid het medium op de top van de Percoll oplossing / celsuspensie zonder dat storingen kan ook enige oefening vereisen. Na centrifugatie is het belangrijk om alle lage dichtheid fractie cellen zo snel mogelijk uit de Percoll laag met een minimum aan Percoll oplossing te verzamelen.

Detotale cel opbrengsten en relatieve APC nummers kunnen zeer variabel (zie tabel 1) en afhankelijk van de donor (in het bijzonder betreft leeftijd) en preparatieve vaardigheden van de experimentator. Voor een kort overzicht, kan celsuspensies worden gekleurd met HLA-DR en / of andere markers volgende verschillende stappen van het protocol zoals gewenst. Alle antilichamen gebruikt voor fenotypische analyse moet worden getitreerd tot een optimaal resultaat te bereiken.

Door de relatief lage abundantie van APC soorten van de thymus opzichte thymoctyes, kan grotere stukken thymus vereist indien hogere aantallen geïsoleerde cellen gewenst.

Als een tissue Dissociator is beschikbaar in het lab, zal dit aanzienlijk versnellen weefsel verwerking, maar beide varianten hier beschreven werken even goed. Een relatief veel voorkomend probleem zou kunnen klonteren van de cellen, vooral tijdens de stappen tussen de Percoll scheiding en MACS / FACS sortering. In dit geval, een korte DNase I digestion zoals beschreven in het protocol zal meestal het probleem oplossen. Aangezien thymus weefsel achtereenvolgens vervangen door vetweefsel tijdens veroudering, thymi van oudere donors kunnen sommige vet, zwemt bovenop de buis na centrifugering de enkelvoudige celsuspensies verkregen door digestie verschillende stappen bevatten. In dat geval moet vet worden verwijderd met een pipet alvorens verder het protocol. Voor optimale resultaten en economie redenen adviseren wij om niet alleen de antilichamen, maar ook de anti-PE microbolletjes titreer (hoofdstukken 5 en 6). Voor isolatie van TEC uit muizen thymus, hebben alternatieve enzymmengsels beschreven TEC opbrengst ^8,13 verbeteren, maar we hebben ze niet getest met menselijk weefsel.

In principe andere thymus APC en stromale cellen zoals B-cellen en pDC kunnen ook de LDF cellen (na collagenase / DNase spijsvertering en Percoll) geïsoleerd door FACS / MACS sortering indien de markers zijn bekend. Bijvoorbeeld, PDC, BDCA-2, BDCA-4 en CD123 omschreven als merkers ^6,14. Indien uit de analyse of isolatie van thymocyt subsets gewenst is, raden wij u aan de cellen vrijgegeven door te knijpen (stap 2.3), omdat ze zijn heel puur en minimale manipulatie hebben ondergaan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator