Summary
אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי חזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.
Abstract
אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם שני מבחני ביטוי ארעיים יעילים לניתוח תפקודי של גנים מועמדים בצמחים. הסוכן הנפוץ ביותר עבור agroinfiltration הוא אגרובקטריום tumefaciens, פתוגן של מינים רבים של צמחי dicot. משמעות הדבר היא כי agroinfiltration יכול להיות מיושם על מיני צמחים רבים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים שלנו ואת התוצאות הצפויות בעת יישום שיטות אלה על תפוח האדמה(Solanum tuberosum),מינים הקשורים שלה נושא פקעת בר סולנום (סעיף סולנום Petota)ואת צמח המודל Nicotiana benthamiana. בנוסף לניתוח תפקודי של גנים בודדים, כגון גנים התנגדות (R) או ארסיות (Avr), בדיקת האגרואינציה מתאימה מאוד לסיכום אינטראקציות R-AVR הקשורות לאינטראקציות פתוגן מארח ספציפיות פשוט על ידי אספקת טרנסגנים R ו- Avr לאותו תא. עם זאת, כמה גנוטיפים צמחיים יכולים להעלות תגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום, כפי שראינו למשל עבור כמה גנוטיפים תפוחי אדמה. בהשוואה לאגרו-סינון, זיהוי פעילות AVR עם אגרואינטציה של PVX רגיש יותר, בעל תפוקה גבוהה יותר במסכים פונקציונליים ופחות רגיש לתגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום. עם זאת, הגנה לא ספציפית ל- PVX יכולה להתרחש ויש סיכון להחמיץ תגובות עקב התנגדות קיצונית הנגרמת על ידי וירוסים. למרות מגבלות כאלה, מניסיוננו, אגרואינפילטרציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים מתאימים ומשלימים שניתן להשתמש בהם בו זמנית כדי לאשר את התוצאות אחד של השני.
Introduction
Effectoromics, גישה גנומית תפקודית בעלת תפוקה גבוהה התפתחה לאחרונה ככלי רב עוצמה לזיהוי גנים עמידים (R) בצמחי יבול וגנים תואמים שלפתוגנים1-4. בניגוד לשינוי היציב שגוזל זמן רב יותר עם גנים R, אסטרטגיית ההשפעה מבוססת על מבחנים ארעיים של רצפי גנים פתוגן.
מאז עידן הגנומיקה, גנומים של פתוגנים צמחיים נחקרו באופן נרחב. לדוגמה עבור oomycetes, הכוללים את פתוגנים הצמח ההרסני ביותר, אוספים גדולים של רצפים נוצרו ונותחו עבור גנים לשחק תפקיד במהלך האינטראקציה עם הצמח5-10. מחלקה אחת של חלבוני פתוגן מייצגת אפקטים, אשר לתפעל את מבנה התא המארח ולתפקד או כדי להקל על זיהום (גורמי ארסיות) או לעורר תגובות הגנה (גורמי ארסיות)11-13. ביטוי של גנים Avr בתאי צמח המכילים גנים R בדרך כלל תוצאות תגובת מוות תא רגיש (HR)14,15. בביטוי פלנטה של גנים R ו- Avr ניתן להשיג באמצעות מערכות ביטוי ארעיות כגון אגרובקטריום tumefaciens -מבוסס טרנספורמציה חולפת (agroinfiltration)16. טרנספורמציה חולפת זו יכולה להיות מיושמת גם בשילוב עם מערכות ביטוי ויראלי (agroinfection)17,18.
עבור agroinfiltration, הסוכן הנפוץ ביותר הוא A . tumefaciens, פתוגן טווח מארח רחב של צמחי dicot. A . tumefaciens מכיל פלסמיד גרימת גידול (Ti). העברת DNA (T-DNA) מ פלסמיד Ti יהיה טרנסלוקציה לתוך תאי הצמח לאחר מכונות ארסיות של החיידק מופעל. זה יכול להיות מופעלות בתאי צמח פצועים, על ידי שוחרר במשקל מולקולרי נמוך תרכובות פנוליות monosaccharaides בסביבה חומצית מעט19. גן הארס מופעל לאחר חדירת השעיות אגרובקטריום ללוחות עלים המוגדרים על ידי ורידים גדולים. לאחר מכן תאי הצמח בלוחות העלים ישתנו ויבטאו את הטרנסג'ינים הכלולים באזור ה- T-DNA.
Agroinfection מבוסס על אגרובקטריוםמחוסן פצע , אשר מתווך טרנסלוקציה של וירוס לתאי הצמח. הנגיף מתפשט עוד יותר לרקמות צמחיות סמוכות, בהיעדר אגרובקטריום. עבור agroinfection, מספר וירוסים צמחיים ניתן להשתמש. וירוסי RNA הם וקטורים אידיאליים לביטוי גנים מכיוון שהם יכולים להתרבות לרמות גבוהות מאוד בצמחים נגועים. בין וירוסי RNA צמחיים, וירוס תפוחי אדמה X (PVX) נמצא בשימוש נרחב עבור מסכי אפקטים. כדי להקל על בדיקות תפקודיות עבור גן מוכנס, וקטורים בינאריים המכילים את הגנום PVX מוקף וירוס פסיפס כרובית 35S מקדם ואת שליחות קטלנית סינתאז nopaline, היו משובטים לתוך T-DNA של A. tumefaciens20. לאחר שה- T-DNA מועבר לתאי צמחים, הגנום של PVX הכלול ב- T-DNA מתמלל ממקדם 35S. ואז חלקיקי וירוסים מתפשטים באופן שיטתי בצמחים הנגועים, וכתוצאה מכך הביטוי של הגן שהוכנס. שיטה זו המבוססת הן על אגרובקטריום והן על PVX נקראת PVX agroinfection.
כאן אנו מציגים דוגמאות הן עבור agroinfiltration והן מבחני אגרואינדיקציה PVX. כצמחים מארחים אנו משתמשים בחיידק תפוחי אדמה (סעיףסולנום Petota),שעבורו גישות אפקטורומיקה היו חלוציות והוכחו כמוצלחות3,4. אנו משתמשים גם Nicotiana benthamiana, אשר ידוע כצמח מודל בצמחים Solanaceous 14,21,22.
Protocol
1. תנאי גידול ובדיקה של צמחים
- לגדל ולתחזק צמחים בחממות מבוקרות או בתאי אקלים בטווח הטמפרטורות של 18-22 מעלות צלזיוס ותחת משטר אור טבעי או עם משטר של 16 שעות /8 שעות ביום / לילה. הסר ענפים בבית השחי על מנת להפוך את הצמחים לניהול יותר.
- עבור תפוחי אדמה, לשמור על עציצים במבחנה בצנצנות פלסטיק סטריליות המכילות Murashige-Skoog (MS) בינוני (20 גרם / L סוכרוז, 5 גרם / L MS מלחים עם ויטמינים, 8 גרם / L אגר, pH 5.8) בתנאים מבוקרים בתאי האקלים ב 18 °C (60 °F) עם משטר 16 שעות / 8 שעות ביום / לילה במשך שבועיים ולאחר מכן להעביר אותם סירים של אדמה מעוקרת בתאי חממה מוסדרים.
2. חדירה אגרו-סינון
- חומר צמחי:
עבור Nicotiana benthamiana, השתמש סביב 4-5 שבועות זרעים גדל צמחים. עבור תפוחי אדמה, להשתמש סביב 4-5 שבועות השתלות מתוך במבחנה. בחר עלים צעירים, בריאים ומפותחים לחלוטין להסתננות. -
תרבות אגרובקטריום:
- הכינו מראש את מדיום ה-YEB(טבלה 1). מלא את צינורות 50 מ"ל עם 10 מיליליטר YEB בינוני בתוספת 1 μl acetosyringone (200 מ"מ), 100 μl MES חוצץ (2-(N-מורפולינו)-אתאן חומצה גופריתית, 1 M) ואת האנטיביוטיקה המתאימה. פיפט 20 μl גליצרול מלאי של הזנים הרצויים (טבלה 2) (המכיל את הגן של עניין) לתוך YEB. ליזום תרבויות עבור כל זני אגרובקטריום ב assay זה בעת ובעונה אחת. דגירה תאים על ידי רועד במשך 1-2 ימים ב 28 °C (69 °F) ו 200 סל"ד כדי OD600 של כ 1.0.
- תאי קציר על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 10 דקות. יוצקים את supernatant ו resuspend גלולה במדיום MMA טרי(טבלה 3)כדי OD600 של 0.3. בעדינות תאי מערבולת כדי resuspend אותם. לסינון מטבעות של שני זנים חיידקיים, ערבבו את התרבות ביחס של 1:1.
- השאירו את התרבות על הספסל בטמפרטורת החדר במשך 1-6 שעות לפני חדירות. בינתיים, לתייג את הצמחים להסתנן ואת תאריך הניסוי.
- חדירות:
השתמש 1 מ"ל מזרק ללא מחט לחדור השעיות אגרובקטריום. בזהירות ולאט לאט להזריק לוחות עלה עם המתלים מן המזרק (מסיבות בריאותיות ובטיחותיות יש ללבוש הגנה על העיניים במהלך תהליך זה). לחדור לפחות שלושה צמחים לכל זן. השתמש שלושה עלים לכל צמח לשמש משולשים.
הערה: בדרך כלל, 1 מ"ל של Agrobacterium השעיה s יכול להיות מספיק עבור 3 צמחים של N. benthamiana. עבור תפוחי אדמה, יש צורך בהשעיה נוספת מכיוון שקשה יותר לחדור לעלים של מיני סולנום. כמויות נדרשות של השעיות תלויות במין סולנום. הימנע זיהום צולב על ידי החלפת כפפות או כפפות עיקור עם אתנול בין חדירות ועל ידי לא להשקות את הצמחים עד היום לאחר החיסון. - הבקיע:
ציון תגובות מקרוסקופיות כשלושה ימים לאחר ההסתננות כאשר פנוטיפ המוות של התא ברור (איור 1). אם הפנוטיפ של מוות תאי הוא כמותי, השתמש בקריטריונים הנתונים (איור 2). בקצרה, המאזניים עבור ניקוד מקרוסקופי של מוות תאי תלויים בעיקר באחוזים מוות התא של האזור הסתנן. אחוזי המוות של תאים מתוארים בסולם של 0% (ללא תסמינים) עד 100% (מוות תאי בו זמנית). תגובות ביניים נעות בין תגובות חלשות כגון כלורוזיס לרמות הולכות וגדלות של מוות תאי. אם תרצה, ניתן גם להעריך את הניקוד המקרוסקופי באופן כמותי באמצעות ציוד הדמיית תמונות מודרני.
3. אגרוינדיקציה PVX
- חומר צמחי:
עבור N. benthamiana, להשתמש סביב 2-3 שבועות זרעים גדל צמחים. עבור תפוחי אדמה, להשתמש סביב 2-3 שבועות השתלות בן במבחנה. עבור בדיקות בקנה מידה גדול, להשתמש מעט מבוגר יותר (4-5 שבועות) צמחים, כמו צמחים אלה יש עלים יותר ויותר כדי להתאים מספרים גבוהים יותר של כתמי חיסון אגרובקטריום. -
פולחן אגרובקטריום:
- הכינו את המדיום YEB מראש. ממלאים את צינורות 10 מ"ל עם 3 מיליליטר YEB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה. פיפט 20 μl גליצרול מלאי של הזנים הרצויים (טבלה 2) (המכיל את הגן של עניין) לתוך YEB. ליזום תרבויות עבור כל זני אגרובקטריום ב assay זה בעת ובעונה אחת. דגירה תאים על ידי רועד במשך 1-2 ימים ב 28 °C (69 °F) ו 200 סל"ד כדי OD600 של כ 1.0.
- פיפטה על 300 μl של כל זן אגרובקטריום ולהפיץ אותם על LB מוצק אגר בינוני צלחות בתוספת אנטיביוטיקה מתאימים תאים דגירה ב 28 °C (69 °F) במשך 1-2 ימים.
- זיהומים:
השתמש מרית כדי לאסוף את התרבות אגרובקטריום בצלחת. טובלים קיסם עץ בתרבות האגרובקטריום על המרית ומנקבים את העלים כדי לחסן כמות גדולה של חיידקים. לחסן לפחות שלושה צמחים עבור כל זן. השתמש שלושה עלים לכל צמח לשמש משולשים. בכל עלה, להפוך אתרי חיסון מרובים עבור כל זן. - הבקיע:
ציון תגובות מקרוסקופיות כשבועיים לאחר החיסון (איור 3). עבור מסכי תפוקה גבוהה, הקלט את התגובות האיכותיות (כן/לא) עבור כל נקודת חיסון. לאחר מכן חשב את אחוז האתרים המגיבים והשווה אותם לפקדים.
Representative Results
איור 1 מציג ניסוי מייצג של חדירת אגרואינציה עם 7 משפיעים שונים (E1-E7) בתפוח אדמה ו- N. benthamiana. מוות תאי מופיע בלוחות העלים החודרים כשלושה ימים לאחר ההסתננות. יש להשוות את היקף הפנוטיפ של מוות תאי עם הפקדים. תערובת של זן אגרובקטריום AGL1(pVirG)23 המכיל pBINplus-R3a ו pK7WG2-AVR3a שימש שליטה חיובית24,25, בעוד AGL1(pVirG) שימש כשליטה שלילית. איורים 1A ו- 1B מראים דוגמאות טובות של חדירה בגנוטיפ תפוחי האדמה MaR8 (Mastenbroek R8)26 ו- N. benthamiana, בהתאמה, אשר נוחים מאוד עבור agroinfiltration. יש מוות תאי confluent בלוח העלה coinfiltrated עם שליטה חיובית, בעוד אין תגובת מוות של התא מתרחשת עם שליטה שלילית או pBINplus-R3a. ב- MaR8, שני משפיעים AVR3a (E2) ו- AVR4 (E3) גורמים למוות של תא, בעוד שהמשפיעים האחרים (E1 ו- E4-E7) אינם. ב- N. benthamiana, אף אחד מהמשפיעים שנבדקו אינו מחליף תגובת מוות של תא. איורים 1C ו- 1D מראים דוגמאות של חדירה אגרואינום בתפוח האדמה הפראי Solanum berthaultii 483-1 וסולנום rechei 210-5, אשר אינם נוחים היטב עבור טכניקת agroinfiltration. ב S. berthaultii 483-1, רקמת העלה מראה נמק לא ספציפי לבקרות שליליות, כמו גם לכל המשפיעים שנבדקו. ב S. rechei 210-5, לוחות עלה הסתננו להראות תגובה חלשה מאוד מוות תאי לשליטה חיובית.
איור 2 מציג טווח של קשקשי ניקוד שניתן להשתמש בהם כדי לכמת את התגובה לאגרובקטריוםמפושט . אחוזי המוות של תאים מתוארים בסולם של 0-100%. פנוטיפים שנצפו נעים בין סימפטומים מקרוסקופיים לא גלויים (0%), דרך מגוון של תגובות ביניים המציגות כלורוזיס ורמות הולכות וגדלות של מוות תאי, עד מוות תאי במקביל (100%).
איור 3 מציג ניסוי מייצג לאחר אגרואינדיקציה של PVX בתפוח אדמה. בדרך כלל, הרחבת מוות תאי ניתן למצוא באתרים כשבועיים לאחר חיסון לקטוף שיניים. כפי שמוצג בשני לוחות הדמות, הרחבת מוות תאי קיים באתרים שהיו לקטוף שיניים מחוסן עם pGR106-CRN2 (שליטה חיובית באמצעות Crn2 crinkler אפקטים), שהוא מוות כללי של התא גרימת גן מ P. infestans27. מלבד תגובה קלה לפציעה, לא צוין מוות תאי מתרחב באתרים שהיו מחוסנים עם pGR106-ריק (שליטה שלילית). באיור 3A, המייצג את הגנוטיפ של תפוחי האדמה MaR3 (Mastenbroek R3), שני pGR106-משפיעים (E1 ו- E2) לא גרם למוות של תאים. באיור 3Bמוצגת תוצאה חיובית של הקרנת אפקטים ב-Solanum huancabambense 354-1 הפראי; תגובת מוות תאי נצפתה שני pGR106-משפיעים (E1-E3, המייצגים elicitins)28.
איור 1. דוגמאות של חדירה אגרו-אינפילציה בתפוח אדמה וN. benthamiana. צמחים הכוללים (A) גנוטיפ תפוחי אדמה MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana , (C) סולנום ברתוטאי 483-1 ו (D) סולנום rechei 210-5 הסתננו עם תערובת של זן אגרובקטריום AGL1(pVirG) 23 המכיל pBINplus-R3a ו pK7WG2-AVR3a (שליטה חיובית), AGL1(pvirG) (שליטה שלילית), pBINplus-R3a, ושבעה אפקטים (E1-E7). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 2. כימות תגובות לסינון אגרו-סינון. התצלום מראה סולמות ניקוד מייצגים למוות תאי, הנעים בין 0% (ללא תסמינים) ל -100% (מוות תאי משולב). תגובות ביניים נעות בין תגובות חלשות כגון כלורוזיס לרמות הולכות וגדלות של מוות תאי. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 3. דוגמאות של אגרו-נדיקציה PVX בתפוח אדמה. גנוטיפ תפוחי אדמה MaR3 (Mastenbroek R3) (A) ו Solanum huancabambense 354-1 (B) לקטוף שיניים מחוסן עם pGR106-CRN2 (שליטה חיובית), pGR106-ריק (שליטה שלילית) ו pGR106-E1-2 (אפקטים), או pGR106-E1-E3, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
שולחן 1. מדיום YEB
| 1 ליטר | מזוקק H2O |
| 5 גר' | סוכרוז |
| 5 גר' | תמצית בקר |
| 5 גר' | פפטון בקטריולוגי |
| 1 גרם | תמצית שמרים |
| 2 מ"ל | MgSO4 (1 מ') |
שולחן 2. וקטורים וזנים המשמשים לסינון אגרו-סינון ו-PVX. ניתן להשתמש במספר וקטורים בינאריים. וקטורים ברשימה שלהלן מאפשרים ביטוי גבוה של הגנים המועמדים ועבדו היטב בידינו. אנו מעדיפים להשתמש בזן אגרובקטריום GV3101(pMP90)29 ב N. benthamiana ולמצוא AGL130 המכיל את pVirG פלסמיד עוזר (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 מתאים יותר תפוח אדמה31. זנים נוספים נותחו בקבוצות אחרות על צמחי מודל שונים כולל N. benthamiana אבל לא בתפוח אדמה32.
GW: שער גירסה36
שולחן 3. מדיום MMA.
כוונן את ה- pH ל- 5.6.
Discussion
מבחנים ארעיים כמו אגרואינפילטרציה ואגרואינפטיקציה הן שיטות יעילות החיוניות למחקר הפתולוגי של הצמח המולקולרי המודרני. למרות מגבלות מסוימות, שיטות אלה עונות על הביקוש לניתוח תפקודי יעיל וחזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.
מערכת סינון האגרו-סינון היא בדיקה תפקודית נפוצה במגוון מיני צמחים. Agroinfiltration מקל על אספקת מספר transgenes לאותו תא עם ביטוי בו זמנית של חלבונים אינטראקציה. זה יתרון עבור recapitulating R-AVR יחסים, על ידי חדירת זני אגרובקטריום המבטאים גנים Avr עם זנים המבטאים את הגנים R תואמים. כמו כן, עבור זוגות R-AVR ידועים, חדירות מטבע כאלה יכולות לשמש כפקדים חיוביים. הכללת פקדים כאלה חשובה מכיוון שבכמה גנוטיפים צמחיים, יעילות הטרנספורמציה יכולה להיות מתחת לסף כדי לזהות תגובות. כולל פקדים שליליים, למשל זן אגרובקטריום המכיל וקטור ללא תוסף גנים, הוא גם חיוני כדי לקבוע אם גנוטיפ צמח מסוים מעלה תגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום. תכונה זו מתרחשת בתדירות מסוימת בחיידק תפוחי אדמה, ולא כל מיני סולנום מתאימים היטב למערכת ביטוי זו המבוססת על אגרובקטריום. בדרך כלל, Agroinfiltration assay עובד טוב מאוד N. benthamiana ורוב הגנוטיפים תפוחי אדמה. בנוסף לאפקטורומיקה, ישנם יישומים פוטנציאליים שונים אחרים לטכניקת סינון האגרו-סינון, כגון ייצור חלבונים בטרנגנסים ולוקליזציה של חלבונים בתאי הצמח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
PVX agroinfection היא מערכת סינון רגישה מאוד ובדרך כלל מתאימה יותר להקרנות בתפוקה גבוהה. מאז האגרובקטריום הוא עכשיו רק מקומי נוכח, תגובות לא ספציפיות לחיידק זה הם עכשיו לא מאוד מטריד, כמו וירוס PVX משתלט על התפשטות נוספת של transgene. עם זאת, צמחים עשויים להיות עמידים PVX, או לטעון התנגדות קיצונית (ER) תגובות, ובמקרה זה שיטת agroinfection אינו מתאים. מגבלה נוספת של שיטת האגרו-נדיקציה של PVX היא גודל ההוספה של גן העניין. פנוטיפים שנצפו של תגובות עשויים להשתנות מנמק שחור אינטנסיבי המקיף את הפצע לנמק קלוש ליד נקודת החיסון. בשני המינים N. benthamiana ו Solanum, אגרוין PVX מוכר רגיש יותר מאשר agroinfiltration.
אם ניקח בחשבון כי הרקע הגנטי של גנוטיפים צמחיים שנבדקו מגוונים יכול להיות כמה הגבלות (ראה לעיל), אנו בדרך כלל להשיג מסקנות דומות על ידי אגרואינדיקציה PVX ו agroinfiltration. תוצאות אלה דומות גם כפי שהושגו מבחנים אחרים, כגון חדירות חלבון29 ו ELISA3. בהתחשב ביתרונות ובמגבלות של שתי המערכות, אנו ממליצים להשתמש בשתי השיטות כדי להשלים זו את זו או לאשר תוצאות עצמאיות.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
העבודה נתמכת בחלקה על ידי קרן אוניברסיטת Wageningen (WUF), תוכנית מועצת המלגות של סין לסטודנטים לתארים מתקדמים ומענק NWO-VIDI 12378.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
| Incubator | Infors HT | Multitron II | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |
References
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors. Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).
- Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes. Plos One. 3, 1-10 (2008).
- Oh, S. K., et al. In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2. Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).
- Tyler, B. M., et al. Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis. Science. 313, 1261-1266 (2006).
- Haas, B. J., et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans. Nature. 461, 393-398 (2009).
- Levesque, C. A., et al. Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire. Genome Biol. 11, 1-22 (2010).
- Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. Oomycete genomics: new insights and future directions. FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).
- Stassen, J. H. M., et al. Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing. Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).
- Kemen, E., et al. Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).
- Win, J., et al. Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , Cold Spring Harbor. 1-13 (2012).
- Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).
- Kamoun, S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes. Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).
- van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 122, 101-108 (1997).
- Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. In planta expression of oomycete and fungal genes. Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).
- Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H. In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics. Diversity, Interactions, and Research Tools. Lamour, K., Kamoun, S. 23, 455-475 (2009).
- Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE. J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).
- Lu, R., et al. High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance. EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).
- Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves. Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).
- Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., Ané, J. M., Jiang, J. Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato. Plos One. 4, 1-8 (2009).
- van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).
- Huang, S., et al. Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42, 251-261 (2005).
- Armstrong, M. R., et al. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).
- Kim, H. J., et al. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes. Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).
- Torto, T. A., et al. EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora. Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum. Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).
- Koncz, C., Schell, J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary. Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).
- Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).
- Rietman, H. Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , Wageningen University. (2011).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- van engelen, F. A., et al. pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).
- Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. A mini binary vector series for plant transformation. Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).
- Curtis, M. D., Grossniklaus, U. A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).
