Summary
Agro-infiltratie en PVX-agro-infectie zijn routinematige functionele assays voor voorbijgaande ectopische expressie van genen in planten. Deze methoden zijn efficiënte assays in effectoromics strategieën (snelle weerstand en avirulence gen ontdekking) en cruciaal voor modern onderzoek in moleculaire plant pathologie. Ze voldoen aan de vraag naar robuuste functionele analyse met hoge doorvoer in fabrieken.
Abstract
Agro-infiltratie en PVX-agro-infectie zijn twee efficiënte transiënte expressietesten voor functionele analyse van kandidaatgenen in planten. Het meest gebruikte middel voor agro-infiltratie is Agrobacterium tumefaciens, een ziekteverwekker van veel dicot plantensoorten. Dit houdt in dat agro-infiltratie op veel plantensoorten kan worden toegepast. Hier presenteren we onze protocollen en verwachte resultaten bij het toepassen van deze methoden op de aardappel(Solanum tuberosum),de gerelateerde wilde knoldragende Solanum-soorten (Solanum-sectie Petota)en de modelplant Nicotiana benthamiana. Naast functionele analyse van enkelvoudige genen, zoals resistentie (R) of avirulentie (Avr) genen, is de agro-infiltratietest zeer geschikt voor het samenvatten van de R-AVR interacties geassocieerd met specifieke gastheer pathogene interacties door simpelweg R en Avr transgenen in dezelfde cel te leveren. Sommige plantennotypes kunnen echter niet-specifieke afweerreacties op Agrobacteriumoproepen, zoals we bijvoorbeeld hebben waargenomen voor verschillende aardappelnotypes. In vergelijking met agro-infiltratie is detectie van AVR-activiteit met PVX-agro-infectie gevoeliger, meer high-throughput in functionele schermen en minder gevoelig voor niet-specifieke afweerreacties op Agrobacterium. Echter, niet-specifieke verdediging tegen PVX kan optreden en er is een risico om reacties te missen als gevolg van virus-geïnduceerde extreme weerstand. Ondanks dergelijke beperkingen zijn agro-infiltratie en PVX-agro-infectie in onze ervaring zowel geschikte als complementaire assays die tegelijkertijd kunnen worden gebruikt om elkaars resultaten te bevestigen.
Introduction
Effectoromics, een high-throughput functionele genomicabenadering is onlangs naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel om resistentie (R) genen in gewasplanten en bijpassende avirulentie (Avr) genen van pathogenen1-4te identificeren . In tegenstelling tot de meer tijdrovende stabiele transformatie met R-genen, is de effectoromics-strategie gebaseerd op voorbijgaande assays van pathogene gensequenties.
Sinds het genomicatijdperk zijn genomen van plantenpathogenen op grote schaal onderzocht. Bijvoorbeeld voor oomyceten, waaronder de meest verwoestende plantenpathogenen, zijn grote verzamelingen sequenties gegenereerd en geanalyseerd op genen die een rol spelen tijdens de interactie met de plant5-10. Een klasse van pathogene eiwitten vertegenwoordigt effectoren, die de structuur en functie van de gastheercel manipuleren om infectie (virulentiefactoren) te vergemakkelijken of om afweerreacties (avirulentiefactoren) te activeren11-13. Expressie van Avr-genen in plantencellen die R-genen bevatten, resulteert meestal in de overgevoelige celdoodrespons (HR)14,15. In planta kan de uitdrukking van R en Avr genen worden verwezenlijkt gebruikend voorbijgaande uitdrukkingssystemen zoals Agrobacterium tumefaciens -gebaseerde voorbijgaande transformatie (agroinfiltratie)16. Deze transiënte transformatie kan ook worden toegepast in combinatie met virale expressiesystemen (agro-infectie)17,18.
Voor agro-infiltratie is het meest gebruikte middel A . tumefaciens, een breed scala aan pathogenen van dicotplanten. A . tumefaciens bevat een tumor-inducerende (Ti) plasmide. Transfer-DNA (T-DNA) van een Ti plasmide zal in de plantencellen worden omgezet nadat de virulentiemachines van de bacterie zijn geactiveerd. Dit kan worden geactiveerd in gewonde plantencellen, door de vrijgekomen fenolverbindingen met een laag molecuulgewicht en monosaccharaiden in een licht zure omgeving19. Het virulentiegen wordt geactiveerd na de infiltratie van Agrobacterium-suspensuspensingen in bladpanelen die worden gedefinieerd door grote aderen. Vervolgens worden plantencellen in de bladpanelen getransformeerd en drukken ze de transgene(n) uit in het T-DNA-gebied.
Agro-infectie is gebaseerd op geïmplanteerde Agrobacterium, die translocatie van een virus naar plantencellen bemiddelt. Het virus verspreidt zich vervolgens verder naar aangrenzende plantenweefsels, bij afwezigheid van Agrobacterium. Voor agro-infectie kunnen verschillende plantenvirussen worden gebruikt. RNA-virussen zijn ideale vectoren voor genexpressie omdat ze zich kunnen vermenigvuldigen tot zeer hoge niveaus in geïnfecteerde planten. Onder plantaardige RNA-virussen wordt Potato Virus X (PVX) veel gebruikt voor effectoromics-schermen. Om functionele tests voor een ingebracht gen te vergemakkelijken, werden binaire vectoren die het PVX-genoom bevatten geflankeerd door het Bloemkoolmozaïekvirus 35S promotor en de nopaline synthase terminator, gekloond in het T-DNA van A. tumefaciens20. Nadat het T-DNA is overgebracht naar plantencellen, wordt het PVX-genoom in het T-DNA getranscribeerd van de 35S-promotor. Vervolgens verspreiden virusdeeltjes zich systemisch in de geïnfecteerde planten, wat resulteert in de expressie van het ingebrachte gen. Deze methode op basis van zowel Agrobacterium als PVX wordt PVX agro-infectie genoemd.
Hier laten we voorbeelden zien voor zowel de agro-infiltratie als PVX agro-infectietesten. Als waardplanten gebruiken we aardappelkiemplasma(Solanum-sectie Petota),waarvoor effectoromics-benaderingen zijn geïntroduceerd en succesvol zijngebleken 3,4. We gebruiken ook Nicotiana benthamiana, die bekend staat als een modelplant in Solanaceous planten14,21,22.
Protocol
1. Plantgroei- en testomstandigheden
- Kweek en onderhoud planten in gecontroleerde kassen of klimaatkamers binnen het temperatuurbereik van 18-22 °C en onder natuurlijk lichtregime of met een dag/nachtregime van 16 uur/8 uur. Verwijder okseltakken om de planten beter beheersbaar te maken.
- Voor aardappelen, in vitro plantenbakken bewaren in steriele plastic potten met Murashige-Skoog (MS) medium (20 g/L sucrose, 5 g/L MS zouten met vitaminen, 8 g/L agar, pH 5,8) onder gecontroleerde omstandigheden in klimaatkamers bij 18 °C met een 16 uur/8 uur dag/nacht regime gedurende twee weken en breng ze vervolgens over in potten met gesteriliseerde grond in gereguleerde kascompartimenten.
2. Agro-infiltratie
- Plantaardig materiaal:
Gebruik voor Nicotiana benthamianaongeveer 4-5 weken oude zaadgekweekte planten. Gebruik voor aardappel ongeveer 4-5 weken oude transplantaties van in vitro. Kies jonge, gezonde en volledig ontwikkelde bladeren voor infiltraties. -
Agrobacterium cultuur:
- Bereid het YEB-medium van tevoren voor (Tabel 1). Vul de 50 ml tubes met 10 ml YEB medium aangevuld met 1 μl acetosyringon (200 mM), 100 μl MES buffer (2-(N-morpholino)-ethaansulfonzuur, 1 M) en de juiste antibiotica. Pipet 20 μl glycerolvoorraad van de gewenste stammen (Tabel 2) (met het gen van belang) in het YEB. Initieer culturen voor alle Agrobacterium stammen in deze test op hetzelfde moment. Incubeer cellen door 1-2 dagen te schudden bij 28 °C en 200 tpm tot een OD600 van ongeveer 1,0.
- Oogst cellen door centrifugeren op 3.000 x g gedurende 10 min. Giet het supernatant af en resuspend de pellet in vers gemaakt MMA-medium (tabel 3) tot een OD600 van 0,3. Draai cellen voorzichtig om ze te resuspenderen. Voor coinfiltratie van twee bacteriestammen, meng de cultuur in een 1:1 verhouding.
- Laat de cultuur 1-6 uur op kamertemperatuur op de bank staan voor infiltraties. Label ondertussen de te infiltreren planten en de datum van het experiment.
- Infiltraties:
Gebruik een naaldloze spuit van 1 ml om de Agrobacterium-suspensuspensen te infiltreren. Injecteer voorzichtig en langzaam bladpanelen met de suspensuspensen uit de spuit (om gezondheids- en veiligheidsredenen moet de oogbescherming tijdens dit proces worden gedragen). Infiltreer ten minste drie planten voor elke soort. Gebruik drie bladeren per plant om als drievoud te dienen.
Opmerking: Normaal gesproken kan 1 ml Agrobacterium suspensie voldoende zijn voor 3 planten N. benthamiana. Voor aardappelen is meer suspensie nodig omdat de bladeren van Solanum-soorten moeilijker te infiltreren zijn. De vereiste hoeveelheden suspensus zijn afhankelijk van de Solanum-soort. Voorkom kruisbesmetting door handschoenen te verwisselen of handschoenen met ethanol te steriliseren tussen infiltraties en door de planten pas de dag na de inenting water te geven. - Scoren:
Scoor macroscopische reacties ongeveer 3 dagen na infiltratie wanneer het celdoodfenotype duidelijk is (Figuur 1). Als het celdoodfenotype kwantitatief is, gebruikt u de gegeven criteria (figuur 2). Kortom, de schalen voor macroscopische scoring van celdood zijn voornamelijk afhankelijk van de celdoodpercentages van het geïnfiltreerde gebied. Percentages celdood worden weergegeven op een schaal van 0% (geen symptomen) tot 100% (samenvloeiingsceldood). Tussenreacties variëren van zwakke reacties zoals chlorose tot toenemende niveaus van celdood. Indien gewenst kan de macroscopische score ook kwantitatief worden beoordeeld met behulp van moderne fotobeeldapparatuur.
3. PVX Agro-infectie
- Plantaardig materiaal:
Gebruik voor N. benthamianaongeveer 2-3 weken oude zaadgekweekte planten. Gebruik voor aardappel ongeveer 2-3 weken oude transplantaties van in vitro. Gebruik voor grootschalige tests iets oudere (4-5 weken) planten, omdat deze planten meer en grotere bladeren hebben om hogere aantallen Agrobacterium-inentingsplekken te huisvesten. -
Agrobacterium cultivering:
- Bereid het YEB-medium van tevoren voor. Vul de 10 ml tubes met 3 ml YEB aangevuld met de juiste antibiotica. Pipet 20 μl glycerolvoorraad van de gewenste stammen (Tabel 2) (met het gen van belang) in het YEB. Initieer culturen voor alle Agrobacterium stammen in deze test op hetzelfde moment. Incubeer cellen door 1-2 dagen te schudden bij 28 °C en 200 tpm tot een OD600 van ongeveer 1,0.
- Pipetteer ongeveer 300 μl van elke Agrobacterium stam en verspreid ze op LB vaste agar medium platen aangevuld met de juiste antibiotica en incubeer cellen bij 28 °C gedurende 1-2 dagen.
- Infecties:
Gebruik een spatel om de Agrobacterium kweek in de plaat te verzamelen. Dompel een houten tandenstoker in de Agrobacterium-cultuur op de spatel en doorboor de bladeren om grote hoeveelheden bacteriën te enten. Ent ten minste drie planten voor elke soort. Gebruik drie bladeren per plant om als drievoud te dienen. Maak in elk blad meerdere inentingsplaatsen voor elke soort. - Scoren:
Scoor macroscopische reacties ongeveer twee weken na inenting (Figuur 3). Voor schermen met hoge doorvoer registreert u de kwalitatieve antwoorden (ja/nee) voor elke inentingsplek. Bereken vervolgens het percentage reagerende sites en vergelijk ze met besturingselementen.
Representative Results
Figuur 1 toont een representatief experiment van agro-infiltratie met 7 verschillende effectoren (E1-E7) in aardappel en N. benthamiana. Celdood verschijnt ongeveer 3 dagen na infiltratie in de geïnfiltreerde bladpanelen. De omvang van het celdoodfenotype moet worden vergeleken met de controles. Een mengsel van de Agrobacterium stam AGL1(pVirG)23 met pBINplus-R3a en pK7WG2-AVR3a werd gebruikt als positieve controle24,25, terwijl AGL1(pVirG) werd gebruikt als negatieve controle. De figuren 1A en 1B laten goede voorbeelden zien van agro-infiltratie in het aardappelgenotype MaR8 (Mastenbroek R8) respectievelijk26 en N. benthamiana,die zeer vatbaar zijn voor agro-infiltratie. Er is samenvloeiende celdood in het bladpaneel gemunt met positieve controle, terwijl geen celdoodreactie optreedt met negatieve controle of pBINplus-R3a. In MaR8 veroorzaken twee effectoren AVR3a (E2) en AVR4 (E3) een celdood, terwijl de andere effectoren (E1 en E4-E7) dat niet doen. In N. benthamiana induceert geen van de geteste effectoren een celdoodrespons. De figuren 1C en 1D tonen voorbeelden van agro-infiltratie in de wilde aardappel Solanum berthaultii 483-1 en Solanum rechei 210-5, die niet goed vatbaar zijn voor de agro-infiltratietechniek. In S. berthaultii 483-1 vertoont het bladweefsel een aspecifieke necrose voor negatieve controles en voor alle geteste effectoren. In S. rechei 210-5 vertonen geïnfiltreerde bladpanelen een zeer zwakke celdoodrespons op positieve controle.
Figuur 2 toont een reeks scoreschalen die kunnen worden gebruikt om de respons op agro-geïnfiltreerde Agrobacteriumte kwantificeren . Percentages celdood worden weergegeven op een schaal van 0-100%. Waargenomen fenotypes variëren van macroscopisch niet zichtbare symptomen (0%), via een reeks tussenreacties met chlorose en toenemende niveaus van celdood, tot samenvloeiende celdood (100%).
Figuur 3 toont een representatief experiment na PVX agro-infectie in aardappel. Normaal gesproken is het uitbreiden van celdood te vinden op de locaties ongeveer twee weken na tand-pick inenting. Zoals getoond in beide figuurpanelen, is de uitdijende celdood aanwezig op de plaatsen die met pGR106-CRN2 (positieve controle met behulp van de effector crinkler Crn2) werden ingeënt, wat een algemeen celdood inducerend gen van P. infestans27is. Afgezien van een kleine reactie op wondpijn, wordt er geen uitzettende celdood opgemerkt op de plaatsen waar tandpluk werd ingeënt met de pGR106-leeg (negatieve controle). In figuur 3A, die het aardappelgenotype MaR3 (Mastenbroek R3) vertegenwoordigt, veroorzaakten twee pGR106-effectoren (E1 en E2) geen celdood. In figuur 3Bwordt een positief resultaat van effectorscreening in het wild Solanum huancabambense 354-1 gepresenteerd; celdoodrespons werd waargenomen op twee pGR106-effectoren (E1-E3, die elicitines vertegenwoordigen)28.
Figuur 1. Voorbeelden van agro-infiltratie in aardappel en N. benthamiana. Planten waaronder (A) een aardappelgenotype MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, ( C) Solanum berthaultii 483-1 en (D) Solanum rechei 210-5 werden geïnfiltreerd met een mengsel van de Agrobacterium stam AGL1(pVirG) 23 met pBINplus-R3a en pK7WG2-AVR3a (positieve controle), AGL1(pVirG) 23 met pBINplus-R3a en pK7WG2-AVR3a (positieve controle), AGL1(pVirG) 23 met pBINplus-R3a en pK7WG2-AVR3a (positieve controle), AGL1(pVirG) 23 met pBINplus-R3a en pK7WG2-AVR3a (positieve controle), AGL1(pVirG) 23 met pBINplus-R3a en pK7WG2-AVR3a (positieve controle). Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Kwantificering van agro-infiltratiereacties. De foto toont representatieve scoreschalen voor celdood, variërend van 0% (geen symptomen) tot 100% (samenvloeiende celdood). Tussenreacties variëren van zwakke reacties zoals chlorose tot toenemende niveaus van celdood. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Voorbeelden van PVX agro-infectie in aardappel. Aardappelgenotype MaR3 (Mastenbroek R3) (A) en Solanum huancabambense 354-1 (B) tandenpriem ingeënt met respectievelijk pGR106-CRN2 (positieve controle), pGR106-empty (negatieve controle) en pGR106-E1-2 (effectoren), of pGR106-E1-E3. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Tabel 1. YEB-medium
| 1 L | gedestilleerd H2O |
| 5 g | sacharose |
| 5 g | rundvleesextract |
| 5 g | bacteriologische pepton |
| 1 g | gistextract |
| 2 ml | MgSO4 (1 M) |
Tabel 2. Vectoren en stammen die worden gebruikt voor agro-infiltratie en PVX-agro-infectie. Er kunnen verschillende binaire vectoren worden gebruikt. Vectoren in de onderstaande lijst maken een hoge expressie van de kandidaatgenen mogelijk en hebben goed in onze handen gewerkt. We geven de voorkeur aan het gebruik van de Agrobacterium stam GV3101(pMP90)29 in N. benthamiana en vinden AGL130 met de helper plasmide pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 meer geschikt in aardappel31. Aanvullende stammen zijn geanalyseerd in andere groepen op verschillende modelplanten, waaronder N. benthamiana, maar niet in aardappel32.
GW: gateway versie36
Tabel 3. MMA medium.
Stel de pH in op 5,6.
Discussion
Voorbijgaande assays zoals agro-infiltratie en agro-infectie zijn efficiënte methoden die essentieel zijn voor modern moleculair plantenpathologisch onderzoek. Ondanks enkele beperkingen voldoen deze methoden aan de vraag naar efficiënte en robuuste functionele analyse met hoge doorvoer in fabrieken.
Het agro-infiltratiesysteem is een veel gebruikte functionele test bij een reeks plantensoorten. Agro-infiltratie vergemakkelijkt de levering van verschillende transgenen in dezelfde cel met gelijktijdige expressie van interagerende eiwitten. Dit is voordelig voor het samenvatten van R-AVR-relaties, door Agrobacterium-stammen te munten die Avr-genen uitdrukken met stammen die de overeenkomende R-genen uitdrukken. Ook voor bekende R-AVR-paren kunnen dergelijke coinfiltraties worden gebruikt als positieve controles. Het opnemen van dergelijke controles is belangrijk omdat in sommige plantgenotypes de transformatie-efficiëntie onder de drempel kan liggen om reacties te detecteren. Het opnemen van negatieve controles, bijvoorbeeld een Agrobacterium stam die een vector zonder gen insert bevat, is ook essentieel om te bepalen of een bepaald plant genotype niet-specifieke afweerreacties op de Agrobacteriumoproept . Deze eigenschap komt met een bepaalde frequentie voor in aardappelkiemplasma, en niet alle Solanum-soorten zijn goed geschikt voor dit op Agrobacteriumgebaseerde expressiesysteem. Over het algemeen werkt de agro-infiltratietest zeer goed in N. benthamiana en de meeste aardappelgenotypes. Naast effectoromics zijn er verschillende andere mogelijke toepassingen voor de agro-infiltratietechniek, zoals de productie van eiwitten uit transgenen en eiwitlokalisatie in plantencellen door confocale microscopie.
PVX agro-infectie is een zeer gevoelig screeningssysteem en meestal meer geschikt voor screenings met hoge doorvoer. Aangezien de Agrobacterium nu alleen lokaal aanwezig is, zijn niet-specifieke reacties op deze bacterie nu niet erg storend, omdat het PVX-virus de verdere verspreiding van het transgene overneemt. Planten kunnen echter resistent zijn tegen PVX of extreme resistentiereacties (ER) monteren, en in dat geval is de agro-infectiemethode niet geschikt. Een andere beperking van de PVX-agro-infectiemethode is de insertgrootte van het interessegen. Waargenomen fenotypes van reacties kunnen variëren van een intense zwarte necrose rond de wond tot zwakke necrose in de buurt van de inentingsvlek. Bij zowel N. benthamiana- als Solanum-soorten wordt PVX-agro-infectie erkend als gevoeliger dan agro-infiltratie.
Rekening houdend met het feit dat de genetische achtergrond van de diverse geteste plantengenotypes enkele beperkingen kan hebben (zie hierboven), krijgen we over het algemeen vergelijkbare conclusies van PVX-agro-infectie en agro-infiltratie. Deze resultaten zijn ook vergelijkbaar met die van andere testresultaten, zoals eiwitinfiltraties29 en ELISA3. Gezien de voordelen en beperkingen van beide systemen, raden we aan beide methoden te gebruiken om elkaar aan te vullen of onafhankelijke resultaten te bevestigen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Het werk wordt deels ondersteund door Wageningen University Fund (WUF), China Scholarship Council Program for Graduate Students en een NWO-VIDI-beurs 12378.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
| Incubator | Infors HT | Multitron II | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |
References
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors. Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).
- Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes. Plos One. 3, 1-10 (2008).
- Oh, S. K., et al. In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2. Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).
- Tyler, B. M., et al. Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis. Science. 313, 1261-1266 (2006).
- Haas, B. J., et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans. Nature. 461, 393-398 (2009).
- Levesque, C. A., et al. Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire. Genome Biol. 11, 1-22 (2010).
- Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. Oomycete genomics: new insights and future directions. FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).
- Stassen, J. H. M., et al. Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing. Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).
- Kemen, E., et al. Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).
- Win, J., et al. Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , Cold Spring Harbor. 1-13 (2012).
- Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).
- Kamoun, S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes. Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).
- van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 122, 101-108 (1997).
- Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. In planta expression of oomycete and fungal genes. Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).
- Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H. In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics. Diversity, Interactions, and Research Tools. Lamour, K., Kamoun, S. 23, 455-475 (2009).
- Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE. J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).
- Lu, R., et al. High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance. EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).
- Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves. Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).
- Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., Ané, J. M., Jiang, J. Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato. Plos One. 4, 1-8 (2009).
- van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).
- Huang, S., et al. Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42, 251-261 (2005).
- Armstrong, M. R., et al. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).
- Kim, H. J., et al. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes. Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).
- Torto, T. A., et al. EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora. Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum. Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).
- Koncz, C., Schell, J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary. Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).
- Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).
- Rietman, H. Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , Wageningen University. (2011).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- van engelen, F. A., et al. pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).
- Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. A mini binary vector series for plant transformation. Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).
- Curtis, M. D., Grossniklaus, U. A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).
