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Articolo metodologico

Una nuova procedura per valutare le proprietà di rinforzo di Tastants nei ratti di laboratorio: operante intraorale autosomministrazione

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DOI:

10.3791/50956

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6 febbraio 2014

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1Department of Psychology, University of Guelph

In questo articolo

Sommario

L'attuale studio valuta una nuova procedura per la valutazione degli effetti di rinforzo delle soluzioni appetibili in topi di laboratorio: intraorale auto-amministrazione. A tal fine, rispondendo operante (cioè leva pressione) per gli infusi endorali di soluzioni dolci a diverse concentrazioni è stata misurata sui rapporti continui e progressivi orari di rinforzo.

Abstract

Questo documento descrive un nuovo metodo per studiare le basi bio-comportamentale della dipendenza da cibo. Questo metodo combina la componente chirurgica del gusto reattività con gli aspetti comportamentali dei operante auto-somministrazione di farmaci. Sotto molto breve anestesia generale, i ratti sono impiantati con un intraorale (IO) cannula che consente l'erogazione di soluzioni di prova direttamente nella cavità orale. Gli animali vengono poi testati in operante camere di auto-amministrazione che consente loro di premere una leva per ricevere IO infusioni di soluzioni di test. IO auto-amministrazione ha diversi vantaggi rispetto procedure sperimentali che coinvolgono bere una soluzione da un beccuccio o operante rispondere per pellets o soluzioni consegnati in un contenitore solido. Qui, dimostriamo che IO auto-somministrazione può essere impiegato per studiare l'auto-somministrazione di sciroppo di mais ad alto fruttosio (HFCS). I ratti sono stati analizzati per l'auto-somministrazione su un rapporto di progressiva (PR) programma, che valuta la quantità massima di opcomportamento rante che sarà emesso per diverse concentrazioni di HFC (cioè 8%, 25% e 50%). A seguito di tale prova, ratti autogestiti queste concentrazioni su un programma continuo di rinforzo (cioè una infusione per ogni pressa a leva) per 10 giorni consecutivi (1 seduta / giorno, ciascuno della durata di 3 ore), e poi sono stati riesaminati in base alla pianificazione PR . In programma rinforzo continuo, ratti hanno un minor numero di infusioni di concentrazioni più elevate, anche se la più bassa concentrazione di HFC (8%) mantenuta autosomministrazione più variabile. Inoltre, i test PR rivelato che l'8% aveva valore più basso di rinforzo del 25% e 50%. Questi risultati indicano che IO auto-somministrazione può essere utilizzato per studiare acquisizione e manutenzione di rispondere per soluzioni dolci. La sensibilità della risposta operante per differenze di concentrazione e lo schema di rinforzo rende IO autosomministrazione una procedura ideale per studiare la neurobiologia dell'assunzione volontaria of dolci.

Introduzione

Lo studio della base neurobiologica e comportamentale della dipendenza da cibo si basa sulle osservazioni che, analogamente ai farmaci di abuso, consumo eccessivo di cibi gradevoli promuove dipendenza comportamentale 1-4 e induce alterazioni nei circuiti di ricompensa cerebrali sia nell'uomo 5-6 e laboratorio animali 7-8. Ma, mentre ci sono diversi protocolli e le procedure per lo studio delle proprietà di dipendenza di sostanze d'abuso nei ratti di laboratorio, adattamento di questi metodi per valutare i comportamenti di "dipendenza", indotte da alimenti presenta sfide uniche. L'obiettivo dello studio è stato quello di applicare i principi di operante per via endovenosa (IV) Farmaco auto-somministrazione alla ricerca di operante auto-somministrazione di soluzioni dolci consegnati da intraorale (IO) per infusione. Il dolce è stato impiegato lo sciroppo di mais ad alto fruttosio (HFCS), perché, anche se controverso, ci sono prove che HFCS può essere collegato alla moderna epidemia di obesità 9-12.

Tradizionalmente, infusi IO vengono consegnati a studiare l'appetibilità di tastants in gustative esperimenti reattività 13. In breve, una cannula IO viene impiantato chirurgicamente nella guancia di ratti e IO infusi di varie soluzioni sono passivamente consegnati 14. L'obiettivo è quello di studiare le reazioni oro-facciali degli animali ai tastants. Tuttavia, cannule IO sono anche stati impiantati cronicamente nel palato dei ratti per determinare se essi avrebbero imparato a premere una leva per soluzioni self-INFUSE direttamente nella loro cavità orale, da cui il termine IO auto-iniezione 15-17. In questo studio, descriviamo una procedura che utilizza la chirurgia minore e che permette test di auto-somministrazione operante lungo termine. Questa procedura ha diversi vantaggi significativi rispetto alle procedure tradizionali che coinvolgono bere una soluzione da un beccuccio (a), o operante rispondere per pellet solidi (b), o operante rispondere per gocce di fluido erogato in un recipiente(C).

In confronto ad (a), IO autosomministrazione comporta una risposta operante (cioè premendo una leva) e quindi è possibile modificare la pianificazione regolando il rapporto tra le esigenze di risposta e consegna di infusi IO. Ad esempio, utilizzando un rapporto di progressiva (PR) orari, per cui le risposte necessarie per infusioni successive aumentano in modo esponenziale all'interno di una sessione di 18, è possibile valutare quanto un animale "vuole" la successiva infusione 19. Questo importante aspetto del comportamento "cercare" non può essere valutato quando gli animali bevono una soluzione da un becco, a meno che un apparecchio speciale che controlla la consegna del fluido e monitora le risposte è impiegato 20. Inoltre, IO auto-amministrazione fornisce un mezzo per confrontare i comportamenti motivati ​​da differenti stimoli di rinforzo. Cioè, è possibile confrontare operante rispondere mantenuto da dolci e altri rinforzi come la droga d'abuso incosiddetti "studi di sostituzione."

In confronto a (b), IO autosomministrazione consente di testare qualsiasi concentrazione e qualsiasi volume di qualsiasi additivo alimentare idrosolubile. Questo è fondamentale per studiare il comportamento motivato da dolci come HFCS perché, al meglio delle nostre conoscenze, non ci sono pellets disponibili in commercio solidi di fruttosio, o combinazioni di fruttosio-glucosio in diversi rapporti, che sarebbe adatto per camere operante. Inoltre, l'importanza di controllare e manipolare rapporti di concentrazione / volume è obbligatorio in esperimenti in cui apporto può essere modulata sia dal valore calorico di una soluzione (che porta a sazietà specifici nutrienti) e dalla quantità di soluzione che può essere consumato in un dato periodo di tempo (cioè pienezza) 21. IO autosomministrazione riduce anche il ritardo tra la risposta operante e la consegna del rinforzo primario, un fattore che gioca un ruolo importante nella acquisizione e manutenzionezione del comportamento operante 16,22-23.

Infine, in confronto a (c), IO autosomministrazione consente l'erogazione di passivi infusioni IO di quantità controllate di soluzione campione, e questo rende possibile misurare le risposte orofacial di "gradimento" (reazione hedonic obiettivo quale sporgenze linguetta 24 -25) e se queste risposte cambiano durante IO auto-somministrazione. Inoltre, la capacità di gestire le infusioni IO passivi ha applicazioni importanti per lo studio della ricaduta al cibo-seeking. Cioè, negli studi di farmaco IV auto-amministrazione, a seguito di periodi di estinzione, primi farmaci (ad esempio la somministrazione di una piccola dose di farmaco 26) possono "reintegrare", rispondendo 27-28. Pertanto, la capacità di fornire infusioni IO senza alcuna azione da parte dell'animale può essere usato per studiare "food" innescato reintegrazione, nonché potenziale reintegrazione incrocio tra cibo esostanze d'abuso.

IO auto-somministrazione di soluzioni dolci è preferibile IV e intra-gastrico auto-somministrazione. Infatti, sebbene IV infusioni di fruttosio in esseri umani e animali da laboratorio producono conseguenze fisiologiche simili a quelli osservati a seguito del consumo per via orale 29-31, questo è un povero modello di come i dolci sono normalmente consumati (cioè per via orale). Inoltre, i segnali gustativi prodotti da masticazione conferiscono importanti informazioni sulla appetibilità del cibo, e quando questa fase del processo digestivo viene omesso, lo sviluppo di comportamenti disadattivi quali l'eccesso di cibo si riduce 32-33.

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Protocollo

1. Animal Care and Housing

Tutti gli esperimenti sono approvati dal Comitato Animal Care della University of Guelph, e siano eseguiti in conformità con le raccomandazioni del Consiglio canadese per la cura degli animali. Lo studio attuale comprende 22 maschi adulti Sprague-Dawley (Charles River, QC) peso di 200-225 g all'inizio dell'esperimento.

  1. Ratti Casa singola e mantenerle in un ciclo luce / buio retromarcia (07:00 OFF - 07:00 ON) con ad libitum accesso al cibo e all'acqua salvo quando diversamente indicato, o durante la prova comportamentale che si verifica durante il ciclo attivo.
  2. Abituare ratti alla camera colonia e manipolazione umana pesando giorno per una settimana prima dell'intervento.

2. Intraorale Cannulazione Chirurgia: materiali e procedimenti

Il intraorale (IO), chirurgia e materiali sono descritti in Limebeer et al 14.

  1. Per costruzionet cannula IO, tagliare un pezzo di tubo di plastica polietilene a circa 130 mm di lunghezza (diametro interno di 0,86 mm e diametro esterno 1,27 mm).
  2. Il tubo da fissare nella cavità orale richiede una estremità flangiata (~ 5 mm di diametro). Creare questo flangiata riscaldando la fine del tubo con un saldatore per 2-5 secondi e poi prontamente appiattire il bordo riscaldata del tubo contro una superficie piana. Tagliare un disco maglia chirurgica (circa 6-7 mm di diametro per adattarsi intorno al diametro della estremità flangiata della cannula) e avvitare sulla lunghezza del tubo fino a quando il disco poggia contro la parte posteriore della estremità flangiata della cannula IO.
  3. Per ciascuna cannula IO, tagliare un ulteriore disco chirurgica maglia (8 mm di diametro) e tre piazze di una fascia elastica (6 mm x 6 mm; vedere la Figura 1).
  4. Sterilizzare la cannula IO, dischi maglia chirurgica e piazze elastici in una soluzione antibatterica per almeno 24 ore prima dell'intervento.
  5. Prima dell'intervento, unutoclave tutti gli strumenti chirurgici e la disinfezione del campo operatorio. Tra ambulatori, utilizzare uno sterilizzatore perle di vetro per sterilizzare gli strumenti, e indossare una retina per capelli, guanti di nitrile, e mascherine chirurgiche per mantenere condizioni asettiche.

Analgesia e anestesia

  1. Circa 30 minuti prima dell'intervento amministrare un sottocutanea (SC) iniezione del Depocillin antibiotico (0,33 mg / kg) e l'analgesico meloxicam (5 mg / kg SC).
  2. Indurre anestesia generale con isoflurano (4% induzione e 3% di manutenzione).
  3. Una volta che i ratti non rispondono alla pizzico punta, e prima di effettuare qualsiasi incisioni, usa una punta di cotone tampone per amministrare un anestetico locale lungo la guancia sinistra interna dei ratti in cui la cannula deve essere impiantato, e iniettare un anestetico locale come la lidocaina HCl a il sito di incisione per l'agobiopsia (base del collo) e cappuccio della testa (cuoio capelluto).
  4. Applicare lubrificante lubrificato per entrambi gli occhi prima dell'inizio di picchiry.

Le procedure chirurgiche

  1. Radere un x 10 mm pezza 10 mm capelli alla base del collo. Utilizzare garze sterili per tamponare e pulire la zona rasata nel seguente ordine: sapone antibatterico, isopropilico al 70% di alcol, e Betadine.
  2. Inserire un ago G 15 acciaio inox alla base del collo e spostarlo sottocutanea intorno all'orecchio alla guancia sinistra. Posizionare la punta e farla passare attraverso la guancia dietro il primo molare all'interno della cavità orale.
  3. Passare la cannula IO attraverso la punta dell'ago sporgente dalla cavità orale e quindi rimuovere l'ago lasciando solo la cannula IO.
  4. Infilare un disco maglia chirurgica seguita da tre dischi elastici quadrati sulla porzione esterna della cannula IO e li elabora per la pelle esposta alla parte posteriore del collo per stabilizzarlo.
  5. Lavare la cannula IO con un risciacquo orale antibatterico
  6. Prima dell'inizio della chirurgia, modificare bullone Nylon(28 mm di lunghezza; punto 4 mm, 8 mm Testa) per rimuovere la testa e scolpire Scanalatura 2 mm lungo la lunghezza della filettatura (vedere la Figura 2).
  7. Shave una x 20 mm striscia di 10 millimetri di capelli lungo la linea mediana della testa. Utilizzare garze sterili per tamponare e pulire la zona rasata nel seguente ordine: sapone antibatterico, isopropilico al 70% di alcol, e Betadine.
  8. Utilizzare un bisturi chirurgico per praticare un'incisione di lunghezza 20 mm lungo la sutura sagittale. Utilizzare un trapano a mano per fare 4 fori (2 su ciascun lato della sutura) e utilizzare un cacciavite tenuto in mano per fissare gioiellerie quattro viti al cranio.
  9. Posizionare la vite al centro dei quattro gioiellerie viti con la scanalatura posizionata verso la parte posteriore dell'animale. Montare il bullone al cranio del ratto costruendo un headcap con cemento dentale (utilizzare cemento dentale sufficiente a coprire la superficie delle viti gioiellerie). Lasciare che il cemento dentale asciugare prima di rimuovere l'animale dal campo operatorio e terminare anestesia.
il monitoraggio e l'assistenza post-operatoria "jove_content"

  1. Individualmente ratti casa in gabbie letti subito dopo l'intervento chirurgico e monitorare attentamente per 24 ore.
  2. Somministrare una seconda dose di analgesico Meloxicam 24 ore post-intervento chirurgico e lavare la cannula IO con un risciacquo orale antibatterico / die per tre giorni.

Dare ratti 3-5 giorni per recuperare da un intervento chirurgico prima dell'inizio dell'esperimento.

3. IO procedure di auto-amministrazione

Apparato

Per l'auto-somministrazione, vengono utilizzati in plexiglass condizionamento operante camere e ogni camera è racchiuso in una scatola di compensato di attenuazione del suono più grandi. Ogni camera di condizionamento operante ha una luce casa (28 V) e due leve retrattili (attivi e inattivi) situato su lati opposti della stanza, 8 cm dal pavimento. La leva attiva è collegata ad una pompa di infusione outs posizionateide la camera di isolamento del suono e una luce bianca (28 W) si trova a 3 cm sopra a servire come una luce stimolo accoppiato con la consegna delle infusioni IO. La leva inattiva serve a controllare per la linea di base, il comportamento operante nonreinforced, premendo questa leva non ha alcuna conseguenza, ma tutte le macchine vengono registrate.

Cibo

  1. Fornire ratti con un chow ratto standard (3,1 kcal / g) nella loro gabbia casa.
  2. Diluire lo sciroppo di mais ad alto fruttosio (55% formula) per tre diverse concentrazioni (8% = 0.026 kcal/80 ml di infusione; 25% = 0,08 kcal/80 infusione ml; 50% = 0,17 kcal/80 ml di infusione) utilizzando acqua ad osmosi inversa. Queste concentrazioni sono selezionati perché ogni produce una viscosità che è opportuno fornire rapide infusioni (2,5 sec) IO dato l'apparato sperimentale (cioè diametro di siringhe e tubi).

Privazione di cibo

Al fine di agevolare l'acquisizione diIO auto-amministrazione, ma promuovere la crescita normale, i ratti si susseguono periodi di privazione di cibo e l'accesso ad libitum a chow ratto standard.

  1. Pesare ratti giornaliero a 7 pm e rimuovere Chow dalla mangiatoia dalla gabbia.
  2. Il giorno seguente, pesare ratti alle 12:00 (circa 18 ore più tardi) e iniziare IO autosomministrazione da 01:00.
  3. Ratti tornare alle loro gabbie a casa alle 16:00 e fornire accesso ad libitum a chow per 3 ore consecutive. Successivamente, registrare il peso dei ratti e la quantità totale di Chow consumata nei tre ore. Riprendere la privazione di cibo come descritto.

Procedura di auto-somministrazione generale IO

Operante rispondere per IO infusioni di HFCS viene valutata su PR e gli orari continue di rinforzo. I ratti sono testati in IO autosomministrazione finché assunzione è stabile come definito da: 1) una significativa differenza nella risposta tra attivo e INACtiva leve per almeno 2 sedute consecutive, e 2) la variazione inferiore al 20% nel numero di infusioni guadagnati per ogni sessione per due sessioni consecutive. Ogni sessione inizia 6 ore nel ciclo buio e dura 3 ore. La fase di acquisizione è costituito da 10 consecutivi sessioni di auto-somministrazione IO su una somministrazione continua di rinforzo, e ratti ricevono un singolo PR prova 24 ore prima dell'inizio di acquisizione (test PR I) e 24 ore dopo la sessione di acquisizione finale (PR test II). Per le prove PR, il punto di interruzione (BP) è definita come l'ultima infusione ricevute prima cessazione di rispondere sulla leva attiva per almeno 1 ora 18.

  1. Ratti elev sulla base dei pesi adottate per tre giorni prima dell'inizio dell'esperimento e assegnare ratti ad auto-somministrarsi una delle tre concentrazioni di HFC: 8%, 25% o 50%.
  2. Pesare ratti alle 12:00 e trasferirli dalla camera colonia sala prove nelle loro gabbie a casa. Per rimuovere il cibo o Bedding che può accumularsi nella cannula IO, pompare aria attraverso la cannula utilizzando una siringa 12 ml fisso con un ago 16 G con 50 mm di tubo di polietilene (diametro interno di 1,14 mm e diametro esterno pari a 1,57 mm) fissati all'estremità.
  3. Nella camera operante, collegare la cannula IO per tubi Tygon (diametro interno di 0,02 mm e diametro esterno di 1,53 mm) da un albero costruito di un modificato ago da 20 G (rimuovere il mozzo in plastica e punta smussata). Posizionare la parte inferiore del tubo (cioè più vicino all'animale) nel bosco del bullone. La porzione superiore del tubo è collegato a una parte girevole, e protetto da una molla. Collegare la base della molla sulla filettatura del bullone montato sulla testa del ratto.
  4. Dare ratti cinque minuti di raggiungere la camera di operante e quindi avviare la sessione di autosomministrazione IO. La sessione di autosomministrazione IO inizia con l'attivazione della casa luce, l'iscrizione delle due leve a scomparsa, e l'illuminazione dellastimolo luminoso sopra la leva attiva per 30 sec.
  5. Per PR Test Io, utilizzare il programma PR descritto da Richardson e Roberts18 (rapporto di risposta escalation = (5 e (numero di iniezione x 0,2)) - 5).
  6. Per le sessioni di acquisizione 1-10, utilizzare un programma continuo di rinforzo in cui ogni stampa sui risultati leva attivi nella consegna di un infuso di 80 ml di soluzione di prova oltre 2,5 sec.
  7. Per consentire un tempo sufficiente per ingestione, imporre un periodo di time-out del 27,5 sec, durante il quale la leva attiva è retratto e la luce stimolo viene attivato (cioè ratti possono ottenere un infuso IO ogni 30 sec). Non imporre un limite al numero di infusioni ottenibili all'interno di ogni sessione di auto-somministrazione IO.
  8. Se il ratto non ha una risposta sulla leva attiva per 20 minuti consecutivi, primo ratto (aprire la camera operante e facilitare il topo premendo una volta sulla leva attiva). Prime gli animali ogni 20 min fino a 5x/session dusuonare i primi tre giorni di sola acquisizione.
  9. Amministrare la seconda prova PR utilizzando i parametri descritti nel passaggio 3.10.
  10. Dopo le sessioni di auto-amministrazione IO, rimuovere i ratti dalle camere operante, lavare la cannula IO con 2,0 ml di acqua utilizzando gli stessi materiali descritti in 3.7, e ritorno ratti alla loro gabbia a casa nella stanza colonia.
  11. Dopo tre ore di ad libitum accesso al ratto chow, ratti peso alle 7:00 pm, togliere il cibo dalla mangiatoia, e riprendere la privazione di cibo.

I dati di auto-amministrazione vengono analizzati utilizzando due fattori ripetute misure di analisi della varianza (ANOVA). Confronti multipli utilizzando il metodo Student-Newman-Keuls (α = 0,05) sono stati impiegati per esplorare eventuali interazioni significative o effetti principali.

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Risultati

Acquisizione di IO auto-somministrazione

Figura 3 rappresenta operante rispondere sulle leve attive e inattive durante l'auto-somministrazione di 8%, 25%, o al 50% HFCS per 10 sedute consecutive. Ratti acquisiscono IO auto-somministrazione di HFCS entro i primi tre sessioni e mantenere attiva la leva stabile di rispondere (come descritto sopra) per il resto di acquisizione. Differenze di concentrazione-dipendente nelle risposte leva attivi sono anche evidenti: risp...

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Discussione

Lo studio illustra un nuovo approccio per la valutazione delle proprietà rinforzanti delle soluzioni dolci, combinando i metodi tradizionalmente utilizzati per studiare il comportamento motivato da sostanze d'abuso (per via endovenosa operante auto-amministrazione) e per valutare l'appetibilità di tastants (gusto reattività attraverso infusioni endorali). A tal fine, sotto molto breve anestesia isoflurano indotta, i ratti sono impiantati con una cannula IO che consente la consegna delle soluzioni di prova dirett...

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Dichiarazioni

Gli autori hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questi studi sono stati supportati da sovvenzioni dal Consiglio scienze naturali e ingegneria Research of Canada (NSERC) a FL e una Graduate Scholarship canadese (CGSD) da NSERC a AM.L.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents
MeloxicamBoehringer Ingelheim Canada Ltd.Dalla farmacia dell'Ontario Veterinary College
Procaina Penicillina GPen acquosa, Wyeth Animal HealthDalla farmacia dell'Ontario Veterinary College
Lidocaina HCl 2%Dalla farmacia dell'Ontario Veterinary College
Marcaine 0,5Dalla farmacia dell'Ontario Veterinary College
Unguentolubrificante per gli occhiIl prodotto può essere acquistato in qualsiasi farmacia
2% Lidocaina Viscosa Orale (Anestetico Topico)Pharmascience Inc.CDMV # 14705Flacone da 100 ml
Isoflurano USPPharmaceutical Partners of CanadaCDMV # 108737Flacone da 250 ml
Bacti-StatMerck Sante AnimaleCDMV # 6449Flacone da 3.785 L
Alcool isopropilico (70%)Perdu PharmaFisher # MPX18404Flacone da 4 L
Betadine 10%McKesson CanadaCDMV # 104826flacone
da 500 mlSuper GermipheneCeva Animal HealthCDMV # 103629Flacone da 454 ml
Clorexidene (Novadent)ZoetisCDMV # 8908Flacone da 236 ml
Sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosioNatures FlavoursHFCS-55Flacone
Materials
PE90 tuboBecton Dickinson and CompanyVWR # CA-63019-080A100 piedi/bobina
Tubi PE160Becton Dickinson and CompanyVWR # CA-63018-747100 piedi/bobina
Rete in polipropilenePiccole parti Inc.CMP-0297-D
SaldatoreIl prodotto può essere acquistato in qualsiasi negozio di ferramenta
# 64 ElasticiGraffe Forniture per ufficioArticolo # 13556Il prodotto può essere acquistato in qualsiasi negozio di forniture per ufficio
15 G Aghi a parete sottile da 3,5 pollici VWR# CABD110812 aghi/confezione
Rasoio elettrico (lama larga 1/2 pollice)Il prodotto può essere acquistato presso qualsiasi animale domestico negozio di forniture
Aghi di scorrimento di precisione Aghi da 20 G (1½ pollici)Becton Dickinson and CompanyFisher # 14-826D
Aghi di scorrimento di precisione Aghi da 16 G (1½ pollici)Becton Dickinson and CompanyFisher # 14-826-5D
Camere di condizionamento operantiMed Associates Inc.ENV-008-CTC
Camera di attenuazione del suonoMed Associates Inc.ENV-018M
MED PC IV softwareMed Associates Inc.SOF-735
Pompe a siringaRazel Scientific Instruments
Gruppo girevole monouso in plasticaMed Associates Inc.PHM-115I
Tygone Tubi MicroboreSaint Gobain Performance PlasticsFisher # 1417015B500 piedi/bobina
% da 1 gallone

Riferimenti

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