Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.
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Artigo de método
O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste protocolo, proporcionar um método para isolar as células dendríticas (DC) e células epiteliais (TEC) a partir do timo humano. DC e TEC são a principal célula apresentadoras de antígenos (APC) tipos encontrados em um timo normal e está bem estabelecido que desempenham papéis distintos durante a seleção do timo. Essas células estão localizadas em microambientes distintos no timo e cada tipo APC representa apenas uma pequena população de células. Para melhor compreender a biologia destes tipos de células, a caracterização dessas populações de células é altamente desejável, mas devido à sua baixa frequência, o isolamento de qualquer um destes tipos celulares requer um procedimento eficiente e reprodutível. Este protocolo detalha um método para obter células adequadas para a caracterização de diversas propriedades celulares. Tecido do timo é mecanicamente perturbado e após diferentes passos de digestão enzimática, a suspensão de células resultante é enriquecida com um passo de centrifugação de densidade de Percoll. Para o isolamento de mielóide DC (CD11c <sup> +), células da fração de baixa densidade (FDL) são immunoselected por separação de células magnéticas. O enriquecimento de populações TEC (Mtec, CTEC) é alcançada por esgotamento de hematopoiéticas (CD45 hi), as células da fração de baixa densidade celular Percoll permitindo a sua posterior isolamento através de fluorescência de células ativadas (FACS) utilizando marcadores específicos de células. As células isoladas podem ser usadas para diferentes aplicações a jusante.
Introdução
O timo é o órgão em que o desenvolvimento de células T ocorre. O seu tamanho relativo e absoluto diminui com a idade, quando se torna sucessivamente substituído por gordura, embora a actividade do timo pode ainda ser detectado na velhice. A sua importância para a resposta imune foi demonstrado na década de 1960 1.
O repertório de células T é formada através da interacção dos receptores de células T com complexos de peptídeo-MHC em diferentes tipos de APC do timo, que fornecem sinais de sobrevivência ou morte para o desenvolvimento de células T, resultando em um repertório de células T funcionais e são amplamente auto-tolerante ....
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Protocolo
1. Preparação de ferramentas, soluções enzimáticas e amortecedores
Execute as seguintes etapas de preparação antes do início do protocolo.
- Ferramentas
Limpo, seco e autoclave as seguintes ferramentas e mantê-los em embalagem estéril até o uso.- Pequenas tesoura afiada com pontas ou curvas ou retas para cortar o tecido do timo. Pequenas pinças curvas com pontas serrilhadas para lidar com o tecido.
- 50 ml de Oak Ridge centrífuga Tubos, PC, para a etapa de centrifugação Percoll densidade.
- Soluções enzimáticas
Prepare a colagenase / ADNase I enzima misturar (2 mg de colagenase / mL....
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Resultados
Como material de partida neste protocolo que usamos tecido do timo removido crianças submetidas à cirurgia cardiovascular corretiva (Departamento de Cirurgia Torácica e Cardiovascular da Universidade Tuebingen Clinic) obtidos após consentimento informado e sob as diretrizes institucionais. Este material descartado pode variar muito em tamanho 2-30 g ou mais. O número de subconjuntos e mDC TEC (CTEC e Mtec) que são obtidos depende do tamanho assim como da idade da amostra de tecido do timo para o isolamento.
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Discussão
O protocolo aqui descrito é uma modificação do protocolo publicado por Gotter et al 4. As etapas críticas no protocolo são a condição e a preparação inicial do tecido, bem como a separação de densidade de Percoll. É altamente recomendável para processar o tecido, assim que possível após a colheita. É importante trabalhar rapidamente mas cuidadosamente durante a limpeza e corte do tecido. Durante a lavagem de timócitos descrito na etapa 2.3, é crucial para encontrar o equilíbrio certo quando se aplica.......
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Divulgações
Não há conflito de interesse declarados.
Agradecimentos
Somos gratos aos cirurgiões do Departamento de Cirurgia Torácica e Cardiovascular, Clínica Universitária Tuebingen por nos fornecer as amostras de timo e Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Alemanha) para fornecer o anticorpo CDR2. Gostaríamos também de agradecer a Hans-Jörg Bühring e Sabrina Grimm a partir da instalação de triagem (Universidade de Tuebingen). Este trabalho foi apoiado pelo SFB 685 e da Fundação Hertie.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes e Materiais | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| PAA | H15-002 | de Dulbecco | |
| Soro Fetal Bovino-Ouro | PAA | A15-151 | |
| Albumina de Soro Bovino | PAA | K41-001 | |
| Colagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grau II bovino pancreático | Roche | 10 104 159 001 | |
| Tripsina-EDTA 10x em PBS | PAA | L11-001 | conc. 20 mg/ml |
| Kit de Rotulagem de Proteínas Alexa Fluor 488 | Sondas Moleculares | A-10235 | |
| anti-humano CDR2 (purificado) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Alemanha | marcado com Alexa Fluor 488 | |
| anti-humano CD45 (Azul Pacífico) | Biolegend | 304022 | |
| EpCAM anti-humano (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| CD11c (PE) anti-humano | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| Microesferas anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| microesferas anti-CD45, humano | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| Colunas LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Tubos C gentleMACS | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | para dissociador de tecidos |
| Percoll (densidade 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Água destilada estéril (livre de DNAse/ RNAse) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | pré-diluição 1:10, use 20 μ L / 1 x 106< / SUP>Cells |
| 0,22 μ Filtro M | Millex GS | SLGS033SS | acionada por seringa |
| Millipore | SCGPU05RE | PC acionados por bomba | |
| 50 ml | Nalgene | 3118-0050 | Tubos |
| cônicos PP de 50 ml 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | |
| Tubos de ensaio de 12 mm x 75 mm 5 ml | Becton Dickinson | 352058 | Coloração FACS |
| Filtro de célula 70 μ m | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Citômetro-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociador | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | dissociador de tecidos |
Referências
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and c....
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Reimpressões e permissões
