Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering af myeloide dendritiske celler og epitelceller fra human Thymus

Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/50951
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4, 5, 1
1Department of General Neurology, Hertie Institute for Clinical Brain Research, 2Institute of Pharmacology, University of Bern, 3Department of Immunology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Clinic Tuebingen, 5Department of Neurology, University Hospital Erlangen

Summary

Denne protokol beskriver en metode til isolering af antigen-præsenterende celler fra human thymus via forskellige trin af enzymatisk spaltning af vævet efterfulgt af densitetscentrifugering af enkelt cellesuspension og endelig magnetiske og / eller FACS-sortering af cellepopulationer af interesse.

Abstract

I denne protokol giver vi en metode til at isolere dendritiske celler (DC) og epitelceller (TEC) fra det menneskelige thymus. DC og TEC er den største antigenpræsenterende celle (APC) typer findes i en normal thymus, og det er velkendt, at de spiller forskellige roller i løbet af thymisk valg. Disse celler er lokaliseret i forskellige mikromiljøer i thymus, og hver APC typen udgør kun en mindre population af celler. For yderligere at forstå biologi disse celletyper, karakteriseringen af ​​disse cellepopulationer er meget ønskeligt, men på grund af deres lave frekvens, isolering af nogen af ​​disse celletyper kræver en effektiv og reproducerbar fremgangsmåde. Denne protokol beskriver en metode til at opnå celler er egnede til karakterisering af forskellige cellulære egenskaber. Thymisk væv mekanisk forstyrret og efter forskellige trin i enzymatisk fordøjelse, er den resulterende cellesuspension beriget ved hjælp af en Percoll densitet centrifugering. Til isolering af myeloid DC (CD11 <sup> +) celler fra fraktionen med lav massefylde (LDF) er immunoselected ved magnetisk cellesortering. Berigelse af TEC populationer (MTEC, CTec) opnås ved udtømning af hæmatopoietiske (CD45 hi) celler fra low-density Percoll celle fraktion lade deres efterfølgende isolation via fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) ved hjælp af specifikke cellemarkører den. De isolerede celler kan anvendes til forskellige efterfølgende anvendelser.

Introduction

Thymus er det organ, hvor T-celle-udvikling forekommer. Dets relative og absolutte størrelse falder med alderen, når det bliver successivt erstattet af fedt, selvom thymisk aktivitet stadig kan påvises i alderdommen. Dens betydning for immunresponset blev påvist i begyndelsen af 1960'erne 1..

T-celle-repertoire er formet gennem interaktion af T-celle-receptorer med peptid-MHC-komplekser på forskellige typer af thymus APC, som giver overlevelse eller død signaler på at udvikle T-celler, hvilket resulterer i en funktionel og i vid udstrækning selv-tolerant T-celle-repertoire 2.

Ca. 98% af cellerne i den menneskelige thymus udvikler T-celler omtalt som celler thymocytter. De resterende 2% består af en række forskellige celletyper, herunder en række af TEC (kortikal, medullær, subkapsulær), myeloide og plasmacytoid DC (MDC PDC), makrofager, B-celler, modne re-cirkulerende T-celler, granulocytter, fibroblasts, endotelceller og meget sjældne epitelceller med et udtryk fænotype, der ligner celler fra andre væv, såsom muskel, neuroner og respiratorisk epitel (fig. 1). Af disse TEC og DC er de store APC typer findes i en normal thymus. I de senere år har rensning af disse APC typer for kultur og molekylær profilering fået mere og mere interesse. På grund af deres lave frekvens, isolering af nogen af ​​disse celletyper detaljerede analyser kræver en effektiv, reproducerbar og omkostningseffektiv procedure. Metoden præsenteres her er en modifikation fra tidligere offentliggjorte studier 3,4.

Som med enhver anden væv kan celleekstraktion thymus opnås ved enzymatisk disaggregering celle-celle og celle-matrix-interaktion netværk, for at opnå en suspension af enkeltceller. Der er visse parametre som god dissociation effektivitet, celleudbytte, levedygtighed og fastholdelse af celle s celleoverfladetransport markører, der er afgørende og skal optimeres for en vellykket isolering af disse sjældne cellepopulationer.

I denne protokol, er isolering af DC og TEC delmængder udføres ved at lave en enkelt celle suspension af væv ved mekanisk sprængning og enzymatisk nedbrydning. Vi bruger Collagenase A fra Clostridium histolyticum, der har et afbalanceret forhold mellem forskellige enzymaktiviteter, at nedbryde native collagen, der holder vævet sammen. DNase I indgår i enzymet løsning til at reducere celleaggregering grund fri DNA fra døde celler (thymocytter er meget følsomme). Vi tilbyder også en alternativ tilgang til den typiske enzymatiske vævsfordøjelse involverer mekanisk og enzymatisk væv behandling bistået af et væv dissociator. Enkelt celle suspension underkastes derefter en enkelt Percoll-densitetscentrifugering til berigelse af lav densitet fraktion (LDF) af celler. Fra denne fraktion af celler kan DC isoleres ved farvning feller DC-overflade markører (dvs. CD11c +) og ved hjælp af magnetisk separation eller fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). I modsætning til de lymfoide celler, der omfatter størstedelen af ​​celler i thymus, behøver TEC ikke udtrykke CD45 ved høje niveauer, men er positive for epitelcelleadhæsionsmolekyle EpCAM. CTec kan skelnes fra medullær TEC ved ekspression af en endnu udefineret antigen genkendes af CDR-2 (kortikal dendritiske retikulocyt-2)-antistof 4,5 og noget lavere EpCAM udtryk. Den differentielle co-ekspression af EpCAM og CDR2 muliggør effektiv isolering af disse TEC undergrupper via high-speed cellesortering 6.

Protokollen præsenteres her er optimeret til human thymus væv. Varigheden af ​​fremgangsmåden afhænger af mængden af ​​væv og evne til forsøgslederen samt hastigheden af ​​cellesorteringsapparatet, hvis der anvendes FACS-sortering. Normalt kan protokollen til isolering af DC være afsluttet inden for 5-6 Time og til isolering af TEC i 8-10 timer. Isolering af DC og TEC delmængder fra thymus væv er tid følsomme. Jo hurtigere isolation procedure, jo bedre tilstand af cellerne. Endelig kan de isolerede celler anvendes til yderligere undersøgelser som sammenlignende undersøgelser af mRNA og proteinekspression PCR-forsøg, proteinisolering, molekylær profilering (dvs. transcriptomics, mikro RNA-analyse) samt cellekultur 6.

Etiske retningslinjer

For at kunne arbejde med humant thymus væv forskeren har brug for at indhente godkendelse fra lokale etiske udvalg eller de ansvarlige myndigheder samt en informeret skriftligt samtykke fra donor (eller normalt sine forældre, da væv sædvanligvis er fremstillet af mindreårige børn). Desuden bør alle humane væv skal håndteres som potentielt smittefarlige og passende foranstaltninger der skal træffes, såsom at arbejde med handsker osv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Udarbejdelse af Værktøj, enzymløsninger og buffere

Udfør følgende præparative trin forud for påbegyndelse af protokollen.

  1. Værktøj
    Ren, tør og autoklaveres følgende værktøjer og holde dem i sterile emballage indtil brug.
    1. Små skarpe saks med enten buede eller lige tips til at skære brissel væv. Små buede pincet med savtakkede tips til håndtering af væv.
    2. 50 ml Oak Ridge centrifugerør PC, til Percoll-density centrifugering.
  2. Enzymopløsninger
    Forbered Collagenase / DNase I enzymblanding (2 mg Collagenase / ml og 0,1 mg DNase I / ml) som følger:
    1. Opløses 500 mg frysetørret collagenase A (Roche) i 250 ml RPMI 1640 almindelig (ingen FCS) til opnåelse af en 2 mg / ml collagenase-opløsning. Collagenase er ganske svært at opløse, så det anbefales at lade det lidt tid på en rulle-shaker ved RT.
    2. 100 mg DNase I (Roche) i opløses10 ml sterilt, destilleret vand. 2,5 ml alikvoter kan opbevares ved -20 ° C. Tilsæt 2,5 ml af 10 mg DNase opløsning i 2 mg Collagenase En opløsning.
    3. Sterilfilter collagenase / DNase blanding under anvendelse af en Stericup filterenhed (0,22 um). Opbevares i 10-20 ml alikvoter ved -20 ° C indtil brug.
  3. Buffere og løsninger
    1. 1,5 M NaCl stamopløsning: Opløs NaCl i destilleret sterilt vand til en slutkoncentration på 1,5 M. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 um filter og opbevares ved stuetemperatur.
    2. 10x MACS buffer: 1x PBS (Ca2 + / Mg2 +-fri) indeholdende 5% BSA og 20 mM EDTA. Steril filter løsningen med et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C. Før brug forberede en 1x løsning ved at fortynde 10x lager til 1x i koldt steril 1x PBS.
    3. FACS Buffer: 1x PBS (Ca2 + / Mg2 +-fri) indeholdende 1% BSA og 0,02% NaN3.
    4. FACS Buffer til celle sortering: 1x PBS (Ca 2 + / Mg

2. Fremstilling af væv

Behandlingen af ​​vævet bør udføres med sterile reagenser og arbejde i en laminar strømning. Før proceduren begynder, forberede følgende reagenser og udstyr:

    1. Varm følgende til RT: RPMI 1640 komplet medium (RPMI 1640, 10% føtalt kalveserum, 1% pen / strep), RPMI 1640 almindeligt, Ca2 + / Mg2 +-fri PBS og 2x Collagenase / DNase enzymopløsning.
    2. Varm termisk inkubator med roteringsenheden til 37 ° C og afkøles rotor med fast vinkel centrifuge til 4 ° C.
    3. Forbered en kasse med is.

Bemærk: varigheden af dette trin afhænger af tilstanden og størrelsen af vævet. Ca. 20-30 min er rimelig tid for en medium størrelse stykke tissue i god stand (~ 5 cm i bredden).

  1. Placer væv i en petriskål indeholdende steril PBS og skylle overskydende blod.
    1. Føj frisk PBS for at forhindre væv fra tørring og bruge pincet og saks rense væv fra blodpropper, bindevæv og fedtvæv, og en del, der ikke ser sundt.
    2. Vær omhyggelig med at fjerne nekrotisk væv, der vil øge mængden af ​​affald.
    3. Efter rengøring, vejer væv til reference.
    4. Skær vævet i ca 1 cm 3 stykker / blokke. Læg tilstrækkeligt PBS til at dække vævet.

Bemærk: reproducerbarhed af de resultater, bør væv skæres i stykker af ensartet størrelse.

  1. Brug bagsiden af ​​en steril sprøjte (10-20 ml) lægge pres (ikke for kraftig eller langvarig) på thymus væv stykker. Denne procedure vil fjerne hovedparten af ​​thymocyter, hvorved vævsvolumen, der skal nedbrydes senere. Udfør dette trin på is og arbejde hurtigt.
  2. Løsningen bliver synligt uklar som thymocytter frigives. Rør fadet blidt og derefter ved hjælp af en 5 ml pipette eller et glas aspirator fjerne supernatanten indeholder thymocytter pas på ikke at uheld aspirere vævsstykkerne.

Tip: En steril cellekultur skraber kan anvendes til at koncentrere alle vævsstykker ved den ene side af skålen og derefter vippe skålen (45 ° vinkel) og aspireres supernatanten. Erstat med frisk PBS og gentage denne procedure, indtil supernatanten er forholdsvis gennemsigtig. Udfør sidste vask med RPMI sletten.

  1. Hakke vævsstykker ved hjælp af en skarp saks (så fint som muligt, bør fragmenter være mindst 2-4 mm). Fragmenterne bør være lille nok til at indtaste en 5 ml pipette.

3. Udarbejdelse af Single Cell Suspension fra Thymus Tissue

Herto alternative tilgange til dette trin er beskrevet. Den første strategi beskriver en typisk enzymatisk vævsfordøjelse (afsnit 3.1), mens den anden omfatter mekanisk og enzymatisk væv behandling bistået af et væv dissociator (afsnit 3.2).

Denne protokol er optimeret til behandling af vævsprøver, der vejer 5 g. For større eller mindre vævsprøver, justere enzym mængder i overensstemmelse hermed.

3.1 Typisk enzymatisk vævsfordøjelse til opnåelse af en enkelt cellesuspension

  1. Anbring mosede væv i 50 ml rør med 10 ml collagenase / DNase opløsning pr 5 g væv. Tilføj RPMI almindeligt at give et samlet volumen på 20 ml.

Bemærk: I et 50 ml rør fordøje op til 10 g væv. Juster enzym volumen i overensstemmelse hermed.

  1. Inkubér vævssuspension i 40 minutter ved 37 ° C under langsom rotation i en termisk inkubator.

Bemærk:

  1. Enzymopløsningen bliver uklar som celler frigives ind i det. Ved afslutningen af ​​fordøjelsen, centrifugeres røret ved 110 g i 2 minutter for at sedimentere vævsfragmenter.
  2. Saml supernatanten fra denne fordøjelse runde. Pelletere cellesuspension i 10 minutter ved 400 x g. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 10-50 ml RPMI fuldstændig, afhængigt af størrelsen af ​​cellepellet.
  3. Hold cellesuspension i 37 ° C inkubator med hætten løs.
  4. Hvis der ønskes større celleantal kan spaltningstrinnet gentages med de resterende vævsfragmenter og den første og den anden fordøje poolet. Også, hvis TEC skal isoleres, to runder af fordøjelser skal udføres.
  5. Fortyndes en alikvot af cellesuspensionen i trypanblåt (1:10-1:100) og tælle levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer. Hold celler ved 37 ° C i inkubatoren indtil den er klar til at fortsætte til Percoll densitetscentrifugering (afsnit 4). Efterfølgende isolering af DC delmængder (afsnit 5) vil blive udført fra disse celler.

Bemærk: thymiske væv kan variere i deres sammensætning, især med alderen, hvilket påvirker fordøjelsen effektivitet og generering af en enkelt celle suspension.

  1. Til efterfølgende isolering af thymiske epitelceller (TEC) en tredje runde af enzymatisk fordøjelse er påkrævet. Resuspender vævsrester i 10 ml frisk Collagenase / DNase løsning plus 10 ml RPMI almindeligt og tilføje trypsin / EDTA (01:50 fra 2,5% bestand) i opløsningen.
  2. Der inkuberes ved 37 ° C i 40 min med forsigtig rotation. Under de sidste 10 - 15 min af inkubationen tilsættes FCS (1:5) for at neutralisere aktiviteten af ​​trypsin.
  3. Centrifuger ved 110 x g i 2 minutter ved stuetemperatur for at bundfælde de vævsfragmenter.

  1. Saml cellesupernatanten og kassér det sedimenterede væv fragmenter.
  2. Centrifuger cellesupernatanten ved 400 xg i 10 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i komplet RPMI.

Tip: Cellepellets er helt løs, så passe, når de skiller / sugning supernatant.

  1. Tæl levedygtige celler under anvendelse af et hæmocytometer. Placer celler i en 37 ° C inkubator indtil videre til percoll separation (afsnit 4). Efterfølgende præ-berigelse af TEC celler ved udtømning af CD45 hi celler vil blive udført fra disse celler (afsnit 6).

3.2 Mekanisk og enzymatisk væv behandling bistået af et væv dissociator

7,8.

  1. Overfør 5 g hakket vævsstykker (trin 2.5) til et C Rør, der indeholder 10 ml collagenase / DNase opløsningen.
  2. Adapt C rør på vævet dissociator og kør programmet m_spleen_02 (10 sek.) Gentag dette program 4-5x (40-50 sek).
  3. Inkuberes med forsigtig rotation i 20 minutter ved 37 ° C.
  4. Centrifuger ved 110 x g i 2 minutter ved stuetemperatur.
  5. Saml supernatanten og fortsæt som i trin 3.1.4. Tilsæt 10 ml frisk Collagenase / DNase løsning.
  6. Adapt C rør på vævet dissociator og kør programmet m_spleen_01 (56 sek.)
  7. Inkuberes ved 37 ° C i 20 minutter med forsigtig rotation.
  8. Centrifuger ved 110 x g i 2 minutter ved stuetemperatur.
  9. CollecT-celle-supernatant og pelletere cellesuspension i 10 minutter ved 400 x g. Fortsæt som i trin 3.1.4.
  10. Som beskrevet i 3.1.9 en tredje runde af fordøjelsen er nødvendig for den efterfølgende isolering af thymiske epitelceller (TEF). Til dette resuspender vævsrester i 10 ml frisk Collagenase / DNase opløsning plus Trypsin / EDTA (1:50 fortynding af lager 2,5%)
  11. Der inkuberes ved 37 ° C i yderligere 20 minutter med forsigtig rotation. Tilføj FCS (1:5) og inkuberes i yderligere 10 min.

Bemærk: Brug denne fremgangsmåde, efter denne sidste fordøjelse trin vævet er normalt fuldstændig dissocieret, og ingen ufordøjede vævsfragmenter overholdes.

  1. Fortsæt som i trin 3.1.11-3.1.14.

4.. Berigelse af LDF Celler Brug Percoll-density Adskillelse

Efter enzymatisk fordøjelse af væv, de samlede thymiske enkelte cellesuspensioner udsat for en enkelt Percoll density centrifugation skridt til berigelse for LDF celler. Den LDF af celler er stærkt beriget med APC. Både DC og TEC er påvist i denne fraktion af celler.

  1. Brug enkelt celle suspension fås fra 1. og 2. fordøjer for MDC isolation (pooled celler, se trin 3.1.8), eller 3. Digest (TEC isolation) (3.1.14). Centrifuge enkelt cellesuspension opnået fra hver fordøjelse trin ved 400 xg i 10 min.
  2. Forbered en Percoll-opløsning med en endelig densitet på 1,07 g / ml i løbet af dette vasketrin (se eksempel i nedenstående tabel).
    Fremstilling af Percoll opløsning til en endelig densitet på 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
    Rør nr. 1 2 3 4.
    Ufortyndet Percoll (ρ = 1.130) (ml) 2,96 5.92 8.88 11.84
    1,5 M NaCl (ml) 0.6 1.20 1.8 2.4
    destilleret H2O (ml) 2,44 4.88 7.32 9.76
    Volumen af ​​den endelige fortynding 6 ml 12 ml 18 ml 24 ml
  3. Antallet af Percoll rør afhænger af celleantal bestemt i trin 3.1.8 og / eller 3.1.14. Kombiner de sterile opløsninger og bland grundigt. For optimal isolering, kan 0,6-1 x 10 9 celler lastes pr tube Percoll. Kombiner de sterile opløsninger og bland grundigt.

Tip: Percoll er lysfølsomt og derudover bør holdes koldt. Forbered først blanding indeholdende NaCl og H2O (RT) og tilføje ufortyndet Percoll sidste lige før resuspendering af celler i Percoll-opløsning.

telt "> Bemærk:! Percoll massefylde kan variere mellem forskellige leverandører og batches Hvis tætheden af den ufortyndede Percoll løsningen er ikke lig med 1.130 g / ml, skal du følge instruktionerne, der leveres af producenten til at beregne den nøjagtige størrelse Percoll og H 2 O kræves for at få en endelig densitet på 1,07 g / ml.

  1. Resuspender op til 1 x 10 9 celler i 6 ml af den klargjorte Percoll opløsning (ρ = 1,07), blandes tilstrækkeligt til at få en homogen suspension, og overføres til en 50 ml Oak Ridge polycarbonat skruelåg centrifugerør.
  2. Forsigtigt lag 30 ml RPMI komplet pr rør med en pipette på toppen af ​​Percoll opløsning / celle suspension. Indlæs mediet langsomt, således at det forbliver på toppen af ​​suspensionen, og passe på ikke at forstyrre laget.
  3. Rørene afvejes for at sikre, at de har samme vægt, således at de er i balance under centrifugering. Hvis de ikke er, forsigtigt tilføje mere medium til den lettere rør (under sterile forhold).
  4. Overføre forsigtigt rørene til en præ-afkølet centrifuge med en rotor med fast vinkel og centrifugering ved 3.500 x g i 35 min ved 4 ° C med bremsen. Sørg for at temperaturen af ​​centrifugen i ikke højere end 4 ° C.
  5. Fjern rørene fra centrifugen og omhyggeligt indsamle beriget APC, findes på interfase mellem Percoll og medium (fraktion lav densitet) fra hvert rør ved hjælp af en steril Pasteur-pipette. Overfør celler i et 50 ml rør indeholdende kold RPMI komplet. Fyld røret for at fortynde den resterende Percoll.
  6. Centrifugér cellesuspension i 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Supernatanten kasseres, og gentag vask.
  7. Resuspender cellepelleten i medium og bestemme celleantallet (ved hjælp af trypanblåt og et hæmocytometer). Det er vores erfaring, den procentdel af LDF celler er omkring 2-20% af den totale enkelt celle suspension opnået efter enzym fordøjelse. En typisk yield af low-density berigede celler (fra en ung thymus, 1 dag-2 range år) 1x10 8 celler pr 1 x 10 9, svarende til en 10% af den samlede enkelt cellesuspension celler.

Bemærk: På dette tidspunkt, kan du observere, at celler aggregeret i suspensionen (især med prøver fra børn af ældre alder). Celleklumper er indikation af celledød og resultat fra frigivelsen af ​​DNA fra de døende celler, der kan holde cellerne sammen. I et sådant tilfælde tilsættes DNase I i prøven (50 ug / ml) og inkubere det til op til 20 minutter ved RT (vend forsigtigt hver 5 min) for at fordøje de frie DNA-molekyler.

5.. Isolering af tymisk MDC

Efter APC berigelse (via Percoll separation) kan MDC effektivt isoleret fra LDF efter den første og anden runde af enzymatiske fordøjelser. Følgende protokol er en modificeret version af magnetisk celleadskillelse til isolering af MDC (CD11c

  1. Centrifuge APC berigede celler isoleret fra enkelt cellesuspension opnået fra poolede første og anden enzymatisk fordøjelse ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C og resuspender cellepelleten i 100 pi MACS buffer per 10 7 celler.
  2. Der tilsættes 5 ul CD11-PE-antistof pr 10 7 celler.

Bemærk: titreringsforsøg anbefales til optimale resultater.

  1. Bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C, beskyttet mod lys.
  2. Vask cellerne ved at tilsætte 1-2 ml MACS buffer pr 10 7 celler og centrifuger ved 300 xg i 10 min.
  3. Aspirer supernatanten fuldstændigt og resuspender op til 10 7 celler i 80 pi MACS buffer.
  4. Tilsæt 20 ul anti-PE mikroperler pr 10 7 celler.
  5. Bland godt (Må ikke Vortex) og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C beskyttet mod lys.
  6. Gentag som i trin 5.4. Resuspender op til 10 8 celler i 500 pi buffer.
  7. Hvis det er nødvendigt, filter cellesuspension under anvendelse af en 40 um cellefilter at fjerne debris og celleaggregater, der kan spærre for strømmen af ​​søjlen.
  8. Brug en LS kolonne siden thymus cellesuspensioner flyde bedre ved LS kolonner. Forbered LS kolonnen efter producentens anvisninger. Pipetter cellesuspensionen langsomt ind i kolonnen undgå generere bobler. Brug en kolonne for hver 1 x 10 8 celler.
  9. Vask kolonnen efter producentens anvisninger. Fjern kolonnen fra magnet og placere den i et sterilt 12 ml rundbundet rør polypropylen. Tilsæt 3 ml MACS buffer på søjlen og indsamle magnetisk mærkede celler ved at indsætte og fast skubbe stemplet ind i kolonnen.
  10. Saml den eluerede fraktion repræsenterer CD11c + MDC og centrifuger ved 400 xg i 6 min.
  11. Bestem celle nummer og bekræft renhed af den valgte celle populatiden ved flowcytometrisk analyse. Foreslåede markører indbefatter CD45, CD11 og HLA-DR.

Bemærk: CD11c + MDC kan også isoleres under anvendelse af en FACS sorter.

6.. Berigelse af CD45 lo / neg Celler for Cell Sortering af TEC

Til isolering af TEC, celler kan præ-beriget ved udtømning af CD45 hi celler ved hjælp af CD45 mikrokugler, med henblik på at fremskynde deres isolation gennem celle sortering.

Brug enkelt celle suspension fås fra 3. fordøjelse trin (3.1.14) og efterfølgende adskilt af Percoll centrifugering.

  1. Centrifugeres cellesuspensionen ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C og resuspenderes cellepellet i 80 pi MACS buffer per 10 7 celler.
  2. Brug CD45 mikroperler på 1/3 af den anbefalede mængde (6,7 ul) pr 10 7 celler.

Bemærk: Ved hjælp af et lavere beløbaf mikroperler vi pre-berige celler til både CD45 lo og CD45 neg celler. Titrering anbefales til optimale resultater.

  1. Bland godt ved forsigtigt at knipse røret (Do Not Vortex) og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C.
  2. Vask ubundne mikrokugler ved tilsætning af 10 ml MACS buffer og centrifuger i 10 min ved 300 xg ved 4 ° C. Aspirer supernatanten fuldstændigt.
  3. Resuspender op til 10 8 celler i 500 pi buffer.
  4. Hvis det er nødvendigt, filter celle suspension ved hjælp af en 70 um cellefilter at fjerne snavs og celleaggregater, der kan spærre for strømmen af ​​kolonnen.
  5. Brug en LS kolonne siden thymus cellesuspensioner flyde bedre ved LS kolonner. Forbered LS kolonnen efter producentens anvisninger. Pipetter cellesuspensionen langsomt ind i kolonnen undgå generere bobler. Brug en kolonne for hver 10 8 celler.
  6. Saml umærkede celler (gennemstrømning og vasker) indeholdendeCD45 lo / neg cellefraktion og vaske kolonnen efter producentens anvisninger.
  7. Der centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C og resuspenderes cellepellet i steril FACS buffer for at bestemme celleantallet og fortsæt til farvning for cellesortering.

7.. Stain Celler til Fluorescence Activated Cell Sorting

  1. Udfør FcR blokerende før cellefarvning, for at reducere ikke-specifik antistofbinding. Inkuber cellesuspension med poolet humane immunoglobuliner opløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur. Disse reagenser er kommercielt tilgængelige (dvs. Gammunex 10% opløsning).
  2. Vask cellerne ved tilsætning af kold steril FACS puffer. Centrifuger ved 400 xg i 6 min ved 4 ° C.
  3. Supernatanten kasseres, og resuspender cellerne i koldt steril FACS puffer. Forbered 5 prøver i overensstemmelse med følgende eksempel:

    * SCC, enkelt farve kontrol

  4. Cellerne inkuberes med antistoffer i 30 minutter på is i mørke.
  5. Vask to gange med FAC-puffer ved centrifugering cellerne ved 400 x g i 6 min ved 4 ° C.
  6. Juster koncentrationen af prøvecellen skal sorteres til 1 x10 7 celler / ml (eller koncentrationen anbefalet af cellesortering facilitet) med sterile FACS buffer til cellesortering (dvs. uden NaN3).
  7. Pass celleprøve gennem en 70 um cellefilter at fjerne eventuelle celleklumper der kan tilstoppe cytometret under sorteringen.
  8. Resuspender kontrolprøver 200-400 pi buffer. Hold rørene på is og beskyttet mod lys.
  9. Forbered indsamling rør med medium.

    10. Bemærkninger:

    • Udfør titrering af antistofferne for optimal farvning.
    • I én prøve til sortering, kan op til 50 x 10 6 celler farves i et totalt reaktionsvolumen på500 pi.
    • Udføre farvning af prøven, der skal sorteres i 5 ml Falcon Polystyren rund bund rør. De ensfarvede kontrol kan farves i separate brønde i en 96-brønds plade.
    • Da TEC delmængder er sjældne populationer, er det tilrådeligt at bruge en anden positiv markør (af høj frekvens) for hver fluorchrom at lette fastsættelsen af ​​ordentlige FACS indstillinger og til at sikre, at du har en ordentlig kompensation, hvis valget af fluorokromer kræver erstatning. Celler fra CD45 +-fraktionen kan farves med markører, såsom CD45, CD3 eller CD8 for de forskellige fluorokromer og efter farvning ufarvede CD45 +-celler kan tilsættes til prøven.

    8.. Isolering af TEC ved fluorescensaktiveret cellesortering

    TEC delmængder kan sorteres fra CD45 lo / neg fraktion som EpCAM hi CDR2 - (MTEC) eller EpCAM lo CDR2 + (CTec).

    1. Kør prøven with er de ufarvede celler og justere frem-og sidespredning for at placere populationen af ​​interesse i skala. Justere spændingen på hver detektor, således at cellerne er synlige, men placeret i fjerneste venstre del af histogrammet.
    2. Kør hver enkelt farvede prøve og justere kompensation for hver farve.
    3. Efter justering af spænding og kompensation for de ufarvede og enkelt farvede knapper kører prøven, der skal sorteres og brug gating værktøjer til at definere populationen af ​​interesse. Brug en bred fremad og sidespredning gate til at sikre inddragelse af alle stromacellelinier størrelser, mens eksklusive celle debris.
    4. På dot plot med CD45-Pacific Blue versus Forward Scatter gate på CD45 lave og CD45 neg celler.
    5. Anvende denne port til en EpCAM versus CDR2 dot plot og bestemme ved slusning af befolkningerne skal sorteres.
    6. Når portene er fastlagt, skal du vælge portene indeholdende populationerne af interesse og begynde sortering.

    Bemærk: Under sortering med henblik på at forhindre celler i at klæbe til siderne af opsamlingsrøret røret kan præ-belagt ved at fylde den med 50% FCS i PBS og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Kassér coating-opløsning, før du tilføjer indsamling medier.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Som udgangsmateriale i denne protokol, vi bruger thymus væv fjernes fra børn, der gennemgår korrigerende kardiovaskulær kirurgi (Institut for thorax og kardiovaskulær kirurgi, Universitetsklinikken Tübingen) opnået efter informeret samtykke og under de institutionelle retningslinjer. Dette kasseret materiale kan variere meget i størrelse 2-30 g eller mere. Antallet af MDC og TEC delmængder (CTec og MTEC), der opnås, afhænger af størrelse samt en alder af thymus vævsprøve bruges til isolering.

    Figur 2 viser et temmelig stort stykke af væv (~ 9 cm) opnået fra en seks år gammelt barn. Et vigtigt første fremstillingstrin i denne protokol er rengøring af væv fra uønskede dele (angivet med hvide pile).

    Thymus væv blev behandlet som beskrevet i afsnit 2 og 3.1 i protokollen at opnå en enkelt celle suspension, der blev separeret ved hjælp af et enkelt Percoll densitetscentrifugering stoe Mens enkelt cellesuspension indeholder ca 3% af HLA-DR +-celler (figur 3A) efter Percoll centrifugering denne procentdel er forøget i fraktionen med lav massefylde (LDF), der indeholder store størrelse af celler, 15-40%, mens fraktion med høj densitet (HDF), som hovedsagelig af ensartede de små thymocytter består indeholder praktisk talt ingen sådanne celler (figur 3B). Fraktionen af ​​interesse (LDF), blev der indeholder beriget APC efterfølgende opsamles og vaskes for at samle celler til brug i efterfølgende isolation trin.

    Mens thymiske MDC kan identificeres ved ekspression af en række overflademarkører, herunder CD11c9, 10, pDC udtrykke markører såsom BDCA-2, BDCA-4, CD45RA og CD123 11,12. Efter berigelse af LDF celler begge celletyper udgør 2-10% af denne fraktion, så deres effektive isolering også i større tal, enten ved magnetisk celle separation eller flow sortering af CD11c + eller BDCA-4 +Celler 6.

    Figur 4 viser en effektiv isolering af CD11c + celler ved hjælp af den modificerede magnetisk celleseparering protokollen beskrevet i afsnit 5. Efter isolering, renheden af CD11c + DC var 93%, som er oprettet ved immunfarvning af isolerede celler. I gennemsnit inddrivelse af isolerede CD11c + DC er 5 x 10 5 -5 x 10 6 MDC per 10 9 af total tymisk celler. Tabel 1 viser data fra flere individuelle thymus prøver af forskellig alder og væv vægt med en række input single cellesuspensioner samt total LDF numre og den efterfølgende CD11c + udbytte og renhed.

    I APC fraktion kun ca 0,5% af cellerne er CD45 lo EpCAM + eller CD45 neg EpCAM +. CTec og MTEC kan sorteres fra trypsin-fordøjet CD45 lo / neg beriget stromaceller som EpCAM l o CDR2 + og EpCAM hi CDR2 - henholdsvis som vist i figur 5.

    Figur 1
    Figur 1. Et forenklet diagram af den cellulære organisation og sammensætning af den menneskelige thymus. Thymus består af thymocytter på forskellige modningsformer stadier, et heterogent mobilnetværk benævnt thymiske stroma danner thymus miljø. De vigtigste celletyper i thymus stroma er MDC og PDC epithelceller (opdelt i to hovedkategorier efter deres lokalisering i lobule: kortikale og medullære) og makrofager Forkortelser: DC, dendritiske celler MDC myeloide dendritiske celler;. PDC plasmacytoid dendritiske celler Mφ, makrofag, mono, monocytter, CTec, kortikale epitelceller, MTEC, medullære epitelceller.

    telt "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 2
    Figur 2. Første præparativ trin af væv til encellede forberedelse. Pile peger på de uønskede vævsdele, der skal kasseres forud for udførelsen af protokollen.

    Figur 3
    Figur 3. Oprensning af thymiske APC. FACS-analyse af forskellige stadier af rensning procedure. Enkelte cellesuspensioner af thymus væv blev opnået ved mekanisk forstyrrelse og serielle enzymatiske fordøjelse og APC beriget (LDF celler) ved separation Percoll-tæthed. Celler før (A) og efter (B) Percoll-density separation blev farvet med HLA-DR-PE-antistof til at kontrollere for APC berigelse. Procent vifte af HLA-DR + celler typisk observeret er indicat red.

    Figur 4
    Figur 4.. Isolering af CD11c + MDC. Thymus væv blev fordøjet ved hjælp Collagenase A / DNase I at oprette en enkelt celle suspension. CD11c + MDC udgør kun en mindre bestand af enkelt celle suspension (0,6%). Efter tilsætning af LDF celler via adskillelse Percoll-density procentdelen af CD11c +-celler stiger til ~ 9%. De LDF-celler blev mærket med CD11-PE-antistof og efterfølgende isoleret ved anvendelse af magnetiske perler (anti-PE). Reanalyse af CD11c + befolkning direkte efter magnetisk celle separation ved FACS angivet 93% renhed. Klik her for at se større figur .

    0951/50951fig5.jpg "/>
    Figur 5. Berigelse af CD45 lo / neg celler og efterfølgende sortering af TEC delmængder. A) Repræsentative dot plots viser procentdele af CD45 negative / lave thymiske stromaceller ialt enkelte cellesuspensioner før og efter Percoll density separation (9% og 16,2%, henholdsvis). B) De LDF celler blev udtømt for CD45 hi celler ved hjælp af magnetiske perler og TEC delmængder sorteret fra udtømte fraktion som EpCAM hi CDR2 - (MTEC) eller EpCAM lo CDR2 + (CTec).

    Prøve Prøvetype Antistof Cell Antal Samlet volumen
    1.. uplettet kontrol 1 x 10 6 50 pi
    2.scc *-Pacific Blue kontrol CD45-Pacific Blue 1 x 10 6 50 pi
    3. SCC-APC kontrol CD3-APC 1 x 10 6 50 pi
    4.scc-Alexa 488 kontrol CD8-Alexa 488 1 x 10 6 50 pi
    5.. Cellesortering analyt CD45-Pacific Blue
    EpCAM-APC
    CDR2-Alexa 488     		10 x 10 6 - 50 x 10 6 500 pi
    10 x 10 6 celler/100 pi
    CD11c + MDC frekvenser, celleudbytter og renhederne af forskellige donorer
    Donor Alder Vævsvægt Samlede celler per prøve LDF celler pr prøve CD11c+% CD11c + isoleret per prøve CD11c + renhed
    1 5 dage 7 g 1,45 x 10 9 9.5 x10 7 12.6 2,4 x 10 6 89%
    2 3 år 15 g 2 x 10 9 6.5 x10 7 4.3 1,9 x 10 6 81%
    3 21 dage 9 g 2,6 x 10 9 22 x10 7 10.3 3,6 x 10 6 93%
    4. 6 år 13 g 1,4 x 10 9 25,4 x10 7 4.2 5,7 x 10 6 82%
    5. 5 dage 6,5 g 1,3 x 10 9 16,2 x10 7 6 2,9 x 10 6 91%
    6 39 dage 3 g 0,6 x 10 9 8 x10 7 3.4 1,3 x 10 6 80%

    Tabel 1. Antallet af samlede encellede suspensionsceller udgivet efter to runder af fordøjelsen samt udbytter af LDF celler efter Percoll separation er vist for isolations udført i thymus prøver af seks personer af forskellig alder og væv vægt. Hyppigheden af MDC blev bestemt ved flowcytometri baseret på CD11-ekspression i samlede LDF celler (APC beriget). Udbytte og renhed af CD11c +-celler efter separationsteknologi med magnetiske perler er vist for hver enkelt donor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her er en ændring af den protokol, publiceret af Gotter et al 4. Kritiske trin i protokollen er den tilstand og indledende behandling af væv samt Percoll tæthed separation. Vi anbefaler stærkt at behandle vævet så hurtigt som muligt efter samling. Det er vigtigt at arbejde hurtigt, men grundigt, når rensning og skæring af vævet. Under thymocyt vask beskrevet i trin 2.3, er det afgørende at finde den rette balance, når de anvender tryk med bagsiden af ​​sprøjtestemplet på vævet stykker som for voldsom og langvarig pres kan beskadige stromacellerne. Lagdeling mediet oven på Percoll løsningen / celle suspension uden at forårsage forstyrrelser kan også kræve nogle praksis. Efter centrifugering er det vigtigt at indsamle alle de low density fraktion celler så hurtigt som muligt fra Percoll lag med et minimum af Percoll løsning.

Denoverordnede celleudbytter og relative APC numre kan være meget variabel (se tabel 1) og afhænger af donor (især med hensyn til alder), og de ​​forberedende færdigheder forsøgslederen. For en kort oversigt, kan cellesuspensioner farves med HLA-DR og / eller andre markører efter forskellige trin i protokollen som ønsket. Alle antistoffer, der anvendes til fænotypisk analyse bør titreres for at opnå optimale resultater.

På grund af den relativt lave forekomst af APC-typer i thymus i forhold til thymoctyes, kan større stykker thymus være nødvendig, hvis der ønskes højere antal isolerede celler.

Hvis et væv dissociator findes i laboratoriet, vil dette i betydelig grad fremskynde vævsbehandling, men begge varianter er beskrevet her virker lige godt. En relativt hyppigt problem kunne være sammenklumpning af cellerne, især i de trin mellem Percoll separation og MACS / FACS sortering. I dette tilfælde er en kort DNase I gravepågældende udstyr som beskrevet i protokollen, vil normalt løse problemet. Da thymus væv successivt erstattet af fedtvæv under ældning, thymi fra ældre donorer kan indeholde noget fedt, der vil svømme på toppen af ​​røret efter centrifugering af de enkelte cellesuspensioner opnået fra forskellige fordøjelse trin. I et sådant tilfælde bør fedt fjernes med en pipette, før du fortsætter protokollen. For at opnå optimale resultater samt økonomi grunde, vi rådgivning til at titrere ikke kun antistoffer, men også anti-PE mikrokugler (§ § 5 og 6). Til isolering af TEC fra muse thymus er alternative enzymblandinger blevet beskrevet at øge TEC udbytte 8,13, men vi har ikke testet dem med humant væv.

I princippet kan andre thymiske APC og stromaceller som B-celler og PDC også isoleres fra LDF celler (efter collagenase / DNase fordøjelse og Percoll) af FACS / MACS sortering hvis kendes de respektive markører. For eksempel, for PDC BDCA-2, BDCA-4 og CD123 er blevet beskrevet som markører 6,14. Hvis der ønskes analyse eller isolering af thymocyt delmængder, anbefaler vi at bruge de celler, der frigives ved at klemme (trin 2.3), da de er ganske rene og har gennemgået minimal manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikt deklareret.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for kirurgerne på Institut for thorax og kardiovaskulær kirurgi, Universitetsklinikken Tübingen for at give os de thymus prøver og Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Tyskland) varetagelse af CDR2 antistof. Vi vil også gerne takke Hans-Jörg Bühring og Sabrina Grimm fra sorteringsanlægget (University of Tübingen). Dette arbejde blev støttet af SFB 685 og Hertie Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640 PAA E15-842  
Dulbecco's PBS PAA H15-002  
Fetal Bovine Serum-Gold PAA A15-151  
Bovine Serum Albumin PAA K41-001  
Collagenase A Roche 10 103 586 001  
DNase I, grade II bovine pancreatic Roche 10 104 159 001  
Trypsin-EDTA 10x in PBS PAA L11-001 stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit Molecular Probes A-10235  
anti-human CDR2 (purified) Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue) Biolegend 304022  
anti-human EpCAM (APC) Miltenyi Biotec 130-091-254  
anti-human CD11c (PE) Miltenyi Biotec 130-092-411  
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801  
anti-CD45 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-801  
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401  
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml) GE Healthcare, Life Sciences 17-0891-01  
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) GIBCO 10977-035  
Gamunex 10% Tajecris-Biotherapeutics G120052 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter Millex GS SLGS033SS Syringe driven
Stericup filter unit Millipore SCGPU05RE Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes Nalgene 3118-0050 50 ml
50 ml PP conical tubes Becton Dickinson 352070  
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes Becton Dickinson 352058 FACS stainings
Cell strainer 70 μm Becton Dickinson 352350  
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) Becton Dickinson  
Sorvall Evolution R6 (rotor) Kendro  
Rotator REAX 2 Heidolph  
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093 235 tissue dissociator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
  2. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
  3. Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
  4. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
  5. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
  6. Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
  7. Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
  8. Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
  9. Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
  10. Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
  11. Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
  12. Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
  13. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
  14. Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).

Tags

Immunologi Immune system processer biologiske processer immunologi immunsystemet sygdomme immunsystemet Phenomena Life Sciences (General) immunologi menneskelige thymus isolation dendritiske celler MTEC CTec
Isolering af myeloide dendritiske celler og epitelceller fra human Thymus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stoeckle, C., Rota, I. A., Tolosa,… More

Stoeckle, C., Rota, I. A., Tolosa, E., Haller, C., Melms, A., Adamopoulou, E. Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus. J. Vis. Exp. (79), e50951, doi:10.3791/50951 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter