ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

Summary

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。

Abstract

このプロトコルでは、ヒト胸腺から樹状細胞（DC）および上皮細胞（TEC）を単離する方法を提供する。 DCとTECは、主要な抗原提示細胞の正常胸腺に見られる（APC）型であり、それはよく、彼らは胸腺選択の際に異なる役割を果たしていることが確立されている。これらの細胞は、胸腺における異なる微小環境に局在化され、各APC型は、細胞のわずかな集団を構成している。さらに、これらの細胞型の生物学を理解するために、これらの細胞集団の特徴付けは非常に望ましいしかし、それらの低い周波数に、これらの細胞型のいずれかの単離は、効率的かつ再現可能な手順を必要とする。このプロトコルは、多様な細胞の性質の特性に適した細胞を得る方法を詳しく説明します。胸腺組織を機械的に破壊され、酵素消化の異なるステップの後に、得られた細胞懸濁液を、パーコール密度遠心分離工程を用いて濃縮される。骨髄DC（CD11cの単離のための<商標> +）、低密度画分（LDF）からの細胞を磁気細胞選別により免疫選択されている。 TEC集団（MTEC、CTEC）の濃縮は、特定の細胞マーカーを用いて細胞ソーティング（FACS）を蛍光活性化を介してそれらのその後の単離を可能にする低密度パーコール細胞画分からの造血の枯渇（CD45用^Hi）細胞によって達成される。単離された細胞は、異なる下流の用途に使用することができる。

Introduction

胸腺はT細胞の発達が起こる器官である。胸腺の活動はまだ古い時代に検出することができますが、それが連続して脂肪に置き換えるになったとき、その相対的で絶対的なサイズは、年齢とともに減少する。免疫応答のためのその重要性は1960年代初頭¹で示された。

T細胞レパートリーは、主に機能性および自己寛容T細胞レパートリー²で、その結果、T細胞の開発に生死キューを提供胸腺APCの異なる種類に対するペプチド-MHC複合体とT細胞受容体の相互作用を介して形成されている。

ヒト胸腺細胞の約98％は、胸腺細胞とも呼ばれるT細胞を開発している。残りの2％は、TEC（皮質、髄質、被膜下）、骨髄および形質DC（MDC、PDC）、マクロファージ、B細胞、成熟した再循環T細胞、顆粒球、様々含む異なる細胞型の数で構成されFibroblasts、内皮細胞および筋肉、神経細胞および気道上皮（ 図1）のような他の組織からの細胞に似た発現表現型を有する上皮細胞を非常にまれ。これらのうち、TECとDCは通常の胸腺に見られる主要なAPCタイプです。近年では、文化や分子プロファイリングのためのこれらのAPCタイプの精製は、より多くの関心を集めている。それらの低い周波数に、詳細な分析のためにこれらの細胞型のいずれかの単離は、効率的で再現可能で費用効果の高い手順を必要とする。ここで紹介する方法は、以前に発表された研究^3,4からの変更です。

任意の他の組織と同様に、胸腺からの細胞抽出は、単一細胞の懸濁液を得るために、酵素的に細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス相互作用ネットワークを脱凝集することによって達成することができる。良好な解離効率、細胞収量、細胞生存率および細胞秒の保持のような特定のパラメータがあります重要であるとurfaceマーカーは、これらの稀な細胞集団の単離の成功のために最適化される必要がある。

このプロトコルでは、DCおよびTECサブセットの単離は、機械的破壊及び酵素消化によって組織の単一細胞懸濁液を作製することによって行われる。私たちは、組織を一緒に保持している天然コラーゲンを打破するために、様々な酵素活性のバランスの取れた比率がクロストリジウムヒストリからコラゲナーゼAを使用しています。 DNアーゼIは死細胞（胸腺細胞は非常に敏感である）からの遊離DNAによる細胞凝集を減少させるために酵素液に含まれています。我々はまた、組織の解離剤により補助機械的および酵素組織治療を含む一般的な酵素組織消化の代替アプローチを提供する。単一細胞懸濁液を、次いで、細胞の低密度画分（LDF）の富化のための単一のパーコール密度遠心分離にかけられる。細胞のこの画分から、DCはFを染色することによって単離することができるまたはDC表面マーカー（ すなわち、のCD11c ^+）および磁気分離または蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて。胸腺細胞の大部分を含むリンパ系細胞とは異なり、TECは高レベルでCD45を発現しないが、上皮細胞接着分子EpCAMのために陽性である。 CTECは、CDR-2（皮質樹状網状-2）により認識まだ未定義の抗原抗体^4,5および幾分低いEpCAM発現の発現によって髄TECと区別することができる。のEpCAMおよびCDR2の差動共発現は^{、6ソーティング}高速セルを介してこれらのTECサブセットの効率的な単離を可能にする。

ここで紹介するプロトコルは、人間の胸腺組織に最適化されています。 FACS選別を使用した場合の手順の持続時間は、組織の量及び実験者の能力ならびにセルソーターの速度に依存する。通常は、DCを単離するためのプロトコルは、5以内に完了することができます-6時間および8〜10時間でのTECの単離のため。胸腺組織からDCおよびTECサブセットの分離は、時間に敏感である。より高速な単離操作、優れた細胞の状態。最後に、単離された細胞は、mRNAの比較研究およびタンパク質発現、PCR実験では、タンパク質の単離、分子プロファイリング（ すなわちトランスクリプトミクス、マイクロRNA分析）、ならびに細胞培養⁶のようなさらなる調査のために使用することができる。

倫理に関する声明

ヒト胸腺組織と連携できるようにするために研究者は、組織は通常、未成年から取得されるため、ローカル倫理委員会や責任ある当局だけでなく、ドナーの書面によるインフォームドコンセント（または通常は彼または彼女の両親からの承認を得る必要がある子どもたち）。さらに、すべてのヒト組織は、潜在的に感染し、適切な処置などなど 、手袋での作業のように、注意が必要であるとして処理する必要があります。

Protocol

1。ツール、酵素溶液、およびバッファの準備

前のプロトコルを先頭に次の分取の手順を実行します。

1. ツール
   、清潔で乾燥し、次のツールをオートクレーブし、使用するまで無菌包装に保管してください。
   1. 胸腺組織を切断するための湾曲した又はストレートのどちらかのヒントに小さな鋭いはさみ。組織を処理するための鋸歯状の先端の小さな湾曲した鉗子。
   2. パーコール密度遠心分離工程のための50ミリリットルオークリッジ遠心チューブ、パソコン、。
2. 酵素溶液
   私は次のように（2mgのコラゲナーゼ/ mlおよび0.1 mgのDNアーゼI / ml）を混ぜて酵素コラゲナーゼ/ DNアーゼを準備します。
   1. 2 mg / mlのコラゲナーゼ溶液を得たRPMI 1640無地（無FCS）250mlに凍結乾燥されたコラゲナーゼA（Roche）を500mgの溶解。コラゲナーゼは、溶解することが非常に困難なので、室温でローラーシェーカー上、しばらくそれを残すことをお勧めします。
   2. 100mgのDNアーゼI（ロシュ）中に溶解させる滅菌蒸留水10ml。 2.5ミリリットルのアリコートを-20℃で保存することができます2 mgのコラゲナーゼA溶液中の10 mgのDNアーゼI溶液の2.5ミリリットルを追加します。
   3. 無菌フィルターステリフィルターユニット（0.22ミクロン）を使用して、コラゲナーゼ/ DNアーゼミックス。使用するまで-20℃で10〜20 mLの分量を保存する。
3. 緩衝液および溶液
   1. 1.5MのNaCl原液：RTで0.22μmフィルターとストアを介して溶液を濾過1.5 Mの最終濃度に滅菌蒸留水にNaClを溶解する。
   2. 10倍のMACSバッファー：1×PBS（Ca ^{2 +を} / Mg ^{2 +}を含まない）5％BSAおよび20 mMのEDTAを含む。無菌フィルター4℃で0.22ミクロンフィルターとストアとソリューション冷滅菌1×PBSで1Xする10×ストックを希釈して1×溶液を調製し、使用前に。
   3. FACSバッファー：1×PBS（Ca ^{2 +を} / Mg ^{2 +}を含まない）を1％BSAおよび0.02％のNaN _3を含む。
   4. 細胞選別のためのFACSバッファー：1×PBS（Ca ^{2 +}の/ Mgの

2。組織の準備

組織の処理は、層流キャビネット中で無菌試薬および作業を用いて行われるべきである。手順を開始する前に、以下の試薬および機器を準備します。

1. 1. RTに以下を温める。のRPMI 1640完全培地（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）、RPMI1640中平原のCa ^{2 +} / Mg ^{2 +}を含まないPBSおよび2Xコラゲナーゼ/ DNアーゼ酵素液。
   2. 37℃までの回転部と4℃に冷却固定角ローター遠心機で暖かい熱インキュベータ
   3. 氷の箱を用意します。

注記：このステップの期間は、組織の状態やサイズによって異なります。約20〜30分は、TIのMサイズの作品のために必要な合理的な時間である良好な状態でssue（幅〜5cm）に。

2. 滅菌PBSを含むペトリ皿に組織を置き、残留血を洗い流してください。
   1. 新しいPBSは血の塊、結合および脂肪組織と健康的な見ていない任意の部分から組織をきれいに乾燥から組織を防止し、鉗子やハサミを使用して追加します。
   2. 破片の量を増加させる、壊死組織を除去するように注意してください。
   3. 洗浄後は、参考のために組織の重量を量る。
   4. 約1cm ³個/ブロック単位で組織を切断。組織をカバーするのに十分なPBSを追加します。

注：結果の再現性のために、組織は均一な大きさの断片に切断されるべきである。

3. 無菌注射器（10〜20 ml）をバックを使用すると、胸腺組織片の上に（あまりにも積極的または長期ではない）の圧力を加える。この手順では、このように、後に消化される組織量を減らし、胸腺細胞の大部分を除去します。氷の上で、このステップを実行して高速に動作します 。
4. 胸腺細胞がリリースされるソリューションは、目に見えて白濁します。優しく料理を撹拌し、次いで5ミリリットルピペットの助けやガラスアスピレーターで誤って組織片を吸引しないように注意しながら胸腺細胞を含む上清を除去します。

ヒント：無菌細胞培養スクレーパは、次に皿（45°角度）を傾けて上清を吸引ディッシュの一側に全ての組織片を濃縮するために用いることができる。新しいPBSと交換し、上清を比較的透明になるまで、この手順を繰り返します。 、RPMI平野で最後の洗浄を行う。

5. 鋭いハサミを使用して組織片をみじん切り（できるだけ細かく、断片は、少なくとも2〜4ミリメートルでなければなりません）。フラグメントは、5 mlのピ​​ペットを入力するのに十分に小さくなければならない。

3。胸腺組織からの単一細胞懸濁液の調製

ここでは、この工程のための2つの代替的なアプローチが記載されている。二、組織解離剤（セクション3.2）の援助を受け、機械的および酵素組織治療を必要とするしながら、最初のアプローチは、一般的な酵素組織消化（セクション3.1）について説明します。

このプロトコルは、5グラムの重さの組織サンプルの処理のために最適化される。より大きな又はより小さな組織サンプルについては、それに応じて酵素のボリュームを調整する。

単一細胞懸濁液を得る3.1典型的な酵素組織消化

1. 組織の5グラム当たり10ミリリットルのコラゲナーゼ/ DNase溶液で50mlチューブにマッシュポテト組織を置きます。 20ミリリットルの全量を、RPMI平野を追加します。

注：50mlチューブ内の組織を10gまでのダイジェスト。したがって酵素音量を調整します。

2. 熱インキュベーターでゆっくりと回転させながら37℃で40分間組織懸濁液をインキュベートする。

注意：

3. 細胞はそれに放出されるように酵素液は白濁になります。沈殿組織断片に2分間110×gでの消化の終了時に、遠心分離管。
4. この消化のラウンドからの上清を収集します。 400×gで10分間、細胞懸濁物をペレット化。細胞ペレットのサイズに応じたRPMI完全な10〜50中の吸引上清と細胞を再懸濁。
5. 緩いキャップを37℃のインキュベーター内で細胞懸濁液を保管してください。
6. 大きな細胞数が必要な場合は、消化ステップは、残りの組織片を用いて繰り返し、第1及び第2のダイジェストをプールすることができる。 TECが孤立する必要がある場合にも、消化の2ラウンドが行われるべきである。
7. パンブルー（1:10〜1:100）で細胞懸濁液のアリコートを希釈し、血球計数器を用いて生細胞を数える。 パーコール密度遠心分離（セクション4）に進む準備まで、インキュベーター中、37℃で細胞を維持する。 DCサブセット（セクション5）のその後の単離は、これらの細胞から実行されます。

注：胸腺組織を単一細胞懸濁液の消化効率および発生に影響を与える、特に加齢に伴って、それらの組成物に変えることができる。

9. 胸腺上皮細胞（TEC）のその後の単離のための酵素消化の第三ラウンドが必要となります。新鮮なコラゲナーゼ/ DNase溶液10mlを加えた10mlのRPMI平野に再懸濁し、組織の残党と、溶液中トリプシン/ EDTA（2.5％ストックから1時50分）を追加します。
10. 穏やかに回転しながら40分間37℃でインキュベートする。最後の10時に - インキュベーションの15分トリプシンの活性を中和するために、FCS（1:5）を追加します。
11. 組織断片を沈降させるRTで2分間、110×gで遠心分離する。

12. 細胞上清を収集し、沈降した組織片を廃棄する。
13. 10分間400×gで細胞上清を遠心分離する。のRPMI完全中上清を吸引し再懸濁細胞ペレット。

ヒント：細胞ペレットは非常に緩んでいるので、上澄みを吸引/廃棄する際には注意してください。

14. 血球計数器を用いて生細胞を数える。分離（セクション4）をパーコールに進むまで、37℃のインキュベーター内で細胞を配置します。 CD45 ^hi細胞の枯渇によるTEC細胞のその後前増は、これらの細胞（セクション6）から実行されます。

組織解離によって支援3.2機械的および酵素組織治療

7.8の単離のためのマウス胸腺組織を解離するために使用されることの修正版です。

1. コラゲナーゼ/ DNase溶液の10ミリリットルを含むCチューブにみじん切りの組織片（ステップ2.5）の転送5グラム。
2. 組織解離し、実行プログラムm_spleen_02（10秒）に、Cチューブを適応させる。このプログラム4-5X（40から50秒）繰り返します。
3. 37℃で20分間穏やかに回転してインキュベート
4. 室温で2分間110×gで遠心分離する。
5. 上清を回収し、ステップ3.1.4のように進んでください。新鮮なコラゲナーゼ/ DNase溶液の10ミリリットルを追加します。
6. 組織解離し、実行プログラムm_spleen_01（56秒）に、Cチューブを適応させる。
7. 穏やかに回転させながら20分間37℃でインキュベートする。
8. 室温で2分間110×gで遠心分離する。
9. コレクション1T細胞上清および400×gで10分間、細胞懸濁液をペレット化。ステップ3.1.4のように進んでください。
10. 3.1.9で説明したように消化の第三ラウンドは、胸腺上皮細胞（TEC）のその後の単離のために必要とされる。このために、新鮮なコラゲナーゼ/ DNase溶液を加えたトリプシン/ EDTA（ストックの1:50希釈2.5％）を10mlの組織の残党を再懸濁
11. 穏やかに回転してさらに20分間37℃でインキュベートする。 FCS（1:5）を追加し、さらに10分間インキュベートする。

注：組織は、通常、完全に解離されず、未消化の組織断片が観察されないこの最後の消化工程の後に、このアプローチを使用して。

12. ステップ3.1.11-3.1.14のように進んでください。

4。パーコール - 密度分離を用いて細胞のLDFの充実

組織の酵素消化の後、総胸腺単一細胞懸濁液は、単一のパーコール密度centrifugatに供されるLDF細胞を濃縮するイオン段階。細胞のLDFを強くAPCについて濃縮されている。 DCおよびTEC両方がこの細胞の画分に検出されています。

1. （TECアイソレーション用）または3 ^番目のダイジェスト（3.1.14）（ステップ3.1.8を参照して、プールされた細胞）のMDC離のためにダイジェスト^ND 1および^第 2から得られた単一細胞懸濁液を使用してください。 10分間、400×gで各消化工程から得られた遠心単一細胞懸濁液。
2. この洗浄工程（以下の表の例を参照）の間に1.07グラム/ mlの最終密度パーコール溶液を調製する。

   1.07グラム/ mlの（ρ= 1.07）の最終濃度にパーコール溶液の調製
   チューブ番号	1	2	3	4
   希釈していないパーコール（ρ= 1.130）（ML）	2.96	5.92	8.88	11.84
   1.5 MのNaCl（溶液）	0.6	1.20	1.8	2.4
   蒸留H 2 O（ミリリットル）	2.44	4.88	7.32	9.76
   最終的な作業希釈液量	6ミリリットル	12ミリリットル	18ミリリットル	24ミリリットル

3. パーコール管の数は、ステップ3.1.8および/または3.1.14で決定した細胞数に依存します。滅菌溶液を結合し、完全に混合する。最適な単離のために、0.6〜1×10 ⁹細胞をパーコールのチューブあたりロードすることができる。滅菌溶液を結合し、完全に混合する。

ヒント：パーコールは感光性であり、加えて、それが冷たい保つ必要があります。最初のNaClとH ₂ O（RT）を含む混合物を準備し、ちょうどパーコール液に細胞を再懸濁する前に、最後の希釈されていないパーコールを追加します。

10トン"> 注意：希釈されていないパーコール溶液の密度は1.130グラム/ミリリットルに等しくない場合パーコール密度が異なるサプライヤとバッチ間で異なる場合があり、パーコールおよびH ₂ Oの正確な量を計算するために、製造業者が提供する指示を使用1.07グラム/ mlの最終密度を得るために必要。

4. 準備パーコール液（ρ= 1.07）の6ミリリットル中1×10 ^9個の細胞まで再懸濁し、均質な懸濁液を取得し、50ミリリットルオークリッジポリカーボネートスクリューキャップ遠心管に転送するために、十分に混ぜる。
5. 慎重にパーコール液/細胞懸濁液の上にピペットでチューブあたり完全RPMIの30ミリリットルを重ね。それは、サスペンションの上に残り、層を乱さないように注意してくださいように、徐々にメディアをロードします。
6. 彼らは遠心分離中にバランスしているように、彼らは等しい重みを持っていることを確認するためにチューブを量る。そうでない場合は、慎重に、STの下で（軽い管によりメディアを追加erile条件）。
7. 慎重にブレーキをオフにして 、4℃で、35分間3500×gで固定アングルローター 、スピンであらかじめ冷却遠心機にチューブを移す。ていることを確認していないより高く、4℃での遠心分離器の温度
8. 遠心機からチューブを取り外し、慎重に、滅菌パスツールピペットを用いて、各チューブからパーコールと媒体との間の相間で発見濃縮APC、（低密度画分）を収集。寒さのRPMI完全を含む50 mlチューブに移す細胞。残りのパーコールを希釈するために、チューブを埋める。
9. 4℃で300×gで10分間、細胞懸濁液を遠心分離上清を繰り返し洗浄を捨てる。
10. 培地中で細胞ペレットを再懸濁し、（パンブルーおよび血球計数器を用いて）細胞数を決定します。我々の経験では、LDF細胞のパーセンテージは、酵素消化後に得られた総単一細胞懸濁液の約2〜20％である。典型的なY（若い胸腺から、レンジ1日- 2年）、低密度濃縮された細胞のield総単一細胞懸濁液の細胞の10％に相当、1×10 ⁹あたり1×10 ^8個の細胞である。

注：この段階では、（特に古い時代の子どもたちからのサンプルを用いて）細胞懸濁液中に凝集ことを観察することができる。細胞塊は、細胞死の指標であり、一緒に細胞を固執することができます死細胞からのDNAの放出に起因する。このような場合には、試料（50μg/ ml）を中にDNアーゼIを追加し、遊離DNA分子を消化するためにRT（穏やかに5分毎に反転さ）を最大20分間それをインキュベートする。

5。胸腺のMDCの単離

（パーコール分離を経て）、APC濃縮した後、MDCは、効率的な酵素消化の第一および第二ラウンドの次のLDFから単離することができる。以下のプロトコルは、mDCを単離するための磁気細胞分離（CD11cの修正版である

1. 遠心分離機APCは、10 ⁷細胞あたり100μlのMACS緩衝液中で4℃で10分間再懸濁細胞ペレットを300×gでプールされた第一及び第二の酵素消化から得られた単一細胞懸濁液から単離された細胞を富化。
2. 10 ⁷個の細胞あたりのCD11c-PE抗体の5μlを加える。

注意：滴定実験は、最適な結果を得るために推奨されています。

3. よく混合し、光から保護し、4℃で15分間、インキュベートします。
4. 10分間300×gで10 ^7個の細胞遠心あたりMACS緩衝液1-2を添加することにより細胞を洗浄。
5. 上清を吸引し、完全にとのMACSバッファー80μlに10 ^7個の細胞まで再懸濁する。
6. 10 ⁷個の細胞あたり20μlの抗PEマイクロビーズを追加します。
7. よく混ぜる（ ボルテックスを行います ）し、光から保護し、4℃で15分間インキュベートする。
8. ステップ5.4のように繰り返します。 緩衝液500μlに10 ⁸細胞まで再懸濁する。
9. 必要に応じて、カラムの流れを妨げることができる破片および細胞凝集物を除去するために40μmのセルストレーナーを用いてフィルタ細胞懸濁液。
10. 胸腺細胞懸濁液をLSカラムを通じてよりよい流れがLSカラムを使用してください。製造者の指示に従ってLSカラムを準備します。ゆっくりと生成する気泡を避け列にピペット細胞懸濁液。すべての1×10 ^8個の細胞に1つの列を使用してください。
11. 製造者の指示に従ってカラムを洗浄。磁石から列を削除し、滅菌12ミリリットル丸底ポリプロピレンチューブに入れてください。 MACSをカラムにバッファー3ミリリットルを追加し、挿入し、しっかりと列にプランジャーを押すことにより、磁気標識細胞を収集します。
12. 6分間400×gでのCD11c ⁺ MDCおよび遠心分離機を表す溶出画分を収集します。
13. 細胞数を決定し、選択したセルのpopulatiの純度を確認フローサイトメトリー解析で上。提案されたマーカーは、CD45、CD11cの、およびHLA-DRが含まれる。

注：のCD11c ⁺ MDCはまた、FACSソーターを使用して単離することができる。

6。 TECの細胞選別のためのCD45 ^{LO / NEG}細胞^の濃縮

TECの単離のために、細胞は、細胞選別を介してそれらの単離をスピードアップするために、CD45マイクロビーズを用いてCD45 ^hi細胞の枯渇によって予め濃縮することができる。

3 ^回目の消化工程（3.1.14）から得、続いてパーコール遠心分離によって分離し、単一細胞懸濁液を使用する。

1. 10 4℃、分、および10 ⁷個の細胞あたり80μlのMACSバッファー中で再懸濁細胞ペレットを300×gで遠心細胞懸濁液。
2. 10 ⁷個の細胞あたり、推奨量（6.7μL）の1/3のCD45マイクロビーズを使用してください。

注：より少ない量を使用することによりマイクロビーズの我々は、CD45 ^LOおよびCD45の^NEG細胞の両方のために細胞を事前に豊かにする。滴定は最適な結果を得るために推奨されます。

3. 優しくチューブをフリックでよく混ぜ（ ボルテックスを行います ）し、4℃で15分間インキュベート
4. 4℃で300×gで10分間、MACSバッファーおよび遠心分離機の10mlに添加することにより非結合マイクロビーズの洗浄完全に上清を吸引し。
5. 緩衝液500μlに10 ⁸細胞まで再懸濁する。
6. 必要に応じて、カラムの流れを妨げることができる破片および細胞凝集物を除去するために70μmのセルストレーナーを用いてフィルタ細胞懸濁液。
7. 胸腺細胞懸濁液をLSカラムを通じてよりよい流れがLSカラムを使用してください。製造者の指示に従ってLSカラムを準備します。ゆっくりと生成する気泡を避け列にピペット細胞懸濁液。すべての10 ^8個の細胞に1つの列を使用してください。
8. 非標識細胞（フロースルーおよび洗浄）を含むの収集CD45 ^{LO /負の細胞}画分とは、製造業者の説明書に従ってカラムを洗浄する。
9. 10 4℃で分、細胞数を決定し、細胞選別のための染色を続行するには、無菌のFACS緩衝液に再懸濁細胞ペレットを300×gで遠心します。

7。蛍光活性化細胞選別のための染色細胞

1. FcRは、非特異的抗体結合を低減するために、従来の細胞染色を阻止行う。 RTで15分間、プールされたヒト免疫グロブリン溶液と細胞懸濁液をインキュベートする。これらの試薬 ​​は、（ すなわち Gammunex 10％溶液）市販されている。
2. 冷滅菌FACS緩衝液を加えることで細胞を洗浄。 4℃で6分間400×gで遠心分離
3. 冷滅菌FACS緩衝液中で上清と再懸濁細胞を廃棄します。次の例に従って、5つのサンプルを準備します。
   

   * SCC、シングルカラーコントロール

   暗闇の中で氷上で30分間抗体で細胞を培養する。
   4℃で6分間、400×gで遠心分離することにより細胞をFACS緩衝液で二回洗浄する
   （NaN _3をせずにIE）細胞選別のための無菌のFACS緩衝液を使用して1×10 ⁷個/ ml（または細胞選別施設が推奨する濃度に）にソートするサンプルの細胞濃度を調整します。
   ソート中にサイトメーターを詰まらせる可能性のある細胞塊を除去するために70μmのセルストレーナーを通して細胞試料を渡す。
   バッファの200〜400μlの対照試料を懸濁します。氷上でチューブを保持し、光から保護。
   媒体とコレクションチューブを準備します。

   注意事項：

   • 最適な染色のための抗体の滴定を行う。
   • 仕分け用の試料において、最大50×10 ⁶細胞の総反応容量で染色することができる500μL。
   • 5ミリリットルファルコンポリスチレン丸底チューブにソートされる試料の染色を行う。単一のカラーコントロールを96ウェルプレートの別個のウェルに染色することができる。
   • TECのサブセットは稀な集団であることから、適切なFACSの設定の決定を容易にし、蛍光色素の選択は、補償が必要な場合は、適切な補償を持っていることを確認するために、各蛍光色素のために（高い周波数の）別の陽性マーカーを使用することをお勧めします。 CD45 ^+画分からの細胞は、異なる蛍光色素のために、例えばCD45、CD3またはCD8のようなマーカーで染色することができ、染色されていないCD45 ⁺細胞を染色した後、試料に添加することができる。

   8。蛍光活性化細胞選別により、TECの分離

   （MTEC）またはEpCAMの^LO CDR2 ^{+（CTEC） -}テックサブセットは、EpCAMの^ハイテク CDR2として、CD45 ^{LO / NEG画}分からソートすることができます。

   1. サンプルのウィットを実行H非染色細胞とスケールの関心の人口を配置するために、前方および側方散乱を調整します。細胞が見えるが、ヒストグラムの左端の手の部分に位置するように、各検出器の電圧を調整します。
   2. 各単一染色したサンプルを実行し、各色の補正を調整します。
   3. 染色されていない単一のステンドコントロールするための電圧と補償を調整した後、サンプルがソートされ、関心の人口を定義するためにゲーティングツールを使用するために実行。細胞破片を除いた状態で、すべての間質細胞の大きさを含めることを確実にするために、広い前方および側方散乱ゲートを使用する。
   4. CD45 ^低およびCD45 ^NEG細胞に対する前方散乱ゲートに対するCD45-パシフィックブルーのドットプロットに。
   5. CDR2ドットプロット対のEpCAMにこのゲートを適用し、ソートする集団をゲートすることによって決定する。
   6. ゲートが決定されると、関心のある集団を含有する選択ゲートおよび並べ替えを開始。

   注：収集チューブの側面に付着する細胞を防止するためにソートするとき、チューブはPBS中50％FCSでそれを充填することにより予備被覆することができ、室温で30分間インキュベートした。コレクション·メディアを追加する前に、塗布液を捨てる。

   Representative Results

   このプロトコルでは、出発物質として、我々はインフォームドコンセントの後に、制度的なガイドラインの下で得られた矯正心臓血管外科（学科胸部と心臓血管外科、大学クリニックチュービンゲン）を受けている子供から削除胸腺組織を使用しています。この廃棄された材料は2-30 g以上のサイズで大きく異なります。得られたMDCおよびTECサブセット（CTECとMTEC）の数は、サイズだけでなく、単離に使用胸腺組織サンプルの年齢に依存している。

   図2（〜9 CM）6歳の子供から得られた組織のかなり大きな部分を示しています。このプロトコルの重要な最初のステップは、取（白矢印）の望ましくない部分からの組織の洗浄である。

   単一パーコール密度遠心分離秒を用いて分離した単一細胞懸濁液を得るために、セクション2と3.1のプロトコルで概説した胸腺組織を処理したTEP単一細胞懸濁液を、一方パーコール遠心分離後に、このパーセンテージは15〜40％に、大型の細胞を含む、低密度画分（LDF）に増加し、HLA-DR +細胞（ 図3A）の約3％を含むが均一な小型の胸腺細胞から主に構成された高密度画分（HDF）は、実質的にそのような細胞（ 図3B）を含まない。近隣（LDF）の画分を含有する濃縮されたAPCは、その後回収し、その後の単離工程に使用するための細胞を回収して洗浄した。

   胸腺MDCがCD11c9、10を含む表面マーカーの数の表現によって識別することができますが、PDCはこのようなBDCA-2、BDCA-4、CD45RAおよびCD123 ^11,12のようなマーカーを発現する。 LDF細胞の濃縮後、両方の細胞型は⁺磁気細胞分離によって、またはCD11cの流れの選別⁺またはBDCA-4のいずれかより大きな数でも、それらの効率的な単離を可能にする、この画分の2〜10％を構成する細胞^6。

   図4は、セクション5に記載された修飾磁気細胞分離プロトコルを使用したCD11c ⁺細胞の効率的な単離を示す。単離された細胞の免疫染色によって確立された単離後、のCD11c ⁺ DCの純度は93％であった。平均して、孤立したCD11c ⁺ DCの回復がある5×10 ⁵ -5×10 ⁶のmDC 10 ⁹総胸腺細胞ごとに単一の入力範囲で異なる年齢や組織重量のいくつかの個々の胸腺サンプルから得られた。 表1のデータを示す細胞懸濁液だけでなく、総LDF番号とそれに続くのCD11c ⁺収率と純度。

   APC濃縮分画では、細胞のわずか約0.5％、CD45 ^LOのEpCAM ⁺またはCD45 ^NEGのEpCAM ⁺である。 CTECとMTECはEpCAMの^Lとしてトリプシン消化CD45 ^{LO / NEG}濃縮ストローマ細胞からソートすることができます O CDR2 ⁺とのEpCAM ^{こんにちは} CDR2 ^{- 、}それぞれ図5に示すように。

   
   図1。ヒト胸腺の細胞組織と組成の簡略図。胸腺は、異なる成熟段階において、胸腺細胞で構成され、異種のセルラーネットワークは、胸腺の環境を形成し、胸腺間質と称される。胸腺間質の主要な細胞型はMDCおよびPDC、上皮細胞（その小葉内局在性に応じて2つの主なカテゴリに分かれて：皮質、および髄質）であり、マクロファージ略語：DC、樹状細胞、mDCを、骨髄樹状細胞;。 PDC、形質細胞様樹状細胞、Mφ、マクロファージ、モノ、単球、CTEC、皮質上皮細胞、MTEC、髄質上皮細胞。

   常に ">：「キープtogether.withinページ= FO」10トン
   図2。単一細胞を調製するための組織の第取ステップ。矢印のポイントの前にプロトコルの実行のために廃棄される必要があり、望ましくない組織部分へ。

   
   図3。精製手順の異なる段階の胸腺APC。FACS分析の精製 。胸腺組織の単一細胞懸濁液は、機械的破壊、シリアル酵素消化によって得られ、APCは、パーコール密度分離によって（LDF細胞）を富化。 （A）の前及び（B）後の細胞を、パーコール密度分離は、APCの濃縮を確認するためにHLA-DR-PE抗体で染色した。一般的に観測されたHLA-DR +細胞の割合の範囲はindicatです ED。

   
   図4。のCD11c ⁺たmDC。胸腺組織の単離は、Iは、単一の細胞懸濁液を作成するためにコラゲナーゼA / DNアーゼを用いて消化し ​​た。のCD11c ⁺ MDCは、単一の細胞懸濁液（0.6％）のわずかな集団である。パーコール密度分離を介してLDF細胞の濃縮後のCD11c ⁺細胞の割合は約9％まで上昇する。 LDF細胞はCD11cの-PE抗体で標識し、続いて磁気ビーズ（抗PE）を用いて単離した。直接FACSによる磁気細胞分離後のCD11c ⁺集団の再分析は、93％の純度を示した。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

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   図5。 CD45 ^{LO / neg細胞}とTECサブセットのその後の選別の濃縮。A）パーコール密度分離（それぞれ9％及び16.2％）前後のトータル単一細胞懸濁液中のCD45陰性/低胸腺間質細胞の割合を示す代表的なドットプロット。 （MTEC）またはEpCAMの^LO CDR2 ^{+（CTEC） -} B）LDF細胞は、磁気ビーズとのEpCAM ^{こんにちは} CDR2として枯渇画分から替えられたTECのサブセットを使用して、CD45 ^hi細胞を枯渇させた。

   サンプル	サンプル型 抗体	細胞の数	全容積
   1。汚れのない	コントロール		1×10 6	50μL
   2.scc *-パシフィックブルー	コントロール	CD45-パシフィックブルー	1×10 6	50μL
   3。 SCC-APC	コントロール	CD3-APC	1×10 6	50μL
   4.scc-アレクサ488	コントロール	CD8-アレクサ488	1×10 6	50μL
   5。細胞選別	検体	CD45-パシフィックブルー のEpCAM-APC CDR2-アレクサ488	10×10 6から 50×10 6	500μL 10×10 6細胞 μL

   のCD11c +のMDC周波数、細胞収量と異なるドナーの純度
   ドナー	時代	組織重量	サンプルあたりの全細胞	サンプルあたりのLDFの細胞	のCD11c+％	のCD11c +サンプルあたり隔離	のCD11c +純度
   1	5日間	7グラム	1.45×10 9	9.5×10 7	12.6	2.4×10 6	89パーセント
   2	3年	15グラム	2×10 9	6.5×10 7	4.3	1.9×10 6	81パーセント
   3	21日	9グラム	2.6×10 9	22×10 7	10.3	3.6×10 6	93パーセント
   4	6年	13グラム	1.4×10 9	25.4×10 7	4.2	5.7×10 6	82パーセント
   5	5日間	6.5グラム	1.3×10 9	16.2×10 7	6	2.9×10 6	91パーセント
   6	39日	3グラム	0.6×10 9	8×10 7	3.4	1.3×10 6	80パーセント

   表1。 2消化のラウンドならびにパーコール分離後LDF細胞の収量後に放出された全単一細胞懸濁細胞の数は、異なる年齢および組織重量の6人の胸腺の試料で行っ単離のために示されている。たmDCの周波数はベースのフローサイトメトリーにより測定した総LDF細胞におけるCD11cの発現に（APCは濃縮）。収量およびCD11c ⁺細胞の純度は、磁気ビーズ分離後に、個々のドナーについて示されている。

Discussion

ここで説明するプロトコルは、ゴッターら ⁴が発行するプロトコルの改変である。プロトコルにおける重要なステップは、条件や組織の初期準備だけでなく、パーコール密度分離である。私たちは強く、採取後できるだけ速やかに組織を処理することをお勧めします。これは、清掃や組織を切断する際に高速だが、十分に機能することが重要です。ステップ2.3で説明した胸腺細胞の洗浄中に、間質細胞に損傷を与える可能性があまりにも積極的かつ長期圧力などの組織片にシリンジプランジャの背に圧力をかけたときに適切なバランスを見つけることが重要です。摂動を引き起こすことなく、パーコール溶液/細胞懸濁液の上に媒体を積層することもいくつかの練習を必要とし得る。遠心分離後、それは可能な限り迅速にパーコール溶液の最小量を有するパーコール層からすべての低密度画分細胞を収集することが重要である。

ザ·全体の細胞収率および相対APC番号（ 表1参照）、非常に可変であっても（特に年齢に関して）ドナーおよび実験者の取スキルに依存することができる。概要については、細胞懸濁液は、必要に応じて、プロトコルの異なる手順に従って、HLA-DRおよび/または他のマーカーで染色することができる。表現型分析のために使用される全ての抗体は、最適な結果を達成するために滴定されるべきである。

単離された細胞の高い数値が必要な場合のためthymoctyesに比べ、胸腺内のAPCタイプの比較的少量のため、胸腺の大部分は必要になることがあります。

組織解離は、実験室で使用できる場合は、これはかなり組織処理を高速化しますが、ここで説明する両方のバリエーションは同様に機能。比較的頻繁な問題は、特にパーコール分離とMACS / FACSソーティング間のステップの間に、細胞の凝集可能性があります。この場合、短いDNアーゼI掘るプロトコールに記載されているようestionは通常、問題を解決します。胸腺組織を連続的により古いドナーからの老化、胸腺異なる消化工程から得られた単一細胞懸濁液を遠心分離した後、管の上に泳ぐするいくつかの脂肪が含まれる場合があり間に脂肪組織によって置き換えられるからである。このような場合には、脂肪は、プロトコルを続行する前に、ピペットを用いて除去されるべきである。最適な結果を得るだけでなく、経済上の理由から、我々は抗体だけでなく、抗PEマイクロビーズ（セクション5および6）だけでなく、滴定へのアドバイス。マウス胸腺から、TECの単離のために、代わりの酵素混合物は、TEC収量^8,13を強化するために記載されているが、我々はヒト組織でそれらをテストしていません。

原理的には、B細胞およびpDCのような他の胸腺APC細胞および間質細胞は、それぞれのマーカーが知られている場合FACSソーティング/ MACSによって（コラゲナーゼ/ DNアーゼ消化およびパーコール以下）LDF細胞から単離することができる。例えば、PDC、BDCA-2、BDCA-FOR図4およびCD123は、マーカ^6,14として記載されている。胸腺細胞サブセットの分析や隔離が必要な場合、彼らは非常に純粋であり、最小限の操作を受けているので、我々は、（ステップ2.3）を絞ることによって放出された細胞を使用することをお勧めします。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator