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Biology

आलू और निकोटियाना बेंथामियाना में एग्रोइंट्रिकेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन

Published: January 3, 2014 doi: 10.3791/50971
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Wageningen UR Plant Breeding, Wageningen University, 2Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Huazhong Agricultural University, Ministry of Education, National Centre for Vegetable Improvement (Central China), Potato Engineering and Technology Research Centre of Hubei Province, Huazhong Agricultural University

Summary

एग्रोइनफिल्ट्रेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन पौधों में जीन की क्षणिक एक्टोपिक अभिव्यक्ति के लिए नियमित कार्यात्मक परख हैं। ये विधियां प्रभावरोक्रॉमिक्स रणनीतियों (तेजी से प्रतिरोध और एविबुलेंस जीन खोज) में कुशल परख हैं और आणविक संयंत्र विकृति में आधुनिक अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे पौधों में मजबूत उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक विश्लेषण की मांग को पूरा करते हैं।

Abstract

एग्रोइनफिल्ट्रेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन पौधों में उम्मीदवार जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए दो कुशल क्षणिक अभिव्यक्ति परखते हैं। एग्रोइनफर्टेशन के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला एजेंट एग्रोबैक्टीरियम टमेफैपियंस है, जो कई डिकॉट पौधों की प्रजातियों का एक रोगजनक है। इसका मतलब यह है कि कृषि कीटाणुयुक्त कई पौधों की प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है। यहां, हम आलू(सोलनम ट्यूबरोसम),इसके संबंधित जंगली कंद-असर सोलनम प्रजातियों (सोलनम खंड पेटोटा)और मॉडल संयंत्र निकोटियाना बेंथामियानाके लिए इन तरीकों को लागू करते समय अपने प्रोटोकॉल और अपेक्षित परिणाम प्रस्तुत करते हैं। एकल जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के अलावा, जैसे प्रतिरोध(आर)याएवीआर (एवीआर)जीन, एग्रोइनफिल्ट्रेशन परख एक ही कोशिका में आर और एवीआर ट्रांसजीन वितरित करके विशिष्ट मेजबान रोगजनक इंटरैक्शन से जुड़े आर-एवीआर इंटरैक्शन को फिर से शुरू करने के लिए बहुत उपयुक्त है। हालांकि, कुछ पौधे जीनोटाइप एग्रोबैक्टीरियमके लिए गैर-विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रियाएं बढ़ा सकते हैं, जैसा कि हमने उदाहरण के लिए कई आलू जीनोटाइप के लिए देखा था। एग्रोइंफिल्ट्रेशन की तुलना में, पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन के साथ एवीआर गतिविधि का पता लगाना अधिक संवेदनशील है, कार्यात्मक स्क्रीन में अधिक उच्च थ्रूपुट और एग्रोबैक्टीरियमके लिए गैर-विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रति कम संवेदनशील है। हालांकि, पीवीएक्स के लिए गैर-विशिष्ट रक्षा हो सकती है और वायरस-प्रेरित चरम प्रतिरोध के कारण प्रतिक्रियाओं को याद करने का जोखिम है। ऐसी सीमाओं के बावजूद, हमारे अनुभव में, एग्रोइनफिल्ट्रेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन दोनों उपयुक्त और पूरक परख हैं जिनका उपयोग एक दूसरे के परिणामों की पुष्टि करने के लिए एक साथ किया जा सकता है।

Introduction

प्रभावरोमिक्स, एक उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक जीनोमिक्स दृष्टिकोण हाल ही में फसल पौधों में प्रतिरोध(आर)जीन की पहचान करने और रोगजनकों केएवीआर (एवीआर)जीन1-4से मेल खाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। आर जीन के साथ अधिक समय लेने वाले स्थिर परिवर्तन के विपरीत, प्रभावमोरोमिक्स रणनीति रोगजनक जीन दृश्यों के क्षणिक परख पर आधारित है।

जीनोमिक्स युग के बाद से, पौधों के रोगजनकों के जीनोम का व्यापक रूप से पता लगाया गया है। उदाहरण के लिए oomycetes के लिए, जिसमें सबसे विनाशकारी पौधे रोगजनक शामिल हैं, दृश्यों के बड़े संग्रह उत्पन्न किए गए हैं और जीन के लिए विश्लेषण किया गया है जो पौधे5-10के साथ बातचीत के दौरान भूमिका निभाते हैं। रोगजनक प्रोटीन का एक वर्ग प्रभावकों का प्रतिनिधित्व करता है, जो मेजबान कोशिका संरचना में हेरफेर करता है और या तो संक्रमण (उग्रता कारकों) को सुविधाजनक बनाने के लिए या रक्षा प्रतिक्रियाओं (avirulence कारकों)11-13को ट्रिगर करने के लिए कार्य करता है। आर जीन युक्त पौधों की कोशिकाओं में एवीआर जीन की अभिव्यक्ति आमतौर पर अतिसंवेदनशील कोशिका मृत्यु प्रतिक्रिया (एचआर)14,15में परिणाम देती है। आर और एवीआर जीन की प्लांटा अभिव्यक्ति में एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफैडियन्सआधारित क्षणिक परिवर्तन (एग्रोइनफर्टेशन)16जैसे क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है । इस क्षणिक परिवर्तन को वायरल अभिव्यक्ति प्रणालियों (एग्रोइंफेक्शन)17,18के संयोजन में भी लागू किया जा सकता है।

एग्रोइनफिल्ट्रेशन के लिए, सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला एजेंट ए. टमेफैपियंस है, जो डिकोट पौधों का एक व्यापक मेजबान रेंज रोगजनक है। A. tumefaciens एक ट्यूमर उत्प्रेरण (Ti) प्लाज्मिड होता है । एक Ti plasmid से डीएनए हस्तांतरण (टी डीएनए) जीवाणु की उग्रता मशीनरी सक्रिय होने के बाद संयंत्र कोशिकाओं में स्थानांतरित हो जाएगा । यह थोड़ा अम्लीय वातावरण19में जारी कम आणविक वजन फेनोलिक यौगिकों और मोनोसाकैराइड्स द्वारा घायल पौधों की कोशिकाओं में ट्रिगर किया जा सकता है। प्रमुख नसों द्वारा परिभाषित पत्ती पैनलों में एग्रोबैक्टीरियम निलंबन की घुसपैठ के बाद उग्रता जीन सक्रिय हो जाता है। फिर पत्ती पैनलों में पौधों की कोशिकाओं को बदल दिया जाएगा और टी-डीएनए क्षेत्र में निहित ट्रांसजीन (ओं) को व्यक्त किया जाएगा।

एग्रोइंफेक्शन घाव-टीका लगाए गए एग्रोबैक्टीरियमपर आधारित है, जो पौधों की कोशिकाओं में वायरस के स्थानांतरण में मध्यस्थता करता है। वायरस तो आगे आसन्न संयंत्र ऊतकों में फैलता है, एग्रोबैक्टीरियमकी अनुपस्थिति में । एग्रोइंफेक्शन के लिए कई प्लांट वायरस का इस्तेमाल किया जा सकता है। आरएनए वायरस जीन अभिव्यक्ति के लिए आदर्श वैक्टर हैं क्योंकि वे संक्रमित पौधों में बहुत उच्च स्तर तक गुणा कर सकते हैं। संयंत्र आरएनए वायरस के बीच, आलू वायरस एक्स (PVX) व्यापक रूप से प्रभावप्रभाव स्क्रीन के लिए प्रयोग किया जाता है। एक डाला जीन के लिए कार्यात्मक परीक्षणों की सुविधा के लिए, बाइनरी वैक्टर जिसमें पीवीएक्स जीनोम फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर और नोलाइन सिंथेस टर्मिनेटर द्वारा घिरा हुआ होता है, को ए tumefaciens20के टी-डीएनए में क्लोन किया गया था। टी-डीएनए को पौधों की कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के बाद, टी-डीएनए में निहित पीवीएक्स जीनोम को 35S प्रमोटर से लिखा जाता है। फिर वायरस के कण संक्रमित पौधों में व्यवस्थित रूप से फैलते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डाला गया जीन की अभिव्यक्ति होती है। एग्रोबैक्टीरियम और पीवीएक्स दोनों पर आधारित इस विधि को पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन कहा जाता है।

यहां हम एग्रोइंटरफर्टेशन और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन परख दोनों के लिए उदाहरण दिखाते हैं। मेजबान पौधों के रूप में हम आलू के जर्मप्लाज्म(सोलनम खंड पेटोटा)का उपयोग करते हैं , जिसके लिए प्रभावरोमिक्स दृष्टिकोण का बीड़ा उठाया गया है और सफल साबित हुआ है3,4. हम निकोटियाना बेंथामियानाका भी उपयोग करते हैं , जो सोलनसियस पौधों में एक मॉडल पौधे के रूप में प्रसिद्ध है14,21,22.

Protocol

1. पौधे उगाने और परीक्षण की स्थिति

  1. 18-22 डिग्री सेल्सियस के तापमान सीमा के भीतर और प्राकृतिक प्रकाश व्यवस्था के तहत या 16 घंटे/8 घंटे दिन/रात शासन के साथ नियंत्रित ग्रीनहाउस या जलवायु कक्षों में पौधों को उगाएं और बनाए रखें । पौधों को अधिक प्रबंधनीय बनाने के लिए एक्सिलरी शाखाओं को हटा दें।
  2. आलू के लिए, मुराशिगे-स्कूग (एमएस) माध्यम (20 ग्राम/एल सुक्रोज, 18 डिग्री सेल्सियस पर जलवायु कक्षों में नियंत्रित परिस्थितियों में विटामिन के साथ 5 जी/एल एमएस लवण, 18 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह के लिए दिन/रात शासन और फिर उन्हें विनियमित ग्रीनहाउस डिब्बों में निष्फल मिट्टी के बर्तन में स्थानांतरित करें ।

2. एग्रोइनफिल्ट्रेशन

  1. पौधे सामग्री:
    निकोटियाना बेंथामियानाके लिए, लगभग 4-5 सप्ताह पुराने बीज उगाए जाने वाले पौधों का उपयोग करें। आलू के लिए, इन विट्रोसे लगभग 4-5 सप्ताह पुराने प्रत्यारोपण का उपयोग करें । घुसपैठ के लिए युवा, स्वस्थ और पूरी तरह से विकसित पत्तियों का चयन करें।
  2. एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति:
    1. पहले से YEB माध्यम तैयार(तालिका 1)। 10 मिलीलीटर YEB माध्यम के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब ों को भरें 1 μl acetosyringone (200 mm), 100 μl MES बफर (2-(एन-मॉर्फोलिनो) -इथेन सल्फोनिक एसिड, 1 एम) और उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक। पाइपेट 20 माइक्रोन ग्लिसरोल स्टॉक वांछित उपभेदों(तालिका 2)(ब्याज के जीन युक्त) YEB में । एक ही समय में इस परख में सभी एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों के लिए संस्कृतियों को शुरू करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए मिलाते हुए और लगभग 1.0 के एक ओडी 600 के लिए200 आरपीएम द्वारा इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    2. 10 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा फसल कोशिकाओं। सुपरनेट को बंद करें और हौसले से बने एमएमए माध्यम(टेबल 3)में गोली को0.3 के ओडी 600 तक फिर से रखें। धीरे-धीरे भंवर कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए। दो बैक्टीरियल उपभेदों के सिक्का के लिए, संस्कृति को 1:1 अनुपात में मिलाएं।
    3. घुसपैठ से पहले 1-6 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बेंच पर संस्कृति छोड़ दें। इस दौरान पौधों को घुसपैठ करने के लिए लेबल करें और प्रयोग की तारीख।
  3. घुसपैठ:
    एग्रोबैक्टीरियम सस्पेंशन में घुसपैठ करने के लिए 1 मिलीलीटर सुईविहीन सिरिंज का इस्तेमाल करें। ध्यान से और धीरे-धीरे सिरिंज से निलंबन के साथ पत्ती पैनलों इंजेक्ट (स्वास्थ्य और सुरक्षा कारणों के लिए इस प्रक्रिया के दौरान आंखों की सुरक्षा पहनी जानी चाहिए)। प्रत्येक तनाव के लिए कम से कम तीन पौधों में घुसपैठ करें। ट्रिपलीकेट के रूप में काम करने के लिए प्रति पौधे तीन पत्तियों का उपयोग करें।
    नोट: आम तौर पर, एन बेंथामियानाके 3 पौधों के लिए एग्रोबैक्टीरियम सस्पेंशन का 1 मिलीलीटर पर्याप्त हो सकता है। आलू के लिए, अधिक निलंबन की आवश्यकता है क्योंकि सोलनम प्रजातियों की पत्तियों में घुसपैठ करना अधिक कठिन होता है। निलंबन की आवश्यक मात्रा सोलनम प्रजातियों पर निर्भर करती है। घुसपैठ के बीच इथेनॉल के साथ दस्ताने बदलने या दस्ताने को स्टरलाइज करके और टीका के बाद दिन तक पौधों को पानी न देकर क्रॉस-संदूषण से बचें।
  4. स्कोरिंग:
    घुसपैठ के लगभग 3 दिन बाद स्थूल प्रतिक्रियाओं को स्कोर करें जब सेल डेथ फेनोटाइप स्पष्ट होता है(चित्रा 1)। यदि सेल डेथ फेनोटाइप मात्रात्मक है, तो दिए गए मानदंडों(चित्र 2) काउपयोग करें। संक्षेप में, सेल डेथ के स्थूल स्कोरिंग के लिए तराजू मुख्य रूप से घुसपैठ क्षेत्र के सेल मृत्यु प्रतिशत पर निर्भर करते हैं । सेल मृत्यु के प्रतिशत को 0% (कोई लक्षण नहीं) से 100% (कॉन्फ्लूंट सेल डेथ) तक के पैमाने पर दर्शाया गया है। मध्यवर्ती प्रतिक्रियाएं सेल मृत्यु के बढ़ते स्तर तक क्लोरोसिस जैसी कमजोर प्रतिक्रियाओं से लेकर। यदि वांछित है, तो आधुनिक फोटो-इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करके स्थूल स्कोरिंग का मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।

3. पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन

  1. पौधे सामग्री:
    एन बेंथामियानाके लिए, लगभग 2-3 सप्ताह पुराने बीज उगाए जाने वाले पौधों का उपयोग करें। आलू के लिए, इन विट्रोसे लगभग 2-3 सप्ताह पुराने प्रत्यारोपण का उपयोग करें । बड़े पैमाने पर परीक्षणों के लिए, थोड़ा पुराने (4-5 सप्ताह) पौधों का उपयोग करें, क्योंकि इन पौधों में एग्रोबैक्टीरियम टीका धब्बे की उच्च संख्या को समायोजित करने के लिए अधिक से अधिक पत्तियां होती हैं।
  2. एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति:
    1. वाईबी माध्यम को पहले से तैयार करें। उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक 3 मिलीलीटर YEB के साथ 10 मिलीलीटर ट्यूब भरें। पाइपेट 20 माइक्रोन ग्लिसरोल स्टॉक वांछित उपभेदों(तालिका 2)(ब्याज के जीन युक्त) YEB में । एक ही समय में इस परख में सभी एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों के लिए संस्कृतियों को शुरू करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए मिलाते हुए और लगभग 1.0 के एक ओडी 600 के लिए200 आरपीएम द्वारा इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    2. प्रत्येक एग्रोबैक्टीरियम तनाव के बारे में 300 माइक्रोन पिपेट करें और उन्हें 1-2 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं और इनक्यूबेट कोशिकाओं के साथ पूरक एलबी सॉलिड एगर मीडियम प्लेटों पर फैलाएं।
  3. संक्रमण:
    थाली में एग्रोबैक्टीरियम कल्चर को इकट्ठा करने के लिए स्पैटुला का इस्तेमाल करें। स्पैटुला पर एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति में लकड़ी के टूथपिक को डुबोएं और पत्तियों को बड़ी मात्रा में बैक्टीरिया को टीका लगाने के लिए छेदें। प्रत्येक तनाव के लिए कम से कम तीन पौधों को टीका लगाएं। ट्रिपलीकेट के रूप में काम करने के लिए प्रति पौधे तीन पत्तियों का उपयोग करें। प्रत्येक पत्ते में, प्रत्येक तनाव के लिए कई टीका साइटें बनाएं।
  4. स्कोरिंग:
    टीका लगाने के दो सप्ताह बाद स्थूल प्रतिक्रियाओं को स्कोरकरें (चित्रा 3)। उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के लिए, प्रत्येक टीका स्थान के लिए गुणात्मक प्रतिक्रियाओं (हां/नहीं) को रिकॉर्ड करें। फिर प्रतिक्रिया साइटों के प्रतिशत की गणना करें और नियंत्रण के साथ उनकी तुलना करें।

Representative Results

चित्रा 1 आलू और एन बेंथामियाना में 7 विभिन्न प्रभावकों (E1-E7) के साथ कृषि संबंधी एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाता है। घुसपैठ के करीब 3 दिन बाद घुसपैठ किए गए पत्ते के पैनलों में सेल डेथ दिखाई देती है। सेल डेथ फेनोटाइप की सीमा की तुलना नियंत्रण से की जानी चाहिए। एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन AGL1 (pVirG)23 जिसमें पीबीआईएनप्लस-आर3ए और pK7WG2-AVR3a का मिश्रण सकारात्मक नियंत्रण24,25के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जबकि AGL1 (pVirG) को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। आंकड़े 1 ए और 1बी आलू जीनोटाइप MaR8 (Mastenbroek R8)26 और एन बेंथामियानामें कृषि संबंधी अच्छे उदाहरण दिखाते हैं, जो कृषि के लिए बहुत उत्तरदायी हैं। सकारात्मक नियंत्रण के साथ पत्ती पैनल सिक्का में कॉन्फ्लोट्यूट सेल डेथ होती है, जबकि कोई सेल डेथ रिस्पॉन्स निगेटिव कंट्रोल या पीबीआईएनप्लस-आर3ए के साथ नहीं होता है । MaR8 में, दो प्रभावक AVR3a (E2) और AVR4 (E3) एक सेल मौत को प्रेरित करते हैं, जबकि अन्य प्रभावक (E1 और E4-E7) नहीं करते हैं । एन बेंथामियाना में, परीक्षण किए गए प्रभावकों में से कोई भी सेल डेथ रिस्पांस को प्रेरित नहीं करता है । आंकड़े 1C और 1D जंगली आलू सोलनम बर्थॉल्टी 483-1 और सोलनम रेचेई 210-5 में कृषि कीटाणुशोधक के उदाहरण दिखाते हैं, जो कृषिफिल्ट्रेशन तकनीक के लिए अच्छी तरह से उत्तरदायी नहीं हैं। एस बर्थॉल्टी 483-1 में, पत्ती के ऊतक नकारात्मक नियंत्रणों के साथ-साथ सभी परीक्षण प्रभावकों के लिए एक गैर-विशिष्ट परिगलन दिखाता है। एस रेचेई 210-5 में, घुसपैठ वाले पत्ती पैनल सकारात्मक नियंत्रण के लिए बहुत कमजोर सेल डेथ रिस्पांस दिखाते हैं।

चित्रा 2 स्कोरिंग तराजू की एक श्रृंखला दिखाता है जिसका उपयोग एग्रोइनफिल्टेड एग्रोबैक्टीरियमकी प्रतिक्रिया को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। सेल मृत्यु के प्रतिशत को 0-100% पैमाने पर दर्शाया गया है। मनाया फेनोटाइप मैक्रोस्कोप से नहीं दिखाई लक्षण (0%), मध्यवर्ती प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से क्लोरोसिस और सेल मौत के बढ़ते स्तर को प्रदर्शित करने से लेकर, कॉन्फ्लूंट सेल डेथ (१००%) तक ।

चित्रा 3 आलू में पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन के बाद एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाता है। आम तौर पर, सेल मौत का विस्तार दांत लेने टीका के बाद के बारे में दो सप्ताह साइटों पर पाया जा सकता है । जैसा कि दोनों फिगर पैनलों में दिखाया गया है, सेल डेथ का विस्तार उन साइटों पर मौजूद है जो pGR106-CRN2 (प्रभावकार क्रिंकलर सीआरएन 2) का उपयोग करके सकारात्मक नियंत्रण के साथ दांत-पिक किए गए थे, जो पी इनफेस्ट्रान27से जीन को उत्प्रेरित करने वाली एक सामान्य सेल मृत्यु है। घायल करने के लिए मामूली प्रतिक्रिया के अलावा, कोई विस्तार सेल मौत साइटों है कि दांत थे pGR106-खाली (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ टीका लगाने पर उल्लेख किया है । चित्रा 3Aमें, आलू जीनोटाइप MaR3 (Mastenbroek R3) का प्रतिनिधित्व, दो pGR106-प्रभावक (E1 और E2) सेल मौत प्रेरित नहीं किया । चित्रा 3 बीमें, जंगली सोलनम ह्यूनबाम्बेंस 354-1 में प्रभावक स्क्रीनिंग का सकारात्मक परिणाम प्रस्तुत किया गया है; सेल डेथ रिस्पांस दो pGR106-प्रभावकों (E1-E3, elicitins का प्रतिनिधित्व)28को देखा गया था ।

Figure 1
चित्रा 1. आलू और एन बेंथामियाना में कृषि के उदाहरण। (A)एक आलू जीनोटाइप MaR8 (Mastenbroek R8),(B) एन बेंथामियाना,(सी) सोलनम berthaultii 483-1 और (डी) Solanum rechei 210-5 सहित पौधों को एक मिश्रण के साथ घुसपैठ की गई एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन AGL1 (pVirG) 23 जिसमें पीबीआईएनप्लस-आर3ए और pK7WG2-AVR3a (सकारात्मक नियंत्रण), AGL1 (pvirG) (नकारात्मक नियंत्रण), pBINplus-R3a, और सात प्रभावक (E1-E7) । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। कृषि फाइलिंग प्रतिक्रियाओं का मात्राकरण। तस्वीर सेल मौत के लिए प्रतिनिधि स्कोरिंग तराजू से पता चलता है, 0% (कोई लक्षण) से लेकर १००% (कंफ्लूएंंट सेल मौत) । मध्यवर्ती प्रतिक्रियाएं सेल मृत्यु के बढ़ते स्तर तक क्लोरोसिस जैसी कमजोर प्रतिक्रियाओं से लेकर। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3। आलू में पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन के उदाहरण। आलू जीनोटाइप MaR3 (Mastenbroek R3)(ए)और Solanum huancabambense 354-1(बी)दांत लेने pGR106-CRN2 (सकारात्मक नियंत्रण), pGR106-खाली (नकारात्मक नियंत्रण) और pGR106-E1-2 (प्रभावक), या pGR106-E1-E3, क्रमशः के साथ टीका । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1. येब माध्यम

1 एल आसुत एच2ओ
5 ग्राम इक्षु शर्करा
5 ग्राम बीफ निकालने
5 ग्राम जीवाणु पेप्टोन
1 ग्राम खमीर निकालने
2 मिलीलीटर एमजीएसओ4 (1 मीटर)

तालिका 2. कृषि और पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले वैक्टर और उपभेद। कई बाइनरी वैक्टर का उपयोग किया जा सकता है। नीचे दी गई सूची में वैक्टर उम्मीदवार जीन की उच्च अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं और हमारे हाथों में अच्छी तरह से काम किया है। हम एन बेंथामियाना में एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन GV3101 (pMP90)29 का उपयोग करना पसंद करते हैं और आलू31 में सहायक प्लाज्मिड पीविर्ग (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 अधिक उपयुक्त AGL130पाते हैं। एन बेंथामियाना सहित विभिन्न मॉडल संयंत्रों पर अन्य समूहों में अतिरिक्त उपभेदों का विश्लेषण किया गया है लेकिन आलू32में नहीं .

Table 2

GW: गेटवे संस्करण36

तालिका 3. एमएमए माध्यम।
Table 3

पीएच को 5.6 पर समायोजित करें।

Discussion

कृषि कीटाणुशोधन और कृषि कीटाणुशोधन जैसे क्षणिक परख कुशल तरीके हैं जो आधुनिक आणविक संयंत्र विकृति अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं। कुछ सीमाओं के बावजूद, ये विधियां पौधों में कुशल और मजबूत उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक विश्लेषण की मांग को पूरा करती हैं।

कृषि निगम प्रणाली पौधों की प्रजातियों की एक श्रृंखला में एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली कार्यात्मक परख है। एग्रोइनफिल्ट्रेशन कई ट्रांसजीन को एक ही कोशिका में वितरण की सुविधा प्रदान करता है जिसमें एक साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति होती है। यह आर-एवीआर संबंधों को फिर से शुरू करने के लिए फायदे वाला है, कॉइनफिल्टिंग एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों द्वारा जो मिलान आर जीन को व्यक्त करने वाले उपभेदों के साथ एवीआर जीन को व्यक्त करते हैं। इसके अलावा, ज्ञात आर-एवीआर जोड़े के लिए, इस तरह के कॉइनफिल्ट्रेशन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है। इस तरह के नियंत्रण शामिल महत्वपूर्ण है क्योंकि कुछ संयंत्र जीनोटाइप में, परिवर्तन दक्षता प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए दहलीज से नीचे हो सकता है । नकारात्मक नियंत्रण सहित, उदाहरण के लिए एक जीन डालने के बिना वेक्टर युक्त एग्रोबैक्टीरियम तनाव, यह निर्धारित करने के लिए भी आवश्यक है कि क्या एक निश्चित पौधे जीनोटाइप एग्रोबैक्टीरियमके लिए गैर-विशिष्ट रक्षा प्रतिक्रियाएं उठाता है या नहीं। यह सुविधा आलू के जर्मप्लाज्म में एक निश्चित आवृत्ति पर होती है, और सभी सोलनम प्रजातियां इस एग्रोबैक्टीरियम-आधारितअभिव्यक्ति प्रणाली के लिए अच्छी तरह से उपयुक्त नहीं हैं। आम तौर पर, एग्रोइनफिल्ट्रेशन परख एन बेंथामियाना और अधिकांश आलू जीनोटाइप में बहुत अच्छी तरह से काम करती है। प्रभावमोक्रिया के अलावा, एग्रोइंफिल्ट्रेशन तकनीक के लिए विभिन्न अन्य संभावित अनुप्रयोग हैं, जैसे ट्रांसजीन से प्रोटीन का उत्पादन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पौधों की कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण।

पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन एक बेहद संवेदनशील स्क्रीनिंग सिस्टम है और आमतौर पर हाई-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अधिक उपयुक्त है। चूंकि एग्रोबैक्टीरियम अब केवल स्थानीय रूप से मौजूद है, इसलिए इस जीवाणु के लिए गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाएं अब बहुत परेशान नहीं हैं, क्योंकि पीवीएक्स वायरस ट्रांसजीन के आगे फैल जाता है। हालांकि, पौधे पीवीएक्स, या माउंट एक्सट्रीम रेजिस्टेंस (ईआर) प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिरोधी हो सकते हैं, और उस स्थिति में एग्रोइंफेक्शन विधि उपयुक्त नहीं है। पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन विधि की एक और सीमा ब्याज के जीन का डालने का आकार है। प्रतिक्रियाओं के मनाया फेनोटाइप घाव के आसपास के एक तीव्र काले परिगलन से भिंन हो सकते हैं टीका स्थान के पास बेहोश परिगलन के लिए। एन बेंथामियाना और सोलनम दोनों प्रजातियों में, पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन को एग्रोइनफिल्टेशन की तुलना में अधिक संवेदनशील माना जाता है।

ध्यान में रखते हुए कि विविध परीक्षण संयंत्र जीनोटाइप की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में कुछ प्रतिबंध हो सकते हैं (ऊपर देखें), हम आम तौर पर पीवीएक्स एग्रोइंफेक्शन और एग्रोइनफिल्ट्रेशन द्वारा समान निष्कर्ष प्राप्त करते हैं। इन परिणामों को अन्य परख में प्राप्त के रूप में भी तुलनीय हैं, जैसे प्रोटीन घुसपैठ29 और एलिसा3। दोनों प्रणालियों के फायदों और सीमाओं को ध्यान में रखते हुए, हम दोनों तरीकों का उपयोग करने के लिए या तो एक दूसरे के पूरक या स्वतंत्र परिणामों की पुष्टि करने की सलाह देते हैं ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

काम आंशिक रूप से Wageningen विश्वविद्यालय कोष (WUF), स्नातक छात्रों के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद कार्यक्रम, और एक NWO-VIDI अनुदान १२३७८ द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beef extract Sigma-Aldrich B4888
Bacteriological peptone Oxoid LP0037
Yeast extract Oxoid LP0021
MgSO4 Sigma-Aldrich 208094
MS salts (without vitamins) Duchefa Biochemie M0221
MES Duchefa Biochemie M1503
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
Syringe (1 ml) BD Plastipak 300013
Incubator Infors HT Multitron II
Centrifuge Heraeus Multifuge 3S-R
Spectrophotometer Eppendorf Biophotometer 6131

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Du, J., Rietman, H., Vleeshouwers, V. G. A. A. Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (83), e50971, doi:10.3791/50971 (2014).

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