O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

Summary

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

Abstract

Neste protocolo, proporcionar um método para isolar as células dendríticas (DC) e células epiteliais (TEC) a partir do timo humano. DC e TEC são a principal célula apresentadoras de antígenos (APC) tipos encontrados em um timo normal e está bem estabelecido que desempenham papéis distintos durante a seleção do timo. Essas células estão localizadas em microambientes distintos no timo e cada tipo APC representa apenas uma pequena população de células. Para melhor compreender a biologia destes tipos de células, a caracterização dessas populações de células é altamente desejável, mas devido à sua baixa frequência, o isolamento de qualquer um destes tipos celulares requer um procedimento eficiente e reprodutível. Este protocolo detalha um método para obter células adequadas para a caracterização de diversas propriedades celulares. Tecido do timo é mecanicamente perturbado e após diferentes passos de digestão enzimática, a suspensão de células resultante é enriquecida com um passo de centrifugação de densidade de Percoll. Para o isolamento de mielóide DC (CD11c <sup> +), células da fração de baixa densidade (FDL) são immunoselected por separação de células magnéticas. O enriquecimento de populações TEC (Mtec, CTEC) é alcançada por esgotamento de hematopoiéticas (CD45 ^hi), as células da fração de baixa densidade celular Percoll permitindo a sua posterior isolamento através de fluorescência de células ativadas (FACS) utilizando marcadores específicos de células. As células isoladas podem ser usadas para diferentes aplicações a jusante.

Introduction

O timo é o órgão em que o desenvolvimento de células T ocorre. O seu tamanho relativo e absoluto diminui com a idade, quando se torna sucessivamente substituído por gordura, embora a actividade do timo pode ainda ser detectado na velhice. A sua importância para a resposta imune foi demonstrado na década de 1960 ^1.

O repertório de células T é formada através da interacção dos receptores de células T com complexos de peptídeo-MHC em diferentes tipos de APC do timo, que fornecem sinais de sobrevivência ou morte para o desenvolvimento de células T, resultando em um repertório de células T funcionais e são amplamente auto-tolerante ^2.

Aproximadamente 98% das células do timo humano estão a desenvolver células T referidos como timócitos. Os restantes 2% são constituídos por um número de diferentes tipos de células, incluindo uma variedade de TCE (cortical, medular, subcapsular), mielóide e plasmocitï DC (MDC, pDC), macrófagos, células B, células T re-circulação maduras, granulócitos, fibroblasts, células endoteliais e células epiteliais muito raras com um fenótipo de expressão semelhante ao de células de outros tecidos tais como o músculo, os neurónios e epitélio respiratório (Figura 1). Destes, TEC e DC são os principais tipos de APC encontrados em um timo normal. Nos últimos anos, a purificação destes tipos da APC para a cultura e perfil molecular ganhou mais e mais interesse. Devido à sua baixa frequência, o isolamento de qualquer um destes tipos de células para análise detalhada requer um processo eficiente, reprodutível e de baixo custo. O método aqui apresentado é uma modificação a partir de estudos publicados anteriormente ^3,4.

Tal como acontece com qualquer outro tecido, extracção a partir de células do timo pode ser conseguida por via enzimática a desagregar-célula e redes de interacção célula-matriz, a fim de obter uma suspensão de células individuais. Existem certos parâmetros, como uma boa eficiência de dissociação, o rendimento celular, viabilidade celular e retenção de célula smarcadores urface que são cruciais e devem ser otimizados para o isolamento de sucesso destas populações de células raras.

Neste protocolo, o isolamento de DC e subconjuntos TEC é realizada através de uma suspensão de uma única célula do tecido por perturbação mecânica e de digestão enzimática. Usamos colagenase A de Clostridium histolyticum, que tem uma proporção equilibrada de diferentes actividades enzimáticas, para quebrar o colagénio nativo que mantém o tecido em conjunto. ADNase I está incluído na solução de enzima para reduzir a agregação das células, devido a ADN isento de células mortas (timócitos são muito sensíveis). Também proporcionam uma abordagem alternativa para a digestão enzimática do tecido típica envolve o tratamento de tecidos mecânica e enzimática assistida por um Dissociator tecido. A suspensão de célula única é então sujeito a uma única centrifugação de densidade de Percoll para o enriquecimento da fracção de baixa densidade (LDF) de células. A partir desta fracção de células, DC pode ser isolado através de coloração fou DC marcadores de superfície (isto é, CD11c ⁺⁾ e utilizando separação magnética ou de células activadas por fluorescência (FACS). Ao contrário das células linfóides que compreendem a maioria das células no timo, o TEC não expressam CD45 em níveis elevados, mas são positivas para a adesão da célula epitelial molécula EpCAM. CTECs pode ser distinguido do TCE medular pela expressão de um antigénio ainda indefinido reconhecido pelo CDR-2 (dendrítica reticulócitos-2 cortical) de anticorpo ^{de 4,5} e um pouco menor expressão EpCAM. O diferencial de co-expressão de EpCAM e CDR2 permite o isolamento eficaz desses subconjuntos TEC através de células de elevada velocidade de triagem ^6.

O protocolo aqui apresentado é otimizado para o tecido do timo humano. A duração do processo depende da quantidade de tecido e a capacidade do experimentador, bem como a velocidade do classificador de células, se for utilizado separação FACS. Normalmente, o protocolo para o isolamento de DC pode ser concluída dentro de 5Hr -6 e para o isolamento do TCE em 8-10 horas. O isolamento de DC e subconjuntos do TEC a partir de tecido do timo é sensível ao tempo. Quanto mais rápido o processo de isolamento, a melhor o estado das células. Finalmente, as células isoladas podem ser utilizadas para outras investigações, como estudos comparativos de ARNm e a expressão da proteína, as experiências de PCR, o isolamento da proteína, o perfil molecular (isto é, transcritômica, análise de micro RNA), assim como a cultura de ⁶ células.

Declaração de Ética

A fim de ser capaz de trabalhar com o tecido do timo humano o pesquisador precisa obter a aprovação do comitê de ética local ou autoridades responsáveis, bem como um consentimento informado por escrito do doador (ou geralmente seus pais, uma vez que o tecido é geralmente obtida a partir de menor de idade crianças). Além disso, todos os tecidos humanos devem ser tratadas como sendo devem ser tomadas medidas potencialmente infecciosas e apropriados, tais como trabalhar com luvas, etc.

Protocol

1. Preparação de ferramentas, soluções enzimáticas e amortecedores

Execute as seguintes etapas de preparação antes do início do protocolo.

1. Ferramentas
   Limpo, seco e autoclave as seguintes ferramentas e mantê-los em embalagem estéril até o uso.
   1. Pequenas tesoura afiada com pontas ou curvas ou retas para cortar o tecido do timo. Pequenas pinças curvas com pontas serrilhadas para lidar com o tecido.
   2. 50 ml de Oak Ridge centrífuga Tubos, PC, para a etapa de centrifugação Percoll densidade.
2. Soluções enzimáticas
   Prepare a colagenase / ADNase I enzima misturar (2 mg de colagenase / mL e 0,1 mg de ADNase I / ml) como segue:
   1. Dissolve-se 500 mg de liofilizado de colagenase A (Roche) em 250 ml de meio RPMI 1640 plano (sem FCS) para obter uma solução a 2 mg / ml de colagenase. Colagenase é bastante difícil de dissolver, por isso recomenda-se a deixá-lo algum tempo em uma montanha-agitador à temperatura ambiente.
   2. Dissolve-se 100 mg de ADNase I (Roche) em10 ml de água destilada estéril. 2,5 ml aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C. Adicionar 2,5 ml de solução a 10 mg de ADNase I na solução de 2 mg de colagenase A.
   3. Efectuar a filtração estéril da mistura de colagenase / ADNase utilizando uma unidade de filtro Stericup (0,22 mM). Armazenar em 10-20 mL de alíquotas a -20 ° C até à sua utilização.
3. Tampões e Soluções
   1. Solução de estoque 1,5 M de NaCl: Dissolver NaCl em água destilada estéril até uma concentração final de 1,5 M. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um e armazenamento à temperatura ambiente.
   2. Tampão 10x MACS: 1 x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} livre) contendo 5% de BSA e 20 mM de EDTA. Efectuar a filtração estéril da solução com um filtro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. Antes de utilizar, preparar uma solução 1x diluindo o estoque de 10x para 1x no frio estéril 1x PBS.
   3. FACS buffer: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} livre) contendo 1% de BSA e 0,02% _{de NaN3.}
   4. FACS buffer para separação de células: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg

2. Preparação do Tecido

A transformação do tecido deve ser realizada utilizando reagentes estéreis e o trabalho num gabinete de fluxo laminar. Antes do procedimento começa, prepare os seguintes reagentes e equipamentos:

1. 1. Aquece-se a seguir a RT: meio RPMI 1640 completo (RPMI 1640, 10% soro fetal de bovino, 1% de pen / strep), meio RPMI 1640 normal, Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} livre de PBS e uma solução enzimática de colagenase / ADNase 2x.
   2. Incubadora térmica quente com unidade de rotação de 37 ° C e frio ângulo fixo rotor de centrífuga a 4 ° C.
   3. Prepare uma caixa com gelo.

Nota: a duração deste passo depende da condição e tamanho do tecido. Cerca de 20-30 minutos é o tempo razoável necessário para uma peça de tamanho médio de tissue em bom estado (~ 5 cm de largura).

2. Coloque o tecido em uma placa de Petri contendo PBS estéril e enxaguar qualquer sangue residual.
   1. Adicionar PBS fresco para evitar que o tecido de secagem e usando uma pinça e tesouras limpar o tecido a partir de coágulos sanguíneos, tecido conjuntivo e gordura e qualquer parte que não parece saudável.
   2. Tome cuidado para remover o tecido necrosado que vai aumentar a quantidade de detritos.
   3. Depois de limpar, pesar tecido para referência.
   4. Corte o tecido em cerca de 1 cm ³ peças / blocos. Adicionar suficiente PBS para cobrir o tecido.

Nota: Para a reprodutibilidade dos resultados, o tecido deve ser cortada em pedaços de tamanho uniforme.

3. Usando a parte traseira de uma seringa estéril (10-20 ml) aplicar pressão (não muito vigorosa ou prolongada) para os pedaços de tecido tímico. Este procedimento irá remover a maior parte dos timócitos, reduzindo, assim, o volume de tecido para ser digerida depois. Execute esta etapa no gelo e trabalhar rápido.
4. A solução se tornará visivelmente turva como timócitos são liberados. Agita-se o prato gentilmente e depois com a ajuda de uma pipeta de 5 ml ou um aspirador de vidro remove-se o sobrenadante contendo os timócitos tomando cuidado para não aspirar acidentalmente os pedaços de tecido.

Dica: Um raspador de cultura de células estéril pode ser usada para concentrar todos os pedaços de tecido de um lado do prato depois inclinar o prato (45 ° de ângulo) e aspirar o sobrenadante. Substitua com PBS fresco e repita este procedimento até que o sobrenadante é relativamente transparente. Realize última lavagem com RPMI simples.

5. Picar pedaços de tecido usando uma tesoura afiada (tão finamente quanto possível, os fragmentos devem ser, pelo menos, 2-4 mm). Os fragmentos devem ser pequenos o suficiente para inserir uma pipeta de 5 ml.

3. Preparação de suspensão única célula de Thymus Tissue

Aqui,duas abordagens alternativas para este passo encontram-se descritos. A primeira abordagem descreve uma digestão enzimática do tecido típico (seção 3.1), enquanto o segundo envolve o tratamento de tecido mecânico e enzimático assistida por um Dissociator tecido (seção 3.2).

Este protocolo é otimizado para o processamento de amostras de tecido pesando 5 g. Para amostras de tecido maiores ou menores, ajustar volumes de enzima em conformidade.

3.1 digestão enzimática típica tecido para se obter uma suspensão de célula única

1. Colocar o tecido triturada em tubos de 50 ml com 10 ml de solução de colagenase / ADNase por 5 g de tecido. Adicionar RPMI simples para se obter um volume total de 20 ml.

Nota: em um tubo de 50 ml de digerir-se a 10 g de tecido. Ajustar o volume da enzima de acordo.

2. Incubar a suspensão de tecido, durante 40 min a 37 ° C sob rotação lenta em um incubador térmico.

Nota:

3. A solução enzimática irá tornar-se turva como células são liberados para ele. No final da digestão, o tubo de centrifugação a 110 xg durante 2 min para sedimentar os fragmentos de tecido.
4. Coletar sobrenadante desta digestão rodada. Centrifugue a suspensão de células durante 10 min a 400 x g. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10-50 ml de RPMI completo, dependendo do tamanho do agregado de células.
5. Mantenha suspensão de células em 37 ° C incubadora com a tampa solta.
6. Se o número de células maiores são desejadas, o passo de digestão pode ser repetido com os restantes fragmentos de tecido e o primeiro e o segundo digerir reunidas. Além disso, se TEC deve ser isolada, duas rodadas de digestões deve ser realizada.
7. Dilui-se uma alíquota da suspensão de células em azul de tripano (1:10-1:100) e contagem de células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Mantenha as células a 37 ° C na incubadora até que esteja pronto para avançar para a centrifugação de densidade Percoll (seção 4). Isolamento subsequente de subconjuntos DC (seção 5) será realizada a partir dessas células.

Nota: os tecidos do timo pode variar na sua composição, em especial com a idade, que afecta a eficiência da digestão e a geração de uma suspensão de célula única.

9. Para o isolamento posterior de células epiteliais tímicas (TEC) é necessária uma terceira rodada de digestão enzimática. Tecidos remanescentes Ressuspender em 10 ml de solução de colagenase / ADNase fresco mais 10 ml de meio RPMI simples e adicionar tripsina / EDTA (1:50 de 2,5%) de uma solução.
10. Incubar a 37 ° C durante 40 minutos com rotação suave. Durante a última de 10 - 15 min de incubação a adicionar FCS (1:5) para neutralizar a actividade de tripsina.
11. Centrifugar a 110 xg durante 2 min à temperatura ambiente para sedimentar os fragmentos de tecido.

12. Recolher o sobrenadante celular e descartar os fragmentos de tecido sedimentadas.
13. Centrifuga-se o sobrenadante das células a 400 xg durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio RPMI completo.

Dica: pelotas celulares são bastante frouxa, por isso tome cuidado quando descartar / aspiração sobrenadante.

14. Contagem de células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C até a proceder à separação de Percoll (a secção 4). Subsequente pré-enriquecimento de células TEC pela depleção de células CD45 ^hi será realizada a partir dessas células (Secção 6).

3.2 tratamento tecido mecânico e enzimático assistida por um tecido Dissociator

7,8.

1. Transferência de 5 g de pedaços de tecido de carnes (passo 2.5) em um tubo de C contendo 10 ml de solução de colagenase / ADNase.
2. Adaptar tubo C para a Dissociator tecido e m_spleen_02 programa run (10 seg.) Repita este programa 4-5x (40-50 seg.)
3. Incubar, com rotação suave, durante 20 min a 37 ° C.
4. Centrifugar a 110 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
5. Recolher o sobrenadante e proceda como na etapa 3.1.4. Adicionar 10 ml de solução de colagenase / DNase fresco.
6. Adaptar tubo C para a Dissociator tecido e m_spleen_01 programa run (56 seg.)
7. Incubar a 37 ° C durante 20 minutos com rotação suave.
8. Centrifugar a 110 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
9. Collecsobrenadante de células T e o pellet a suspensão de células durante 10 min a 400 x g. Proceder como na etapa 3.1.4.
10. Conforme descrito no ponto 3.1.9 é necessária uma terceira rodada de digestão para o posterior isolamento de células epiteliais tímicas (TEC). Por isso, os restos de tecido ressuspender em 10 ml de solução de colagenase / ADNase fresco mais tripsina / EDTA (diluição 1:50 de estoque de 2,5%)
11. Incubar a 37 ° C durante mais 20 minutos com rotação suave. Adicionar FCS (1:5) e incubar por mais 10 min.

Nota: Usando essa abordagem, após esta última etapa da digestão do tecido geralmente é completamente dissociado e sem fragmentos de tecido não digeridos são observados.

12. Proceder como em passos 3.1.11-3.1.14.

4. Enriquecimento da LDF de células usando Separação Percoll densidade

Após a digestão enzimática de tecido, suspensões de células individuais do timo totais são sujeitas a um único centrifugat Percollpasso de iões para enriquecer as células LDF. O LDF de células é altamente enriquecido para APC. Ambos DC e TCE são detectados nesta fracção de células.

1. Use suspensão única célula obtido a partir da 1 ^ª e 2 ^ª digere para mDC isolamento (células agrupadas, veja o passo 3.1.8) ou 3 ^º digest (para isolamento TEC) (3.1.14). Suspensão de células individuais obtidas a partir de centrífuga de cada passo de digestão a 400 xg durante 10 min.
2. Prepara-se uma solução de Percoll com uma densidade final de 1,07 g / ml, durante este passo de lavagem (ver exemplo na tabela abaixo).

   Preparação da solução de Percoll para uma densidade final de 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
   Tubo Não.	1	2	3	4
   Não diluído Percoll (ρ = 1,130) (ml)	2.96	5,92	8.88	11.84
   1,5 M de NaCl (ml)	0,6	1.20	1.8	2.4
   H2O destilada (mL)	2.44	4,88	7,32	9.76
   Volume de final de diluição de trabalho	6 ml	12 ml	18 ml	24 ml

3. O número de tubos de Percoll depende do número de células em determinados passos 3.1.8 e / ou 3.1.14. Combine as soluções estéreis e misture bem. Para o isolamento ideal, 0,6-1 x 10 ⁹ células pode ser carregado por tubo de Percoll. Combine as soluções estéreis e misture bem.

Dica: Percoll é sensível à luz e, além disso, deve ser mantido frio. Prepare a primeira mistura contendo o NaCl e _H2O (TA) e adicionar diluído Percoll último, pouco antes de ressuspensão das células na solução de Percoll.

tenda "> Nota: densidade Percoll pode variar entre diferentes fornecedores e lotes Se a densidade da solução de Percoll não diluído não é igual a 1,130 g / ml, utilize as instruções fornecidas pelo fabricante para calcular as quantidades exatas de Percoll e H ₂ O necessária para obter uma densidade final de 1,07 g / ml.

4. Ressuspender até 1 x 10 ⁹ células em 6 ml de solução de Percoll preparada (ρ = 1,07), misturar suficientemente para obter uma suspensão homogénea, e transferir para um tubo de tampa de rosca de policarbonato de centrífuga de 50 ml de Oak Ridge.
5. Camada cuidadosamente 30 ml de meio RPMI completo por tubo com uma pipeta no topo da suspensão de solução de Percoll / célula. Carregar o meio lentamente, de modo a que permaneça no topo da suspensão e ter o cuidado de não perturbar a camada.
6. Pesar os tubos para se certificar de que eles têm pesos iguais, de modo que eles estão equilibradas durante a centrifugação. Se eles não estiverem, adicione cuidadosamente mais meio ao tubo mais leve (menos de ruacondições erile).
7. Transferir cuidadosamente os tubos para uma centrífuga previamente arrefecido com um rotor de ângulo fixo, e centrifugação a 3500 xg durante 35 min, a 4 ° C com o freio. Certifique-se de que a temperatura da centrifugadora em não superior a 4 ° C.
8. Retire os tubos da centrifugadora e cuidadosamente recolher o APC enriquecido, encontrado na interfase entre o Percoll e meio (fracção de baixa densidade) a partir de cada tubo com uma pipeta Pasteur estéril. Transferência de células em um tubo de 50 ml contendo frio completo RPMI. Encha o tubo, a fim de diluir o restante Percoll.
9. Centrifugar a suspensão de células durante 10 minutos a 300 xg, a 4 ° C. Elimine o sobrenadante e lavagem de repetição.
10. Ressuspender o sedimento de células em meio e determinar o número de células (utilizando azul tripano e um hemocitómetro). Na nossa experiência, a percentagem das células FDL é cerca de 2-20% da suspensão de célula única total obtido após a digestão enzimática. A y típicoield de células enriquecidas de baixa densidade (de uma nova gama de timo, anos um dia-2) é 1x10 ⁸ células por 1 x 10 ^9, o que representa 10% do total de células individuais de células em suspensão.

Nota: Nesta etapa, você pode observar que as células agregadas na suspensão (especialmente com amostras de crianças de idade mais avançada). Aglomerados celulares são indicação de morte celular e resultado da liberação de DNA das células moribundas que podem ficar células juntas. Nesse caso, adicionar DNase I na amostra (50 ug / ml) e incuba-se que para cima de 20 min à temperatura ambiente (inverter cuidadosamente todos os 5 min) para digerir as moléculas de ADN livre.

5. Isolamento do timo mDC

Após APC enriquecimento (por separação de Percoll), mDC pode ser eficientemente isolado do LDF após a primeira e segunda ronda de digestões enzimáticas. O protocolo que se segue é uma versão modificada de separação magnética de células para o isolamento de mDC (CD11c

1. Centrífuga APC enriquecida de células isoladas a partir da suspensão de células individuais obtidas a partir da primeira e segunda digestão enzimática agrupada a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender sedimento de células em tampão 100 ul por MACS 10 ⁷ células.
2. Adicionar 5 uL de anticorpo CD11c-PE por 10 ⁷ células.

Nota: experimentos de titulação são recomendados para melhores resultados.

3. Misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C, protegidos da luz.
4. Lavar as células por adição de 1-2 ml de tampão por MACS 10 ⁷ células e centrifugar a 300 xg durante 10 min.
5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente até 10 ⁷ células em 80 mL de tampão MACS.
6. Adicionar 20 ul microesferas anti-PE por 10 ⁷ células.
7. Misture bem (não vortex) e incubar durante 15 min a 4 ° C, protegida da luz.
8. Repita como no passo 5.4. Ressuspender ⁸ até 10 células em 500 ul de tampão.
9. Se necessário, a suspensão de célula de filtro usando um filtro celular de 40 mM para remover detritos celulares e agregados, que podem obstruir o fluxo da coluna.
10. Use uma coluna LS desde suspensões de células do timo fluir melhor através das colunas LS. Prepare coluna LS seguindo as instruções do fabricante. Suspensão de células de pipeta lentamente na coluna evitando gerando bolhas. Use uma coluna para cada 1 x 10 ⁸ células.
11. Lavar coluna seguindo as instruções do fabricante. Remover coluna de ímã e coloque-o em um estéril 12 ml rodada tubo de polipropileno de fundo. Adicionar 3 ml de tampão MACS na coluna e recolher as células magneticamente marcadas, inserindo e empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna.
12. Recolher a fracção eluída representando o CD11c ⁺ mDC e centrifugar a 400 xg durante 6 minutos.
13. Determinar o número de células e confirmar a pureza da populati célula selecionadapela análise por citometria de fluxo. Sugeridas incluem marcadores CD45, CD11c e HLA-DR.

Nota: CD11c ⁺ mDC podem também ser isolados utilizando um separador FACS.

6. Enriquecimento de células CD45 ^{lo / neg} para classificação celular da TEC

Para o isolamento da TEC, as células podem ser pré-enriquecida pela depleção de células CD45 ^hi utilizando microesferas de CD45, de modo a acelerar o seu isolamento por meio de separação de células.

Use suspensão de células individuais obtidas a partir da etapa de digestão 3 ^rd (3.1.14) e posteriormente separadas por centrifugação de Percoll.

1. Suspensão de células de centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender o sedimento celular em 80 ul de solução tampão por MACS 10 ⁷ células.
2. Use micropérolas CD45 a 1/3 da quantidade recomendada (6,7 mL) por 10 ⁷ células.

Nota: Ao usar uma quantidade menordas microesferas de nós pré-enriquecer células tanto para CD45 ^lo e as células CD45 ^neg. Titulação é recomendado para melhores resultados.

3. Misture bem sacudindo suavemente o tubo (Não Vortex) e incubar por 15 minutos a 4 ° C.
4. Lavar as microesferas não ligadas por adição de 10 ml de tampão e centrifuga-se MACS durante 10 minutos a 300 xg, a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente.
5. Ressuspender ⁸ até 10 células em 500 ul de tampão.
6. Se necessário, a suspensão de célula de filtro usando um filtro celular de 70 mM para remover detritos celulares e agregados, que podem obstruir o fluxo da coluna.
7. Use uma coluna LS desde suspensões de células do timo fluir melhor através das colunas LS. Prepare coluna LS seguindo as instruções do fabricante. Suspensão de células de pipeta lentamente na coluna evitando gerando bolhas. Use uma coluna para cada 10 ⁸ células.
8. Coletar as células não marcadas (escoamento e lavagens) contendoa fracção de células ^{lo / neg} CD45 e lavagem da coluna, seguindo as instruções do fabricante.
9. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender sedimento celular em tampão FACS estéreis, a fim de determinar o número de células e continuar a coloração para separação de células.

7. Células Stain para classificação celular de fluorescência Activated

1. Realizar FcR bloqueio antes da coloração das células, a fim de reduzir o anticorpo não-específico de ligação. Incubar a suspensão de células com solução de imunoglobulinas humanas reunidas durante 15 min à temperatura ambiente. Estes reagentes encontram-se comercialmente disponíveis (ou seja, Gammunex 10% de solução).
2. Lavar as células por adição de tampão de FACS estéril fria. Centrifugar a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
3. Elimine o sobrenadante e ressuspender as células em tampão FACS estéril frio. Prepare 5 amostras de acordo com o seguinte exemplo:
   

   * SCC, controle de cor única

   Incubar as células com os anticorpos durante 30 min, em gelo no escuro.
   Lavar duas vezes com tampão FACS, centrifugando as células a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
   Ajustar a concentração de células da amostra a ser classificado para um x10 ⁷ células / ml (ou à concentração recomendada pela instalação de triagem de células) utilizando FACS estéreis tampão de separação de células (isto é, sem NaN _3).
   Passe amostra de células através de um filtro de células 70 mM para remover quaisquer aglomerados de células que podem entupir o citômetro durante a classificação.
   Ressuspender as amostras de controlo em 200-400 ul de tampão. Manter os tubos em gelo e protegida da luz.
   Prepare tubos de coleta com o meio.

   Notas:

   • Realizar a titulação dos anticorpos para coloração óptima.
   • Em um exemplo, para seleccionar, de até 50 x 10 ⁶ células podem ser coradas em um volume total de reacção de500 ul.
   • Realizar a coloração da amostra a ser classificada em 5 ml Falcon poliestireno tubos de fundo redondo. Os controlos de cor individuais podem ser coradas em poços separados de uma placa de 96 poços.
   • Desde subconjuntos TEC são populações raros, é aconselhável a utilização de outro marcador positivo (de alta frequência) para cada fluorocromo para facilitar a determinação das configurações FACS adequadas e para se certificar de que você tem uma compensação adequada se a escolha de fluorocromos exige compensação. As células a partir da fracção CD45 ⁺ podem ser marcadas com marcadores tais como CD45, CD3 ou CD8 para os diferentes fluorocromos e depois da coloração das células não coradas CD45 ⁺ podem ser adicionados à amostra.

   8. Isolamento do TEC por fluorescência celular ativado

   Subconjuntos TEC podem ser classificados a partir da fração ^{lo / neg} CD45 como EpCAM ^oi CDR2 ^- (Mtec) ou EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   1. Execute o wit amostrah as células não coradas e ajustar a dispersão frontal e lateral, a fim de colocar a população de interesse em escala. Ajustar a tensão em cada um dos detectores de modo a que as células são visíveis, mas localiza-se na parte do lado mais à esquerda do histograma.
   2. Execute cada amostra manchado único e ajustar a compensação para cada cor.
   3. Depois de ajustar a tensão e compensação para os controles manchadas não coradas e individuais executar o exemplo a ser classificada e ferramentas de uso gating para definir a população de interesse. Use uma ampla frente e dispersão lateral portão para garantir a inclusão de todos os tamanhos de células do estroma, excluindo os restos celulares.
   4. No gráfico de pontos com o Blue CD45-Pacífico contra portão Forward Scatter sobre as células ^{neg baixos} e CD45 CD45.
   5. Aplicar esta porta para uma EpCAM contra CDR2 gráfico de pontos e determinar por gating as populações a serem ordenados.
   6. Uma vez portões foram determinadas, selecione as portas que contêm as populações de interesse e começar a classificação.

   Nota: Durante a triagem, a fim de evitar que as células adira às paredes do tubo de recolha, o tubo pode ser pré-revestida, enchendo--se com 50% de FCS em PBS e incubados à TA durante 30 min. Descartar a solução de revestimento antes de adicionar mídia de coleta.

   Representative Results

   Como material de partida neste protocolo que usamos tecido do timo removido crianças submetidas à cirurgia cardiovascular corretiva (Departamento de Cirurgia Torácica e Cardiovascular da Universidade Tuebingen Clinic) obtidos após consentimento informado e sob as diretrizes institucionais. Este material descartado pode variar muito em tamanho 2-30 g ou mais. O número de subconjuntos e mDC TEC (CTEC e Mtec) que são obtidos depende do tamanho assim como da idade da amostra de tecido do timo para o isolamento.

   A Figura 2 mostra uma bastante grande pedaço de tecido (~ 9 cm), obtido a partir de uma criança com seis anos de idade. Um primeiro passo preparativo importante neste protocolo é a limpeza de tecido de partes indesejadas (indicadas pelas setas brancas).

   Thymus tecido foi tratado conforme descrito nas secções 2 e 3.1 do protocolo para obter uma suspensão única célula que foi separada através de uma única densidade Percoll centrifugação step Enquanto a suspensão de célula única contém aproximadamente 3% de células HLA-DR + (Figura 3A), depois de centrifugação Percoll esta percentagem é aumentada na fracção de baixa densidade (LDF), contendo as células de grandes dimensões, para 15-40%, enquanto o fracção de elevada densidade (HDF), que consiste principalmente de timócitos uniformes de pequena dimensão não contém virtualmente nenhum tais células (Figura 3B). A fração de interesse (LDF), contendo enriquecido APC foi posteriormente recolhidos e lavados para coletar células para utilização em etapas posteriores de isolamento.

   Enquanto timo mDC podem ser identificados pela expressão de um conjunto de marcadores de superfície, incluindo CD11c9, 10, pDC expressam marcadores, tais como BDCA-2, BDCA-4, CD45RA e CD123 ^11,12. Após enriquecimento das células LDF, ambos os tipos de células constitui 2-10% desta fracção, o que permite o seu isolamento eficaz também em grande número, por separação magnética de células ou de fluxo de triagem de CD11c ⁺ ou BDCA-4 ⁺células ^6.

   A Figura 4 mostra o isolamento eficiente de células CD11c ^+, utilizando o protocolo de separação magnética de células modificado descrito na Secção 5. Após o isolamento, a pureza do CD11c ⁺ DC era de 93% como estabelecido por imunocoloração de células isoladas. Em média, a recuperação do isolado CD11c ⁺ DC é de 5 x 10 ⁵ x 10 -5 ⁶ mDC por 10 ⁹ células do timo total de dados. Tabela 1 mostra obtidos a partir de várias amostras de timo individuais de diferentes idades e peso do tecido com uma gama de entrada única As suspensões de células, bem como o número total LDF e a subsequente ⁺ rendimento e pureza CD11c.

   Na fracção enriquecida APC, apenas cerca de 0,5% das células são CD45 ^eis EpCAM ⁺ ou CD45 ^{+ neg} EpCAM. CTEC e Mtec podem ser classificados a partir dos CD45 ^{lo / neg} enriquecidos células estromais digerido com tripsina como EpCAM ^l o CDR2 ⁺ e EpCAM ^oi CDR2 ^-, respectivamente, como mostrado na Figura 5.

   
   Figura 1. Um diagrama simplificado de a organização celular e a composição do timo humano. O timo consiste de timócitos, em diferentes estádios de maturação, e uma rede celular heterogénea referido como o estroma tímico formando o ambiente do timo. Os principais tipos de células do estroma do timo são MDC e PDC células epiteliais (divididos em duas categorias principais de acordo com sua localização dentro do lóbulo: cortical e medular) e macrófagos Abreviaturas: DC, células dendríticas; MDC, células dendríticas mielóides;. PDC células dendríticas plasmocitóides, MO, macrófagos; mono, os monócitos; CTEC, células epiteliais corticais; Mtec, células epiteliais medulares.

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   Figura 2. Primeira etapa preparativa de tecido para a preparação de uma única célula. Ponto setas para as peças de tecidos indesejáveis ​​que têm de ser eliminados antes da execução do protocolo.

   
   Figura 3. A purificação do timo análise APC. FACS de diferentes fases do processo de purificação. As suspensões de células isoladas de tecido do timo foram obtidas por ruptura mecânica e digestões enzimáticas de série e APC enriquecido (células LDF) por separação de Percoll densidade. Células antes (A) e após (B) a separação Percoll densidade foram coradas com anticorpo HLA-DR-PE para verificar se há APC enriquecimento. Intervalo percentual de células HLA-DR + tipicamente observados é indicando ed.

   
   Figura 4. Isolamento de tecido do timo CD11c ⁺ MDC. Foi digerido com colagenase A / ADNase I para criar uma suspensão de célula única. CD11c ⁺ mDC representam apenas uma população menor da suspensão de células individuais (0,6%). Após enriquecimento das células do FDL através de separação de Percoll densidade a percentagem de células CD11c ⁺ aumenta para ~ 9%. As células foram marcadas com FDL anticorpo CD11c-PE e, subsequentemente, isolado usando esferas magnéticas (anti-PE). Reanálise do CD11c ⁺ população diretamente após a separação magnética de células por FACS indicou 93% de pureza. Clique aqui para ver maior figura .

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   Figura 5. Enriquecimento de células ^{lo / neg} CD45 e classificação subseqüente de subconjuntos TEC. A) gráficos de pontos representativos mostrando porcentagens de CD45 negativo / baixas células do estroma do timo em suspensões de células isoladas totais antes e depois da separação Percoll densidade (9% e 16,2%, respectivamente). B) As células do FDL foi esgotado de células CD45 ^hi usando esferas magnéticas e os subconjuntos TEC ordenados a partir da fração empobrecido EpCAM ^oi CDR2 ^- (Mtec) ou EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   Amostra	Tipo de amostra Anticorpo	Número de celular	O volume total
   1. imaculado	controle		1 x 10 6	50 ul
   2.scc *-Pacific Blue	controle	CD45-Pacific Blue	1 x 10 6	50 ul
   3. SCC-APC	controle	CD3-APC	1 x 10 6	50 ul
   4.scc-Alexa 488	controle	CD8-Alexa 488	1 x 10 6	50 ul
   5. Separação de células	analito	CD45-Pacific Blue EpCAM-APC CDR2-Alexa 488	10 x 10 6 - 50 x 10 6	500 ul 10 x 10 6 mL células/100

   Freqüências CD11c + MDC, rendimentos celulares e purezas de diferentes doadores
   Doador	Idade	Peso Tissue	Total de células por amostra	Células FDL por amostra	CD11c+%	CD11c + isolado por amostra	CD11c + pureza
   1	5 dias	7 g	1,45 x 10 9	9,5 x10 7	12,6	2,4 x 10 6	89%
   2	3 anos	15 g	2 x 10 9	6,5 x10 7	4.3	1,9 x 10 6	81%
   3	21 dias	9 g	2,6 x 10 9	22 x10 7	10.3	3,6 x 10 6	93%
   4	6 anos	13 g	1,4 x 10 9	25,4 x10 7	4.2	5,7 x 10 6	82%
   5	5 dias	6,5 g	1,3 x 10 9	16,2 x10 7	6	2,9 x 10 6	91%
   6	39 dias	3 g	0,6 x 10 9	8 x10 7	3.4	1,3 x 10 6	80%

   Tabela 1. O número de células em suspensão de células individuais totais lançados após duas rodadas de digestão, bem como os rendimentos de células FDL após a separação Percoll são mostrados para isolamentos realizados em amostras de timo de seis indivíduos de diferentes idades e peso do tecido. Freqüências de mDC foram determinadas por citometria de fluxo com base na expressão CD11c em células totais LDF (APC enriquecido). Rendimento e pureza das células CD11c ⁺ após separação esférulas magnéticas são mostrados para cada um dos doadores.

Discussion

O protocolo aqui descrito é uma modificação do protocolo publicado por Gotter et al ^4. As etapas críticas no protocolo são a condição e a preparação inicial do tecido, bem como a separação de densidade de Percoll. É altamente recomendável para processar o tecido, assim que possível após a colheita. É importante trabalhar rapidamente mas cuidadosamente durante a limpeza e corte do tecido. Durante a lavagem de timócitos descrito na etapa 2.3, é crucial para encontrar o equilíbrio certo quando se aplica pressão com a parte de trás do êmbolo da seringa, sobre as peças de tecido, como a pressão muito vigorosa e prolongada pode danificar as células do estroma. Mergulhar o meio em cima da solução suspensão Percoll / célula sem causar perturbações também podem exigir um pouco de prática. Após a centrifugação, é importante para recolher todas as células fracção de baixa densidade, tão rapidamente quanto possível a partir da camada de Percoll com uma quantidade mínima de solução de Percoll.

Ocolheitas de células totais e números relativos de APC pode ser muito variável (ver Tabela 1) e dependem do doador (especialmente no que diz respeito à idade) e as habilidades preparativas do experimentador. Para uma breve visão geral, suspensões de células pode ser manchado com HLA-DR e / ou outros marcadores após diferentes etapas do protocolo se o desejar. Todos os anticorpos utilizados para a análise fenotípica deve ser titulada para alcançar os melhores resultados.

Devido à relativamente baixa abundância de tipos de APC no timo, em comparação com thymoctyes, pedaços maiores de timo, pode ser necessária, se os números mais elevados de células isoladas são desejados.

Se um Dissociator tecido está disponível no laboratório, isso vai acelerar consideravelmente processamento de tecidos, mas ambas as variações descritas aqui funcionam igualmente bem. Um problema relativamente frequente pode ser a aglutinação das células, especialmente durante as etapas de separação entre o Percoll e MACS / separação FACS. Neste caso, um curto ADNase I digestion como descrito no protocolo geral vai resolver o problema. Como o tecido do timo é substituído por tecido adiposo sucessivamente durante o envelhecimento, thymi de doadores mais velhos podem conter alguma gordura, que irá nadar na parte superior do tubo após a centrifugação das suspensões de células individuais obtidas a partir dos diferentes passos de digestão. Em tal caso, a gordura deve ser removido com uma pipeta, antes de continuar o protocolo. Para melhores resultados, bem como razões de economia aconselhamos titular não apenas os anticorpos, mas também as micro-esferas anti-PE (pontos 5 e 6). Para o isolamento de TEC de rato timo, misturas alternativas de enzimas têm sido descritos para melhorar rendimento TEC ^8,13, mas não testei-los com tecido humano.

Em princípio, outros APC e estromais células do timo, como as células B e pDC também pode ser isolada a partir das células de LDF (após digestão com colagenase / ADNase e Percoll) por FACS / MACS triagem se os respectivos marcadores são conhecidos. Por exemplo, para pDC, BDCA-2, BDCA-4 e CD123 foram descritos como marcadores de ^6,14. Se a análise ou isolamento de subconjuntos de timócitos é desejada, recomendamos o uso das células liberadas por espremendo (passo 2.3), uma vez que eles são bastante puro e foram submetidos a manipulação mínima.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator