Summary
وقد تم تطوير فحص للكشف عن QPCR كولاي O157: H7 استهداف علامة جينية فريدة، Z3276. تم الجمع بين QPCR مع propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) العلاج للكشف عن الخلية الحية. تم تعديل هذا البروتوكول وتتكيف مع شكل لوحة 96 جيدا لسهولة ومتسقة التعامل مع عينات عديدة
Abstract
فريد إطار القراءة المفتوح تم تحديد (ORF) Z3276 كعلامة وراثية محددة لE. O157 كولاي: H7. وقد تم تطوير فحص للكشف عن QPCR E. كولاي O157: H7 من خلال استهداف ORF Z3276. مع هذا الاختبار، ونحن يمكن الكشف منخفضة تصل إلى بضع نسخ من جينوم الحمض النووي من E. O157 كولاي: H7. وتأكدت حساسية وخصوصية الفحص عن طريق اختبارات التحقق من صحة مكثفة مع عدد كبير من E. كولاي O157: H7 سلالات (ن = 369) وسلالات غير O157 (ن = 112). وعلاوة على ذلك، ونحن تضافرت propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) الإجراء مع بروتوكول QPCR وضعت حديثا للكشف الانتقائي للخلايا الحية من الخلايا الميتة. التضخيم من الحمض النووي من الخلايا الميتة سلطة النقد الفلسطينية المعاملة كانت تحول دون بالكامل تقريبا على النقيض من التضخيم تتأثر تقريبا من الحمض النووي من الخلايا الحية سلطة النقد الفلسطينية المعاملة. بالإضافة إلى ذلك، تم تعديل البروتوكول وتتكيف مع شكل لوحة 96 جيدا لسهولة التعامل ويتفق عدد كبير من العينات. Tومن المتوقع أن يكون لها تأثير على الميكروبيولوجية دقيقة والرصد الوبائي لسلامة الأغذية ومصدر بيئي طريقته.
Introduction
PCR هي تقنية شائعة للكشف عن E. كولاي O157: H7 من العينات الغذائية والبيئية. تحديد المؤشرات الحيوية محددة لE. كولاي O157: H7 هي واحدة من العوامل الرئيسية لنجاحها في الكشف عن المقايسات PCR. المؤشرات الحيوية التي تستخدم عادة في المقايسات PCR للكشف عن E. كولاي O157: H7 تشمل السموم شيغا (STX 1 و 2 STX) 1،2، 3،4 uidA، eaeA 5،6، rfbE 7، وفليك الجينات 8،9. ويمكن لهذه المؤشرات الحيوية توفير الكفاءة لتحديد متغير، ومع ذلك، فإن معظم المؤشرات الحيوية لا يمكن أن تستخدم العلامات البيولوجية فريدة من نوعها للكشف عن E. O157 كولاي: H7. هذا القصور في السلطة التفريق بين الجينات المستهدفة يدعو العلامات البيولوجية أكثر تحديدا وأقوى (ق) لتحديد E. O157 كولاي: H7 10.
تحقيقات عديدة للجينات أو إطارات القراءة المفتوحة افتراضية (ORFS) في E. القولونيةO157: H7 تم تصميمها ل11 QPCR مقايسة على أساس القرائن من ميكروأرس التنميط الجيني DNA من مختبرنا وخلال البحث في قاعدة بيانات بنك الجينات من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية. وقد تم اختيار تسلسل Z3276 ORF، وهو الجين خملي 11، لQPCR الفحص. بعد ذلك، تم تطوير فحص QPCR من خلال العديد من التجارب على المعلمات PCR مثل تركيزات الاشعال وتحقيقات، فضلا عن الصلب والإرشاد درجات الحرارة (لا تظهر البيانات). بعد الشمولية والتفرد حافز اختبارات على السلالات المرجعية مثل E. كولاي O157: H7، غير O157 والشيجلا سلالات في QPCR، تم التعرف على ORF Z3276 كعلامة وراثية محددة وقوية لتحديد E. O157 كولاي: H7. ثم نطور طريقة جديدة باستخدام QPCR هذه العلامات البيولوجية فريدة لتحديد E. O157 كولاي: H7.
تحد آخر في الكشف عن E. كولاي O157: H7 في الملوثة FOالمواد المستنفدة للأوزون والبيئة هو تحديد دقيق للخلايا الحية من العينات. وجود مدد من الحمض النووي من الخلايا الميتة وعدم القدرة على التفريق الجدوى في فحص PCR يمكن أن يسبب قراءات إيجابية كاذبة، مما أدى إلى المبالغة في تقدير أعداد الخلايا الحية في الكشف. بالتالي، وهذا يحد من استخدام PCR في الكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية دقيقة 12. وقد اتخذت نهجا جديدا للتمييز الحمض النووي من الخلايا الميتة من خلال الجمع بين propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) العلاج مع إجراء PCR في السنوات القليلة الماضية 13-15. سلطة النقد الفلسطينية قادرة على الذهاب إلى الداخل من الخلايا الميتة، ويقحم في الحمض النووي عند تعرضها للضوء، ولكن لا يمكن أن تذهب داخل الخلايا الحية لتتفاعل مع الحمض النووي للخلايا الحية. وهكذا، في خليط من سلطة النقد الفلسطينية المعاملة من الخلايا الحية والميتة، والحمض النووي من خلايا ميتة لا يمكن تضخيم PCR في 13. نحن الجمع بين العلاج مع سلطة النقد الفلسطينية QPCR مقايسة وضعت حديثا للكشف عن انتقائي الحية E. كولاي O157: H7 الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، حققنا سلطة النقد الفلسطينية، وQPCRssay ممكن للكشف عن إنتاجية عالية.
Protocol
1. البكتيرية سلالات الحمض النووي وإعداد قالب
- تنمو سلالات البكتيرية E. كولاي O157: H7، غير O157، والأنواع المسببة للأمراض الأخرى، مثل السالمونيلا والشيجلا، عند 37 درجة مئوية خلال الليل مع اهتزاز.
- استخراج الحمض النووي من الثقافات البكتيرية باستخدام عدة المناسبة (انظر الجدول المواد)، وبعد تعليمات الشركة الصانعة.
- قياس الكثافة الضوئية (OD 260) لتحديد تركيز الحمض النووي باستخدام معمل.
2. التمهيدي والتصميم التحقيق لفحص QPCR
- كولاي O157: H7 هي متواليات من بنك الجينات عدد AE00517411 الانضمام. الاشعال تصميم والتحقيق استخدام البرمجيات المناسبة لتصميم التمهيدي والتحقيق في الوقت الحقيقي PCR (انظر الجدول مواد للتفاصيل).
تسلسل الاشعال والتحقيق هي كما يلي: Z3276 إلى الأمام (F) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 '
Z3276-عكسي (R) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 '
Z3276 دقق، FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - إعادة تشكيل مسحوق التمهيدي مع الماء، مما أدى إلى تركيز من 10 ميكرومتر كحل العمل التمهيدي.
- تمييع التحقيقات إلى 10 ميكرومتر كحلول عمل التحقيق. تحقيقات المسمى تختلف في قوتها مع دفعات. وبالتالي، يعاير كل دفعة من تحقيقات وصفت قبل استخدام لأفضل أداء QPCR.
3. وضع شروط الفحص QPCR
- إعداد خليط التفاعل، الذي يتكون من 25.0 ميكرولتر من 2X في الوقت الحقيقي PCR مزيج الرئيسي، و 200 نيوتن متر من التمهيدي إلى الأمام، و 200 نيوتن متر من التمهيدي العكسي، و 100 نيوتن متر من التحقيق.
- إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي العينة (100 خريج) وحجم مناسب من الماء للوصول إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
- من أجل السيطرة nontemplate، استخدم 5 ميكرولتر من المياه ليحل محل عينة من الحمض النووي.
- تهيئة الظروف QPCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتفعيل TaqMan، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية لتمسخ و 60 و# 176؛ مئوية لمدة 1 دقيقة للالصلب / التمديد.
4. QPCR حساسية اختبار
- جعل المسلسل التخفيف 10 أضعاف من ثقافة مرحلة منتصف الأسي (OD 600 = 0.5؛ حوالي 1.5 × 10 8 كفو / مل بواسطة الطلاء).
- إضافة 100 مل من التخفيفات الخلية على طبق من ذهب 96 جيدا في ثلاث نسخ.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 50 مل من محلول استخراج الحمض النووي إلى كل بئر.
- الكريات الخلايا في resuspend مع ماصة متعدد القنوات.
- ختم لوحة مع فيلم، وتغلي لوحة في حمام مائي لمدة 10 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 2 دقيقة.
5. إعداد الحية والميتة خلطات الخليوي لسلطة النقد الفلسطينية العلاج
- تنمو 10 مل من E. كولاي O157: H7 في 37 درجة مئوية إلى منتصف المرحلة الأسي وتقسيم الثقافة إلى قسمين مأخوذة.
- تغلي قسامة واحدة من خلايا لمدة 10 دقيقة في حمام مائي لالخلايا الميتة وترك قسامة الأخرى للخلايا الحية.
- التحقق منإعادة توجد الخلايا الحية من قسامة قتلت الحرارة عن طريق طلاء الخلايا على لوحات أجار LB.
- تأخذ 2 مل من الخلايا الحية وقتلت الحرارة وضبط تركيز على 8 × 10 6 كفو / مل مع LB المتوسطة. إنشاء أربع مجموعات من التخفيفات الخلية تتراوح بين 8 × 10 0-8 × 10 6 كفو / مل.
- استخدام أول مجموعتين من التخفيفات الخلية للخلايا الحية تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية أو غير المعالجة.
- إلى مجموعات الثالثة والرابعة من التخفيفات الخلية، إضافة 8 × 10 6 الخلايا الميتة إلى كل خلية التخفيف (8 × 10 0-8 × 10 6) لجعل مخاليط الخلية الحية والميتة.
- علاج مجموعة ثالثة من التخفيف مع سلطة النقد الفلسطينية واستخدام المجموعة الرابعة من التخفيف من أجل السيطرة.
6. علاج الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية
- حل سلطة النقد الفلسطينية في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (أو الماء) لجعل محلول المخزون 10 ملي وتخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام.
- قسامة 400 ميكرولتر من الخلايا الحية والخلايا الميتة، وخليط من الخلايا الحية والميتة فيثلاثة microtubes منفصلة.
- إضافة 2.0 مل من 10 ملي سلطة النقد الفلسطينية إلى كل قسامة خلية إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر.
- احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام، والهز بلطف عدة مرات، 3 ثانية في كل مرة.
- إضافة 100 ميكرولتر من العينات على لوحة 96 جيدا.
- ختم لوحة مع فيلم البصرية ووضع لوحة على الجليد.
- ضبط لوحة 20 سم من W الهالوجين مصدر الضوء وفضح 650 لمدة 2 دقيقة لالتعرض للضوء.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل بلطف طاف واستنزاف لوحة على قطعة من الورق استيعاب بعناية.
- كريات الخلية resuspend في 50 ميكرولتر من الحل استخراج الحمض النووي من قبل pipetting صعودا وهبوطا عشرين مرة مع متعدد القنوات Pipetman.
- ختم لوحة مع فيلم، وتغلي لمدة 10 دقيقة في حمام مائي، وأجهزة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 2 دقيقة. طاف في لوحة هو الحمض النووي من خلايا تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وعلى استعداد للQPCR.
- أداء QPCR كما descriالفراش أعلاه، وذلك باستخدام 5 ميكرولتر من الحمض النووي.
Representative Results
الكشف عن E. كولاي O157: H7 من قبل QPCR باستخدام ORF Z3276
واحدة من العوامل الرئيسية لهذا الاختبار هو حساسية وخصوصية التحقيق Z3276 المستخدمة في QPCR. فإنه يمكن الكشف منخفضة تصل إلى عدد قليل من النسخ من جينوم الحمض النووي من E. كولاي O157: H7 كما هو مبين في الشكل 1A. من 120 سلالة O157 غير المدروسة، بما في ذلك السلالات الست الكبرى غير O157 STEC، O104: H4 سلالات، السالمونيلا، والسلالات الشغيلة، وجد عدم تفاعل الصليب، كما هو مبين في الجدول رقم 1.
مزيج من العلاج مع سلطة النقد الفلسطينية QPCR
التفقيس E. كولاي O157: تم اختيار الخلايا H7 مع سلطة النقد الفلسطينية (50 ملم) لمدة 5 دقائق في الظلام وتعريض للضوء لمدة 2 دقيقة للظروف العلاج سلطة النقد الفلسطينية. بالإضافة إلى ذلك، فإننا تعديل الإجراء العلاج سلطة النقد الفلسطينية. مقارنة مع مختلف microtubes شفافة تستخدم في خطوة عبر ربط، تم العثور على لوحة 96 جيدا لتكون أكثر كفاءة لوصول إلى الأمثل تأثير ربط عبر وأكثر ملاءمة من التعامل مع عدد كبير من أنابيب العينات خلال عملية التعرض للضوء.
التضخيم من الحمض النووي من سلطة النقد الفلسطينية معاملة الخلايا الحية والميتة في QPCR
عرضت آثار تثبيط سلطة النقد الفلسطينية بوساطة من التضخيم من الحمض النووي من الخلايا الميتة على هذا الاختبار QPCR في الشكل 1 باستخدام الحمض النووي المستمدة من اثنين المسلسل 10 أضعاف التخفيفات خلية حية أو ميتة. بينت النتائج أن منحنيات المتولدة من الخلايا الحية تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية (المنحنى الأحمر) ودون سلطة النقد الفلسطينية (المنحنى الأزرق) يبدو الخطية ومتطابقة تقريبا مع بعضها البعض. عرضت الاختلافات قيمة CT طفيف بين الخلايا الحية تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية دون (الشكل 1A)، مما يشير إلى أن العلاج سلطة النقد الفلسطينية لم يكن لها أثر يذكر على التضخيم من الحمض النووي من الخلايا الحية في QPCR. ولكن 15 - الفرق قيمة CT (32،000 أضعاف) وقد تبين بين الخلايا الميتة تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية دون التجريبيnstrating أن العلاج سلطة النقد الفلسطينية قمعت بكفاءة تضخيم الحمض النووي من الخلايا الميتة (الشكل 1B).
الكشف عن الخلايا الحية من خليط من الخلايا الحية والميتة في QPCR
وعولج مع سلطة النقد الفلسطينية أو بدون سلطة النقد الفلسطينية للكشف عن الخلايا الحية من العيش / مخاليط خلية ميتة - مجموعتين من التخفيفات الخلية الحية (8 × 10 6 × 10 8 كفو 0). أظهرت نتائج QPCR (الشكل 2A) اتجاه التدريجي عكسية موازية من القيم المقطعية فيما يتصل أعداد الخلايا الحية المعالجة (قضبان الأرجواني) للعينات غير المعالجة (أشرطة زرقاء). الخلايا الحية تعامل أسفرت عن القيم CT أعلى إلى حد ما من تلك الخلايا الحية دون علاج. ولوحظ وجود اتجاه التدريجي عكسية مماثلة في القيم CT مع العدد الحقيقي للخلايا الحية في حي مخاليط خلية ميتة / تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية (أشرطة خضراء)، وكذلك في الشكل 2B. بالإضافة إلى ذلك، كان هذا الاتجاه النزولي القيم CTلاحظ مع عدد الخلايا الحية في مخاليط الرغم من وجود 106 الخلايا الميتة. وأظهرت هذه النتائج أن القيم CT من العيش / مخاليط خلية ميتة يمثل الحمض النووي من الخلايا الحية وحدها، في حين أن تضخيم الحمض النووي من الخلايا الميتة قمعت بشكل فعال من قبل سلطة النقد الفلسطينية العلاج. ولكن، وتقلبت القيم CT يعيش خليط من الخلايا الميتة / تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وفشلت في عكس أرقام الخلية الحية في مخاليط في الشكل 2B (أشرطة الصفراء).
الشكل 1. العيش والخلايا الميتة تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية أو بدون سلطة النقد الفلسطينية في QPCR الفحص. (A) مسلسل من 10 أضعاف المخفف الحية E. كولاي O157: H7 التخفيفات الخلية (8 × 10 0-8 × 10 6 كفو) عولج مع سلطة النقد الفلسطينية أو بدون سلطة النقد الفلسطينية.القيم CT تمثل متوسط القيم CT من يثلث في مقايسة QPCR. (ب) مقارنة بين تضخيم الحمض النووي من الخلايا الحية والخلايا الميتة تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية دون في المقارنة ف QPCR الفحص. ΔRn يشير إلى تغير كثافة مضان. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. وأدلى كما هو مبين - تمايز الخلايا الحية من العيش / مخاليط الخلية برصاص PMA-QPCR أربع مجموعات من التخفيفات 10 أضعاف من الثقافات الخلية (8 × 10 6 × 10 8 كفو 0). كان يعامل (A) أول مجموعة من الخلايا التخفيف مع سلطة النقد الفلسطينية في حين كان التخفيف الخلية الثانية أو غير المعالجة قبل استخراج الحمض النووي.(ب) كانت مختلطة 8 × 10 6 الخلايا الميتة مع مجموعات الثالثة والرابعة من التخفيفات الخلية لجعل مجموعتين من العيش / مخاليط خلية ميتة كما هو مبين. كان يعالج مجموعة واحدة من خليط الخلية مع سلطة النقد الفلسطينية وكان يعالج مجموعة أخرى دون سلطة النقد الفلسطينية قبل استخراج الحمض النووي. يمثل كل شريط متوسط القيم CT من تجربة ثلاث نسخ ± SD.
| كائن حي | النمط المصلي | عدد سلالات اختبار |
| كولاي | 2006 السبانخ O157: H7 اندلاع العزلات | 186 |
| 2006 تاكو بيل O157: H7 العزلات | 58 | |
| 2006 تاكو جون O157: H7 العزلات | 11 | |
| مجموعات سلالة O157 DMB من غيرها: تفشي H7 | 112 | |
| O104: H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| Ø111 | 24 | |
| O121 | 2 | |
| Ø45 | 5 | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| O91 | 1 | |
| O55 | 9 | |
| آخر | 19 | |
| السالمونيلا | التيفية | 1 |
| نيوبورت | 2 | |
| الشيجلا الزحارية | 6 | 2 |
| الشيجلا السونية | غير معروف | 2 |
| الشيجلا الفلكسنرية | 4 | 1 |
| الشيجلا البويدية | 1 | 1 |
| مجموع | 481 | |
Tقادرة 1. سلالات تستخدم للتحقق من صحة في الوقت الحقيقي PCR مقايسة لتحديد E. O157 كولاي: H7.
Discussion
والهدف الأساسي من هذه الدراسة تنطوي على استخدام لORF Z3276، وهي فريدة من نوعها لE. كولاي O157: H7، والعلامات البيولوجية الوحيد لQPCR الفحص. في الوقت الحاضر، فإن معظم المقايسات QPCR تستهدف الجينات الفوعة، مثل stx1، stx2، وeaeA 1،2،5،6 أو الجينات المظهرية المشتركة، مثل uidA 3،4، rfbE والجينات فليك 8،9. في بعض الأحيان، وهي من الأنواع أو السلالة لا يمكن تحديدها بالتأكيد بواسطة الجينات الفوعة (ق)، مثل STX 1and STX 2 الجينات، كما هي موجودة في الأنواع أو السلالات المختلفة 16 وكذلك تلك الجينات. باستخدام rfbE وفليك عن الجينات المستهدفة، وهناك حاجة إلى كل من الجينات لاستخدامها في هوية كاملة 17. باستخدام ORF Z3276 والعلامات البيولوجية، وقد تجلى هذا الاختبار QPCR أن يكون الفحص حساسة ومحددة (الجدول 1). وقد تعرض هذا الاختبار لصرامة الشمولية والتفرد الاختبارات، بما في ذلك O157: H7 سلالات (ن = 367)، أكثر من 100 السلالات غير O157، والأنواع المسببة للأمراض الأخرى، مثل السالمونيلا والشيجلا. تم الكشف عن H7 سلالات درست بشكل إيجابي، وعثر على عدم تفاعل عرضية من سلالات غير O157 (الجدول 1)، مشيرا إلى أن ORF Z3276 هي العلامات البيولوجية فريدة وقوية للكشف عن E.: جميع O157 O157 كولاي: H7.
الهدف الآخر من هذه الدراسة هو الكشف عن انتقائي الخلايا الحية من الخلايا الميتة عن طريق العلاج قبل سلطة النقد الفلسطينية استخراج الحمض النووي. سلطة النقد الفلسطينية يمكن أن تخترق الخلايا الميتة مع غشاء للخطر وربط الحمض النووي، وبالتالي يحول دون تضخيم الحمض النووي من الخلايا الميتة في PCR 13. قمنا بتعديل الإجراء سلطة النقد الفلسطينية المعاملة، وتكييفه لشكل لوحة 96 جيدا لهذا الإجراء. كثافة حق التعرض للضوء هو ضروري للحصول على أفضل تأثير عبر ربط. سابقا، وقد استخدمت في هذه الخطوة microtubes 13-15. ومع ذلك، microtubes منفصلة يصعب التعامل معها في ضوء السابقينالخطوة posure، وهذه الأنابيب ليست شفافة تماما للحصول على أفضل تروق الصليب. باستخدام لوحة 96 جيدا، قمنا بتحسين كفاءة PMA-العلاج. هذه التغييرات قد تؤثر على الفحص في عدة طرق: أنها تجعل من السهل للحصول على تأثير ربط عبر شاملة وموحدة، وخاصة مع عينات عديدة؛ يمكن نقل عينات المعالجة من لوحة إلى أخرى لتجعل من الممكن للكشف عن عدد كبير العينات، وأنها توفر هذا الاختبار PMA-QPCR مع إمكانات أتمتة العملية برمتها ل. الحد من هذا الاختبار PMA-QPCR هو أن سلطة النقد الفلسطينية العلاج يزيد من تكلفة فحص PCR نوعا ما وانخفاض طفيف حساسية فحص PCR.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر وزارة الامن الداخلي الامريكية لتوفير جزء من التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
References
- Barletta, F., et al. Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).
- Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).
- Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).
- Li, Y., Mustapha, A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR. J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).
- Schmidt, H., et al. Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes. Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).
- Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).
- Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).
- Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).
- Fricker, M., Messelhäußer, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).
- Li, B., Chen, J. Q. Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker. Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).
- Perna, N. T., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature. 409, 529-533 (2001).
- Wang, S., Levin, R. E. Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR. J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).
- Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).
- Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).
- Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).
- Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).
