Summary
Um ensaio de qPCR foi desenvolvido para a detecção de Escherichia coli O157: H7 alvo um marcador genético único, Z3276. A qPCR foi combinado com propidium monoazide (PMA) o tratamento para a detecção de células vivas. Este protocolo foi modificado e adaptado a um formato de placa de 96 poços para uma fácil manipulação e consistente de numerosas amostras
Abstract
Uma estrutura única de leitura aberta (ORF) Z3276 foi identificado como um marcador genético específico para E. coli O157: H7. Um ensaio de qPCR foi desenvolvido para a detecção de E. coli O157: H7, visando ORF Z3276. Com este ensaio, pode-se detectar tão baixo como algumas cópias do genoma de ADN de E. coli O157: H7. A sensibilidade e especificidade do ensaio foram confirmados por testes de validação intensivos com um grande número de E. coli O157: H7 (n = 369) e as estirpes não-O157 (n = 112). Por outro lado, temos procedimento propídio monoazide (PMA) combinado com o protocolo qPCR recentemente desenvolvido para a detecção selectiva de células vivas a partir de células mortas. A amplificação de DNA a partir de células mortas tratadas com PMA foi quase completamente inibida em contraste com amplificação de forma praticamente independente do ADN a partir de células vivas tratadas com PMA. Além disso, o protocolo foi modificado e adaptado para um formato de placa de 96 poços para um manuseamento fácil e consistente de um grande número de amostras. Tseu método deverá ter um impacto sobre microbiológico preciso e monitoramento epidemiológico da segurança alimentar e fonte ambiental.
Introduction
A PCR é uma técnica comum para a detecção de E. coli O157: H7 a partir de amostras de alimentos e ambientais. A identificação de biomarcadores específicos para E. coli O157: H7 é um dos fatores-chave para a detecção de sucesso em ensaios de PCR. Os biomarcadores comumente utilizados em ensaios de PCR para a detecção de E. coli O157: H7 incluem toxinas Shiga (stx 1 e stx 2) 1,2, 3,4 uidA, eaea 5,6, rfbE 7 e FLIC genes 8,9. Esses biomarcadores podem proporcionar eficiência variável para identificação, no entanto, a maioria dos marcadores não pode ser utilizada como um biomarcador único para a detecção de E. coli O157: H7. Esta inadequação no poder diferenciação dos genes-alvo exige biomarcador (s) mais específico e mais forte para a identificação de E. coli O157: H7, 10.
Numerosos sondas para os genes ou grelhas de leitura abertas (ORFs) hipotéticas em E. coliO157: H7 11 foram concebidos para o ensaio de qPCR com base nas pistas de microarrays de genotipagem de DNA de nosso laboratório e através de pesquisa no banco de dados GenBank, do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia. A sequência de Z3276 ORF, que é um gene fimbrial 11, foi seleccionado para o ensaio de qPCR. Subsequentemente, um ensaio de qPCR foi desenvolvida através de numerosos ensaios sobre os parâmetros de PCR, tais como concentrações dos iniciadores e sondas, bem como de recozimento e de extensão temperaturas (dados não mostrados). Após testes inclusão de incentivo e de exclusividade sobre cepas de referência, tais como E. coli O157: H7, não-O157 e Shigella no qPCR, a ORF Z3276 foi identificado como um marcador genético específico e forte para a identificação de E. coli O157: H7. Então, nós desenvolvemos um novo método de qPCR utilizando este biomarcador único para identificação de E. coli O157: H7.
Outro desafio na detecção de E. coli O157: H7 em contaminada foods e meio ambiente é a determinação exata de células vivas a partir de amostras. A presença de ADN estendido de células mortas e a incapacidade para diferenciar viabilidade no ensaio de PCR pode originar leituras de falsos positivos, resultando numa sobreavaliação do número de células vivas na detecção. Consequentemente, isso limita o uso de PCR na detecção precisa de patógenos de origem alimentar 12. Uma nova abordagem para diferenciar ADN de células mortas foi feita através da combinação de propídio monoazide (PMA) de tratamento com um procedimento de PCR nos últimos anos 13-15. PMA é capaz de ir para dentro de células mortas, e intercalam no ADN quando exposto a luz, mas que não pode ir para dentro de células vivas de reagir com o ADN das células vivas. Assim, nas misturas tratadas por PMA de células vivas e mortas, o DNA de células mortas não pode ser amplificado por PCR em 13. Nós combinamos o tratamento PMA com o ensaio qPCR recentemente desenvolvido para detectar seletivamente ao vivo E. coli O157: H7 células. Além disso, fizemos o PMA-qPCR umssay possível para a detecção de alto rendimento.
Protocol
1. Estirpes bacterianas e de ADN molde Preparação
- Crescer cepas de E. coli O157: H7, não-O157, e outras espécies patogénicas, tais como Salmonella e Shigella, a 37 ° C durante a noite com agitação.
- Extrair o DNA de culturas de bactérias usando o kit correspondente (ver tabela de materiais) e seguindo as instruções do fabricante.
- Medir a densidade óptica (DO 260) para determinar as concentrações de ADN, utilizando um espectrofotómetro.
2. Primer e Probe de Design para o Ensaio qPCR
- E. coli O157: H7 são seqüências do GenBank número de acesso AE00517411. Primers e sonda projeto usando o software apropriado para a primeira demão e design sonda para PCR em tempo real (veja a tabela de materiais para mais detalhes).
As seqüências de primers e sonda são as seguintes: Z3276-Forward (F) 5'-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 '
Z3276-Reverse (R) 5'-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 '
Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ - Reconstituir o pó de iniciador com água, resultando numa concentração de 10 uM como uma solução de trabalho de iniciador.
- Dilui-se as sondas de 10 fiM como soluções de trabalho de sonda. As sondas marcadas variar em potência com lotes. Portanto, titular de cada lote de sondas marcadas antes de usar para um ótimo desempenho qPCR.
3. Definir as condições de ensaio de qPCR
- Prepare a mistura de reacção, que consiste em 25,0 ul de PCR em tempo real master mix 2x, 200 nM de iniciador de sentido directo, 200 nM de iniciador de sentido inverso e 100 nM de sonda.
- Adicionar 5 uL de ADN da amostra (100 pg) e um volume apropriado de água para atingir um volume final de 50 ul.
- Para controlo nontemplate, utilizar 5 mL de água para substituir amostra de DNA.
- Definir as condições de qPCR como se segue: 95 ° C durante 10 minutos para a activação de TaqMan, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 10 segundos para desnaturação e 60 &# 176: C durante 1 min para hibridação / extensão.
4. qPCR Teste de Sensibilidade
- Fazer uma diluição em série de 10 vezes de uma cultura de fase semi-exponencial (DO600 = 0,5, cerca de 1,5 x 10 8 UFC / ml por plaqueamento).
- Adicionar 100 ml de diluições de células para uma placa de 96 poços em triplicado.
- Centrifugar a placa a 2500 xg durante 10 min.
- Adicionar 50 ml de solução de extracção de ADN de cada poço.
- Os sedimentos de células Ressuspender com uma pipeta multi-canal.
- Selar a placa com uma película, ferver a placa num banho de água durante 10 minutos, e centrifugar a 2500 g durante 2 min.
5. Preparação de misturas vivas e mortas celulares para tratamento PMA
- Cresce de 10 ml de E. coli O157: H7, a 37 ° C até à fase semi-exponencial e dividir a cultura em duas aliquotas.
- Ferver uma alíquota de células durante 10 minutos em um banho de água para as células mortas e deixar a outra aliquota de células vivas.
- Verifique se ore há células vivas da alíquota mortos pelo calor por plaqueamento das células em placas de agar LB.
- Tome 2 ml das células vivas e mortas pelo calor e ajustar a concentração de 8 x 10 6 CFU / ml com meio LB. Criar quatro conjuntos de diluições de células que variam de 8 x 10 0-8 x 10 6 CFU / mL.
- Use os dois primeiros conjuntos de diluições de células para células vivas tratadas com PMA ou não tratada.
- Para a terceira e quarta séries de diluições de células, adicionar 8 x 10 6 células mortas para cada diluição celular (8 x 10 0 - 8 x 10 6) para fazer misturas de células vivas e mortas.
- Trate o terceiro conjunto de diluição com PMA e usar o quarto conjunto de diluição para o controle.
6. Tratamento de células com PMA
- Dissolve-se PMA em dimetilsulfóxido (ou água) para fazer uma solução estoque de 10 mM e armazenados a -20 ° C no escuro.
- Alíquota 400 mL das células vivas, células mortas, e mistura de células vivas e mortas natrês microtubos separados.
- Adicionar 2,0 ml de 10 mM de PMA a cada alíquota de células para uma concentração final de 50 uM.
- Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 5 min no escuro, agitando suavemente algumas vezes, 3 segundos de cada vez.
- Adicionam-se 100 ul de amostras de um placa de 96 poços.
- Selar a placa com uma película óptica e colocar a placa de gelo.
- Definir a placa 20 cm de uma fonte de luz de halogéneo W 650 e expor durante 2 min durante a exposição à luz.
- Centrifugar a placa a 2500 x g durante 10 minutos, rejeitar o sobrenadante suavemente e cuidadosamente drenar a placa sobre uma folha de papel absorvente.
- Pellets de células ressuspender em 50 ml de solução de extração de DNA por pipetagem cima e para baixo vinte vezes com um multi-canal Pipetman.
- Selar a placa com uma película, ferver durante 10 minutos em um banho de água, e centrifugar a 2500 g durante 2 min. O sobrenadante da placa é o ADN a partir de células tratadas com PMA e pronto para qPCR.
- Realize qPCR como descricama acima, utilizando 5 ul de ADN.
Representative Results
Detecção de E. coli O157: H7 por qPCR utilizando ORF Z3276
Um dos factores importantes deste ensaio é a sensibilidade e especificidade da sonda Z3276 utilizado no qPCR. Pode detectar tão baixo como algumas cópias do genoma de ADN de E. coli O157: H7, como mostrado na Figura 1A. Das 120 estirpes não-O157 examinados, incluindo os seis maiores estirpes não-O157, STEC O104: H4, estirpes de Salmonella, e as estirpes de Shigella, sem qualquer reactividade cruzada foi encontrado, como mostrado na Tabela 1.
Combinação do tratamento com PMA qPCR
Incubar E. coli O157: H7 células com PMA (50 mM), durante 5 minutos no escuro e exposição à luz durante 2 min foram seleccionados para as condições de tratamento com PMA. Além disso, modificamos procedimento de tratamento de PMA. Comparado com vários microtubos transparentes utilizadas no passo de reticulação, uma placa de 96 poços foi encontrada para ser mais eficazatingir o efeito óptimo de reticulação e mais conveniente do que o tratamento de um grande número de tubos de amostra durante o processo de exposição à luz.
A amplificação de DNA a partir de células vivas e mortas tratadas com PMA em qPCR
Os efeitos da inibição mediada por PMA de amplificação de DNA a partir de células mortas neste ensaio qPCR foram mostrados na Figura 1, utilizando o ADN obtido a partir de duas 10 vezes diluições de células vivas ou mortas em série. Os resultados mostram que as curvas geradas a partir de células vivas tratadas com PMA (curva vermelha) e sem PMA (curva azul) parecem quase linear e idênticos uns aos outros. Diferenças de valor de CT foram ligeiras mostrado entre as células vivas tratadas com PMA e sem PMA (Figura 1A), sugerindo que o tratamento com PMA teve pouco efeito sobre a ampliação do ADN das células vivas no qPCR. Mas a 15 - Diferença de valor CT (32.000 vezes) foi exibido entre as células mortas tratadas com PMA e sem PMA, demonstraçãonstrating que o tratamento com PMA suprimiram eficientemente a amplificação de DNA a partir das células mortas (Figura 1B).
A detecção de células vivas a partir de misturas de células vivas e mortas na qPCR
Dois conjuntos de diluições de células vivas (8 x 10 0-8 x 10 6 UFC) foram tratados com PMA ou sem PMA a detecção de células vivas a partir de misturas de células vivas / mortas. Os resultados de qPCR (figura 2A) demonstraram uma tendência progressiva inversa paralelo de valores de CT em relação com o número de células vivas tratadas (barras a púrpura) para as amostras não tratadas (barras azuis). As células vivas tratadas rendeu um pouco mais elevados do que os valores de CT de células vivas não tratados. Uma tendência progressiva inversa semelhante nos valores do CT foi observada com o número real de células vivas nas misturas live / dead de células tratadas com PMA (barras verdes) bem na Figura 2B. Além disso, esta tendência de queda dos valores do CT foiobservado com o número de células vivas nas misturas, apesar da presença de 106 células mortas. Estes resultados mostraram que os valores de TC de as misturas de células vivas / mortas representado o ADN a partir das células vivas isoladamente, ao passo que a amplificação de DNA a partir das células mortas foi eficientemente suprimidos por tratamento de PMA. Mas, os valores do CT de misturas ao vivo / morto de células tratadas com PMA foram oscilou e não conseguiu reflete o número de células vivas nas misturas da figura 2B (barras amarelas).
Figura 1. Viver e células mortas tratadas com PMA ou sem PMA em ensaio qPCR. (A) Uma série de 10 vezes diluído em directo E. coli O157: H7 (diluições de células 8 x 10 0-8 x 10 6 UFC) foram tratados com PMA ou sem PMA.Os valores CT representam os valores médios de CT das triplicatas no ensaio qPCR. (B) Comparação da amplificação de DNA de células vivas e células mortas tratadas com PMA e sem PMA no ensaio qPCR comparação q. ΔRn refere-se a fluorescência mudança intensidade. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Diferenciação de células vivas a partir de misturas de células vivas / mortas por PMA-qPCR Quatro conjuntos de diluições de 10 vezes das culturas de células (8 x 10 0-8 x 10 6 UFC). Foram efectuadas conforme indicado. (A) Primeiro conjunto de diluição de células foi tratado com PMA, enquanto a segunda diluição celular foi ou não tratada antes da extração de DNA.(B) 8 x 10 6 células mortas foram misturados com os terceiro e quarto conjuntos de diluições de células para fazer dois conjuntos de misturas de células vivas / mortas, tal como indicado. Um conjunto das misturas de células foi tratado com PMA e o outro conjunto foi tratado sem PMA antes da extracção do ADN. Cada barra representa os valores médios de TC de uma experiência em triplicado ± DP.
| Organismo | O sorotipo | N º de cepas testadas |
| E. coli | 2006 espinafre O157: H7 isoladas de surto | 186 |
| 2006 Taco Bell O157: H7 isolados | 58 | |
| 2006 Taco John O157: H7 isolados | 11 | |
| Coleções DMB tensão de outros O157: H7 surtos | 112 | |
| O104: H4 | 3 | |
| O26 | 18 | |
| O103 | 13 | |
| O111 | 24 | |
| O121 | 2 | |
| O45 | 5 | |
| O145 | 9 | |
| O113 | 2 | |
| O91 | 1 | |
| O55 | 9 | |
| Outro | 19 | |
| Salmonella | Typhi | 1 |
| Newport | 2 | |
| Shigella dysenteriae | 6 | 2 |
| Shigella sonnei | Desconhecido | 2 |
| Shigella flexneri | 4 | 1 |
| Shigella boydii | 1 | 1 |
| Total | 481 | |
Tcapaz 1. estirpes utilizadas para validação de ensaio de PCR em tempo real para identificação de E. coli O157: H7.
Discussion
Um objetivo primário do estudo envolve o uso de uma ORF Z3276, um exclusivo para E. coli O157: H7, como um único biomarcador para o ensaio de qPCR. No momento, a maioria dos ensaios de qPCR são alvo genes de virulência, como stx1, stx2 e eaeA 1,2,5,6 ou genes fenotípicas compartilhados, como uidA 3,4, rfbE e genes Flic 8,9. Ocasionalmente, uma espécie ou estirpe não pode ser definitivamente identificado por gene (s) de virulência, tais como 1e stx stx 2 genes, como os genes estão presentes em diferentes espécies ou estirpes 16 bem. Usando rfbE e fliC para genes alvo, ambos os genes são necessários para ser utilizado para a identificação completa 17. Usando ORF Z3276 como um biomarcador, este ensaio qPCR tem sido demonstrado ser ensaio sensível e específico (Tabela 1). Este ensaio tem sido submetido a testes de inclusão e exclusividade rigorosas, incluindo O157: H7 (n = 367), mais de 100 cepas não-O157, e outras espécies patogênicas, como Salmonella e Shigella. Todos os O157: H7 cepas analisadas foram positivamente detectada, e nenhuma reação cruzada foi encontrada a partir das cepas não-O157 (Tabela 1), indicando que a ORF Z3276 é um biomarcador único e forte para a detecção de E. coli O157: H7.
O outro objetivo do estudo é detectar seletivamente as células vivas de células mortas por tratamento PMA antes da extração de DNA. PMA podem penetrar nas células mortas com membrana comprometida e se ligam ao DNA, e portanto inibe a amplificação do DNA de células mortas em PCR 13. Nós modificamos o procedimento PMA-tratamento, e adaptou-a para um formato de placa de 96 poços para o procedimento. A intensidade da direita da exposição à luz é essencial para obter o efeito óptimo de reticulação. Anteriormente, microtubos foram utilizados neste passo 13-15. No entanto, microtubos separados são difíceis de manusear em função expasso Posure, e estes tubos não são absolutamente transparente para obter o melhor cross-gosto. Usando uma placa de 96 poços, que melhorou a eficiência de PMA-tratamento. Estas alterações podem influenciar o ensaio de várias maneiras: eles tornam mais fácil a obtenção de um efeito de reticulação completa e uniforme, em especial com as amostras numerosas; as amostras tratadas podem ser movidos a partir de uma placa para a outra para possibilitar a detecção de um grande número das amostras, e que proporcionam este ensaio PMA-qPCR com potencial de automatização para todo o processo. A limitação deste ensaio PMA-qPCR é que o tratamento com PMA, aumenta o custo do ensaio de PCR ligeiramente e reduziu ligeiramente a sensibilidade do ensaio de PCR.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Departamento de Segurança Interna dos EUA para fornecer parte do financiamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | ||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 W Halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
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