Summary
الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هي المقايسات الوظيفية الروتينية للتعبير عن المنتبذ عابرة من الجينات في النباتات. هذه الأساليب هي المقايسات الفعالة في استراتيجيات علم الآثار (المقاومة السريعة واكتشاف الجينات avirulence) وحاسمة للبحوث الحديثة في علم الأمراض النباتية الجزيئية. وهي تلبي الطلب على تحليل وظيفي قوي عالي الإنتاجية في النباتات.
Abstract
الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هما مقايستان تعبيرتان عابرتان فعالتان للتحليل الوظيفي للجينات المرشحة في النباتات. العامل الأكثر استخداما للترشيح الزراعي هو البكتيريا الزراعية tumefaciens، وهو ممرض للعديد من أنواع النباتات ديكوت. وهذا يعني أنه يمكن تطبيق الترشيح الزراعي على العديد من أنواع النباتات. هنا، نقدم بروتوكولاتنا والنتائج المتوقعة عند تطبيق هذه الطرق على البطاطا(سولانوم الدرنة)،والأنواع سولانوم البرية ذات الصلة الحاملة للدرنة(سولانوم قسم بيتوتا)والنموذج نبات نيكوتيانا بنثاميانا. بالإضافة إلى التحليل الوظيفي للجينات المفردة ، مثل المقاومة(R)أو avirulence(Avr)الجينات ، فإن فحص الترشيح الزراعي مناسب جدا لتلخيص تفاعلات R-AVR المرتبطة بتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة المحددة بمجرد تسليم R و Avr transgenes إلى نفس الخلية. ومع ذلك، يمكن لبعض الأنماط الجينية النباتية رفع الاستجابات الدفاعية غير المحددة للبكتيريا الزراعية،كما لاحظنا على سبيل المثال للعديد من الأنماط الجينية للبطاطا. بالمقارنة مع الترشيح الزراعي ، فإن اكتشاف نشاط AVR مع العدوى الزراعية PVX أكثر حساسية ، وأكثر إنتاجية عالية في الشاشات الوظيفية وأقل حساسية للاستجابات الدفاعية غير المحددة للبكتيريا الزراعية. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث دفاع غير محدد لPVX وهناك خطر أن تفوت الاستجابات بسبب المقاومة الشديدة الناجمة عن الفيروس. على الرغم من هذه القيود، في تجربتنا، الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هي على حد سواء المقايسات المناسبة والتكميلية التي يمكن استخدامها في وقت واحد لتأكيد نتائج بعضها البعض.
Introduction
Effectoromics ، وقد برز مؤخرا نهج الجينوم وظيفية عالية الإنتاجية كأداة قوية لتحديد المقاومة (R) الجينات في نباتات المحاصيل ومطابقة avirulence(Avr)الجينات من مسببات الأمراض1-4. وعلى النقيض من التحول المستقر الأكثر استهلاكا للوقت مع جينات R، تستند استراتيجية علم التأثير إلى المقايسات العابرة لتسلسلات الجينات المسببة للأمراض.
منذ عصر الجينوم، تم استكشاف جينوم مسببات الأمراض النباتية على نطاق واسع. على سبيل المثال بالنسبة للوميسيتات ، والتي تشمل مسببات الأمراض النباتية الأكثر تدميرا ، تم إنشاء مجموعات كبيرة من التسلسلات وتحليلها للجينات التي تلعب دورا أثناء التفاعل مع النبات5-10. فئة واحدة من البروتينات المسببة للأمراض يمثل التأثيرات، والتي تعالج بنية الخلية المضيفة ووظيفة إما لتسهيل العدوى (عوامل الفوعة) أو لتحريك الاستجابات الدفاعية (عوامل avirulence)11-13. التعبير عن الجينات Avr في الخلايا النباتية التي تحتوي على الجينات R عادة ما يؤدي إلى استجابة موت الخلايا مفرط الحساسية (HR)14,15. في بلانتا التعبير عن الجينات R وAVR يمكن أن يتحقق باستخدام أنظمة التعبير عابرة مثل Tumefaciens Agrobacterium -التحول العابر القائم (الترشيح الزراعي)16. ويمكن أيضا تطبيق هذا التحول عابرة في تركيبة مع نظم التعبير الفيروسي (agroinfection)17,18.
بالنسبة للترشيح الزراعي ، فإن العامل الأكثر استخداما هو A. tumefaciens ، وهو مجموعة واسعة من مسببات الأمراض في نباتات الديكوت. يحتوي التوميفاسيان على بلازميد (Ti) مثير للورم. نقل الحمض النووي (تي الحمض النووي) من تي بلازميد سوف تنتقل إلى الخلايا النباتية بعد تنشيط آلية فحولة البكتيريا. ويمكن أن يحدث هذا في الخلايا النباتية الجرحى, من قبل المركبات الفينولية منخفضة الوزن الجزيئية الصادرة وmonosaccharaides في بيئة حمضية قليلا19. يتم تنشيط جين الفوعة بعد تسلل تعليق Agrobacterium إلى ألواح أوراق تحددها الأوردة الرئيسية. ثم سيتم تحويل الخلايا النباتية في لوحات ورقة والتعبير عن transgene (ق) الواردة في منطقة تي الحمض النووي.
ويستند العدوى الزراعية على Agrobacteriumتلقيح الجرح ، الذي يتوسط نقل الفيروس إلى الخلايا النباتية. ثم ينتشر الفيروس إلى الأنسجة النباتية المجاورة ، في غياب Agrobacterium. بالنسبة للإصابة الزراعية، يمكن استخدام العديد من الفيروسات النباتية. فيروسات الحمض النووي الريبي هي ناقلات مثالية للتعبير الجيني لأنها يمكن أن تتضاعف إلى مستويات عالية جدا في النباتات المصابة. من بين الفيروسات الحمض النووي الريبي النباتية، يستخدم على نطاق واسع فيروس البطاطا X (PVX) لشاشات علم التأثير. لتسهيل الاختبارات الوظيفية لجين إدراجها، تم استنساخ ناقلات ثنائية التي تحتوي على الجينوم PVX يحيط بها فيروس القرنبيط الفسيفساء 35S المروج والمنهي synthase nopaline، في T-DNA من A. tumefaciens20. بعد نقل الحمض النووي إلى خلايا نباتية ، يتم نسخ جينوم PVX الموجود في الحمض النووي T من مروج 35S. ثم تنتشر جزيئات الفيروس بشكل منهجي في النباتات المصابة ، مما يؤدي إلى التعبير عن الجين المدرج. وتسمى هذه الطريقة على أساس كل من Agrobacterium وPVX PVX العدوى الزراعية.
هنا نعرض أمثلة لكل من الترشيح الزراعي ومقاايسات العدوى الزراعية PVX. كما النباتات المضيفة نستخدم الجرثومة البطاطا (قسم سولانوم بيتوتا)،والتي نهج علم التأثير كانت رائدة وثبت نجاحها3،4. ونحن نستخدم أيضا نيكوتيانا بنثاميانا، والتي تشتهر بأنها مصنع نموذجي في النباتات سولاناسيوس 14،21،22.
Protocol
1. زراعة النباتات وظروف الاختبار
- زراعة وصيانة النباتات في الدفيئات الخاضعة للرقابة أو غرف المناخ ضمن نطاق درجة الحرارة من 18-22 درجة مئوية وفي ظل نظام الضوء الطبيعي أو مع نظام 16 ساعة / 8 ساعة ليلا / نهارا. إزالة الفروع الإضافية من أجل جعل النباتات أكثر قابلية للإدارة.
- للبطاطس، والحفاظ على النباتات في المختبر في الجرار البلاستيكية العقيمة التي تحتوي على موراشيج سكوغ (MS) المتوسطة (20 غرام / لتر السكروز، 5 غ/لتر أملاح التصلب المتعدد مع الفيتامينات، 8 غرام/ لتر أجار، درجة الحموضة 5.8) في ظل ظروف خاضعة للرقابة في غرف المناخ عند 18 درجة مئوية مع نظام نهاري/ليلي لمدة أسبوعين لمدة 16 ساعة/8 ساعات، ثم نقلها إلى أواني من التربة المعقمة في مقصورات الدفيئة المنظمة.
2. الترشيح الزراعي
- المواد النباتية:
لنيكوتيانا بنثاميانا, استخدام حوالي 4-5 أسابيع من النباتات المزروعة بالبذور القديمة. للبطاطا، استخدم حوالي 4-5 أسابيع من عمليات زرع الأعضاء القديمة من المختبر. اختيار الشباب، وأوراق صحية ومطورة تماما لعمليات التسلل. -
ثقافة البكتيريا الزراعية:
- إعداد وسيط YEB مقدما (الجدول 1). ملء أنابيب 50 مل مع 10 مل YEB المتوسطة تكملها مع 1 ميكرولتر acetosyringone (200 mM), 100 ميكرولتر MES العازلة (2-(N-morpholino) - حمض سلفونيك الإيثان, 1 M) والمضادات الحيوية المناسبة. ماصة 20 ميكرولتر مخزون الجلسيرول من السلالات المطلوبة (الجدول 2) (تحتوي على جين الفائدة) في YEB. بدء الثقافات لجميع سلالات Agrobacterium في هذا المقايسة في نفس الوقت. احتضان الخلايا عن طريق اهتزاز لمدة 1-2 أيام في 28 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة إلى OD600 من حوالي 1.0.
- حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 10 دقائق. صب قبالة supernatant و resuspend بيليه في المتوسطة MMA الطازجة (الجدول 3) إلى OD600 من 0.3. دوامة الخلايا برفق لإعادة إنفاقها. لترشيح عملة من اثنين من السلالات البكتيرية، وخلط الثقافة في نسبة 1:1.
- اترك الثقافة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-6 ساعات قبل التسلل. في غضون ذلك، تسمية النباتات التي سيتم اختراقها وتاريخ التجربة.
- عمليات التسلل:
استخدام حقنة 1 مل إبرة التسلل تعليق Agrobacterium. بعناية وببطء حقن لوحات ورقة مع تعليق من المحاقن (لأسباب تتعلق بالصحة والسلامة يجب أن ترتديه حماية العين خلال هذه العملية). التسلل ما لا يقل عن ثلاثة مصانع لكل سلالة. استخدام ثلاث أوراق لكل نبات لتكون بمثابة ثلاثية.
ملاحظة: عادة، 1 مل من Agrobacterium تعليق ق يمكن أن تكون كافية ل 3 نباتات N. بنثاميانا. بالنسبة للبطاطا، هناك حاجة إلى مزيد من التعليق لأن أوراق أنواع سولانوم أكثر صعوبة في التسلل. تعتمد الكميات المطلوبة من عمليات التعليق على أنواع سولانوم. تجنب التلوث المتبادل عن طريق تغيير القفازات أو تعقيم القفازات بالإيثانول بين عمليات التسلل وعدم سقي النباتات حتى اليوم التالي للتلقيح. - سجل:
تسجيل الاستجابات العيانية حوالي 3 أيام بعد التسلل عندما يكون النمط الظاهري موت الخلية واضح(الشكل 1). إذا كان النمط الظاهري لوفيات الخلايا كميا، فاستخدم المعايير المحددة(الشكل 2). باختصار، تعتمد مقاييس التهديف العياني لوفيات الخلايا بشكل رئيسي على نسب موت الخلية في المنطقة المخترقة. يتم تصوير النسب المئوية لوفيات الخلايا على مقياس من 0٪ (بدون أعراض) إلى 100٪ (موت الخلايا الملتخمة). وتتراوح الاستجابات المتوسطة من الاستجابات الضعيفة مثل داء الكلوروز إلى زيادة مستويات موت الخلايا. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أيضا تقييم الدرجات العيانية كميا باستخدام معدات التصوير الضوئي الحديثة.
3. PVX العدوى الزراعية
- المواد النباتية:
لN. بنثاميانا, استخدام حوالي 2-3 النباتات المزروعة بالبذور الأسبوع القديم. للبطاطا، استخدم حوالي 2-3 أسابيع من عمليات زرع الأعضاء القديمة من المختبر. للاختبارات واسعة النطاق، استخدم النباتات الأقدم قليلا (4-5 أسابيع)، لأن هذه النباتات لديها أوراق أكثر وأكبر لاستيعاب أعداد أكبر من بقع تلقيح البكتيريا الزراعية. -
زراعة البكتيريا الزراعية:
- قم بإعداد وسيط YEB مسبقا. ملء أنابيب 10 مل مع 3 مل YEB تكملها المضادات الحيوية المناسبة. ماصة 20 ميكرولتر مخزون الجلسيرول من السلالات المطلوبة (الجدول 2) (تحتوي على جين الفائدة) في YEB. بدء الثقافات لجميع سلالات Agrobacterium في هذا المقايسة في نفس الوقت. احتضان الخلايا عن طريق اهتزاز لمدة 1-2 أيام في 28 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة إلى OD600 من حوالي 1.0.
- ماصة حوالي 300 ميكرولتر من كل سلالة Agrobacterium ونشرها على لوحات LB Agar الصلبة المتوسطة تكملها المضادات الحيوية المناسبة والخلايا المحتضنة في 28 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام.
- الالتهابات:
استخدام ملعقة لجمع ثقافة Agrobacterium في لوحة. تراجع مسواك خشبية في ثقافة Agrobacterium على ملعقة وثقب الأوراق لتطعيم كمية كبيرة من البكتيريا. تلقيح ما لا يقل عن ثلاثة نباتات لكل سلالة. استخدام ثلاث أوراق لكل نبات لتكون بمثابة ثلاثية. في كل ورقة، وجعل مواقع التطعيم متعددة لكل سلالة. - سجل:
تسجيل الاستجابات العيانية بعد حوالي أسبوعين من التطعيم (الشكل 3). بالنسبة للشاشات عالية الإنتاجية، سجل الاستجابات النوعية (نعم/لا) لكل بقعة تلقيح. ثم حساب النسبة المئوية للمواقع المستجيبة ومقارنتها مع عناصر التحكم.
Representative Results
ويبين الشكل 1 تجربة تمثيلية للترشيح الزراعي مع 7 محفزات مختلفة (E1-E7) في البطاطا وN. بنثاميانا. تظهر وفاة الخلية في ألواح الأوراق المتسللة بعد حوالي 3 أيام من التسلل. مدى النمط الظاهري موت الخلية يحتاج إلى مقارنة مع الضوابط. تم استخدام خليط من سلالة Agrobacterium AGL1 (pVirG)23 التي تحتوي على pBINplus-R3a و pK7WG2-AVR3a كتحكم إيجابي24,25، في حين تم استخدام AGL1 (pVirG) كتحكم سلبي. ويبين الشكلان 1 ألف و1ب أمثلة جيدة على التسلل الزراعي في النمط الجيني للبطاطا MaR8 (Mastenbroek R8)26 و N. benthamiana، على التوالي ، وهما قابلان جدا للترشيح الزراعي. هناك موت الخلايا التقاء في لوحة ورقة coinfiltrated مع السيطرة الإيجابية، في حين لا يحدث أي استجابة موت الخلية مع السيطرة السلبية أو pBINplus-R3a. في MaR8 ، اثنين من المفعول AVR3a (E2) وAVR4 (E3) تحفز موت الخلية ، في حين أن التأثيرات الأخرى (E1 و E4-E7) لا. في N. benthamiana ، لا أحد من المحفزات المختبرة تحفز استجابة موت الخلية. ويبين الشكلان 1C و1D أمثلة على التسلل الزراعي في البطاطا البرية سولانوم بيرتولتي 483-1 وسولانوم ريكهي 210-5، وهما غير قابلين جيدا لتقنية الترشيح الزراعي. في S. berthaultii 483-1 ، تظهر أنسجة الورق نخرا غير محدد للضوابط السلبية وكذلك لجميع المحفزات المختبرة. في S. rechei 210-5، تظهر ألواح الأوراق المخترقة استجابة ضعيفة جدا لوفاة الخلية للسيطرة الإيجابية.
ويبين الشكل 2 مجموعة من مقاييس التهديف التي يمكن استخدامها لقياس الاستجابة للبكتيريا الزراعية المصفاة. يتم تصوير النسب المئوية لوفيات الخلايا على مقياس 0-100٪. وتتراوح الأنماط الظاهرية الملاحظة من الأعراض غير المرئية بشكل كلي (0٪)، مرورا بمجموعة من الاستجابات الوسيطة التي تظهر الكلوروز وزيادة مستويات موت الخلايا، وحتى موت الخلايا الالتقاءية (100٪).
ويبين الشكل 3 تجربة تمثيلية بعد الإصابة بالزراعة في البطاطس. عادة، يمكن العثور على موت الخلايا الآخذ في التوسع في المواقع بعد حوالي أسبوعين من تلقيح اختيار الأسنان. كما هو مبين في كل من لوحات الشكل، وتوسيع موت الخلية موجود في المواقع التي تم تلقيحها مع pGR106-CRN2 (التحكم الإيجابي باستخدام crn2 المؤثر)، وهو موت الخلية العامة التي تحفز الجينات من P. infestans27. وبصرف النظر عن الاستجابة الطفيفة للجرح ، لا يلاحظ موت الخلايا الآخذة في التوسع في المواقع التي تم تلقيحها ب pGR106-empty (التحكم السلبي). في الشكل 3A، تمثل البطاطا النمط الجيني MaR3 (Mastenbroek R3) ، واثنين من pGR106 - التأثيرات (E1 و E2) لم تحفز موت الخلية. في الشكل 3B، يتم تقديم نتيجة إيجابية لفحص التأثير في زولانوم هوانكابينسي البرية 354-1 ؛ ولوحظت استجابة موت الخلية لاثنين من pGR106-effectors (E1-E3، تمثل elicitins)28.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 أمثلة على التسلل الزراعي في البطاطا وN. بنثاميانا. النباتات بما في ذلك (أ) نوع وراثي للبطاطس MaR8 (Mastenbroek R8) ، (ب) N. تم اختراق بنثاميانا،(C) سولانوم بيرتولتي 483-1 و (D) سولانوم ريسي 210-5 مع خليط من سلالة Agrobacterium AGL1 (pVirG) 23 التي تحتوي على pBINplus-R3a وpK7WG2-AVR3a (التحكم الإيجابي) ، AGL1 (pvirG) (السيطرة السلبية) ، pBINplus-R3a ، وسبعة محفزات (E1-E7). انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تحديد كمي لاستجابات الترشيح الزراعي. تظهر الصورة جداول تسجيل تمثيلية لوفيات الخلايا، تتراوح بين 0٪ (بدون أعراض) و100٪ (موت الخلايا الملتخمة). وتتراوح الاستجابات المتوسطة من الاستجابات الضعيفة مثل داء الكلوروز إلى زيادة مستويات موت الخلايا. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن أمثلة على الإصابة الزراعية PVX في البطاطا. البطاطا النمط الجيني MaR3 (Mastenbroek R3) (أ) وسولانوم huancabambense 354-1(B)الأسنان اختيار تلقيح مع pGR106-CRN2 (السيطرة الإيجابية)، pGR106 فارغة (السيطرة السلبية) وpGR106-E1-2 (التأثيرات)، أو pGR106-E1-E3، على التوالي. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الجدول 1 - الجداول متوسط YEB
| 1 لتر | المقطر H2O |
| 5 جم | سكروز |
| 5 جم | مستخلص لحم البقر |
| 5 جم | بيبتون البكتريولوجية |
| 1 غرام | استخراج الخميرة |
| 2 مل | MgSO4 (1 م) |
الجدول 2 - الأرباح النواقل والسلالات المستخدمة للترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX. يمكن استخدام عدة متجهات ثنائية. ناقلات في القائمة أدناه تسمح التعبير عالية من الجينات المرشحة وعملت بشكل جيد في أيدينا. نحن نفضل استخدام سلالة Agrobacterium GV3101 (pMP90)29 في N. بنثاميانا والعثور على AGL130 التي تحتوي على المساعد بلازميد pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 أكثر ملاءمة في البطاطا31. وقد تم تحليل سلالات إضافية في مجموعات أخرى على مختلف النباتات نموذج بما في ذلك N. بنثاميانا ولكن ليس في البطاطا32.
GW: إصدارالبوابة 36
الجدول 3 - الأرباح MMA المتوسطة.
ضبط درجة الحموضة إلى 5.6.
Discussion
المقايسات العابرة مثل الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية هي طرق فعالة حيوية لأبحاث علم الأمراض النباتية الجزيئية الحديثة. على الرغم من بعض القيود، تلبي هذه الأساليب الطلب على تحليل وظيفي عالي الإنتاجية وفعال وقوي في النباتات.
نظام الترشيح الزراعي هو المقايسة الوظيفية المستخدمة على نطاق واسع في مجموعة من الأنواع النباتية. يسهل الترشيح الزراعي تسليم العديد من المتحولين إلى نفس الخلية مع التعبير المتزامن عن البروتينات المتفاعلة. هذا مفيد لتلخيص العلاقات R-AVR، من خلال سلالات Agrobacterium coinfiltrating التي تعبر عن جينات Avr مع السلالات التي تعبر عن الجينات R مطابقة. أيضا، لأزواج R-AVR المعروفة، يمكن استخدام مثل هذه اللترات كعناصر تحكم إيجابية. ومن المهم إدراج هذه الضوابط لأن كفاءة التحويل في بعض الأنماط الجينية النباتية يمكن أن تكون دون العتبة للكشف عن الاستجابات. بما في ذلك الضوابط السلبية ، على سبيل المثال سلالة Agrobacterium التي تحتوي على ناقل دون إدراج الجينات ، أمر ضروري أيضا لتحديد ما إذا كان نوع وراثي نباتي معين يثير استجابات دفاعية غير محددة للبكتيريا الزراعية. تحدث هذه الميزة على تردد معين في جرثومة البطاطس ، وليس كل أنواع سولانوم مناسبة تماما لنظام التعبير القائم على Agrobacterium. عموما، يعمل المقايسة الترشيح الزراعي بشكل جيد جدا في N. بنثاميانا ومعظم الأنماط الجينية البطاطا. بالإضافة إلى علم التأثير، هناك تطبيقات محتملة أخرى مختلفة لتقنية الترشيح الزراعي، مثل إنتاج البروتينات من المتحولين جنسيا وتوطين البروتين في الخلايا النباتية عن طريق المجهر الكونفوجال.
PVX agrofection هو نظام فحص حساس للغاية وعادة ما يكون أكثر ملاءمة للفحوصات عالية الإنتاجية. وبما أن البكتيريا الزراعية موجودة الآن محليا فقط، فإن الاستجابات غير المحددة لهذه البكتيريا ليست مزعجة للغاية الآن، حيث أن فيروس PVX يتولى المزيد من انتشار المتحولين جنسيا. ومع ذلك، قد تكون النباتات مقاومة ل PVX، أو جبل المقاومة القصوى (ER) الاستجابات، وفي هذه الحالة طريقة العدوى الزراعية ليست مناسبة. وثمة قيد آخر على طريقة الإصابة الزراعية PVX هو إدراج حجم الجين المثير للاهتمام. قد تختلف الأنماط الظاهرية الملاحظة للاستجابات من نخر أسود شديد يحيط بالجرح إلى نخر خافت بالقرب من بقعة التطعيم. في كل من N. بنثاميانا وسولانوم الأنواع، ومن المسلم به PVX العدوى الزراعية باعتبارها أكثر حساسية من الترشيح الزراعي.
مع الأخذ في الاعتبار أن الخلفية الوراثية للأنماط الجينية النباتية المتنوعة التي تم اختبارها يمكن أن يكون لها بعض القيود (انظر أعلاه) ، نحصل بشكل عام على استنتاجات مماثلة من قبل PVX العدوى الزراعية والترشيح الزراعي. هذه النتائج هي أيضا قابلة للمقارنة كما تم الحصول عليها في المقايسات الأخرى، مثل تسلل البروتين29 و ELISA3. وبالنظر إلى مزايا والقيود المفروضة على كلا النظامين، نوصي باستخدام كلتا الطريقتين إما لاستكمال بعضهما البعض أو تأكيد النتائج المستقلة.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل جزئيا صندوق جامعة واغنينغن، وبرنامج مجلس المنح الدراسية الصيني لطلاب الدراسات العليا، ومنحة NWO-VIDI 12378.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
| Incubator | Infors HT | Multitron II | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |
References
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors. Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).
- Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes. Plos One. 3, 1-10 (2008).
- Oh, S. K., et al. In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2. Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).
- Tyler, B. M., et al. Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis. Science. 313, 1261-1266 (2006).
- Haas, B. J., et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans. Nature. 461, 393-398 (2009).
- Levesque, C. A., et al. Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire. Genome Biol. 11, 1-22 (2010).
- Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. Oomycete genomics: new insights and future directions. FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).
- Stassen, J. H. M., et al. Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing. Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).
- Kemen, E., et al. Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).
- Win, J., et al. Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , Cold Spring Harbor. 1-13 (2012).
- Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).
- Kamoun, S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes. Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).
- van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 122, 101-108 (1997).
- Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. In planta expression of oomycete and fungal genes. Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).
- Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H. In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics. Diversity, Interactions, and Research Tools. Lamour, K., Kamoun, S. 23, 455-475 (2009).
- Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE. J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).
- Lu, R., et al. High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance. EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).
- Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves. Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).
- Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., Ané, J. M., Jiang, J. Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato. Plos One. 4, 1-8 (2009).
- van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).
- Huang, S., et al. Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42, 251-261 (2005).
- Armstrong, M. R., et al. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).
- Kim, H. J., et al. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes. Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).
- Torto, T. A., et al. EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora. Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum. Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).
- Koncz, C., Schell, J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary. Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).
- Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).
- Rietman, H. Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , Wageningen University. (2011).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- van engelen, F. A., et al. pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).
- Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. A mini binary vector series for plant transformation. Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).
- Curtis, M. D., Grossniklaus, U. A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).
