Summary
Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.
Abstract
Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki aday genlerin fonksiyonel analizi için iki etkili geçici ifade tahlilleridir. Agroinfiltrasyon için en sık kullanılan ajan, birçok dikot bitki türünün patojeni olan Agrobacterium tumefaciens'tir. Bu, agroinfiltrasyonun birçok bitki türüne uygulanabileceği anlamına gelir. Burada, bu yöntemleri patatese (Solanum tuberosum), ilgili yabani yumru taşıyan Solanum türlerine (Solanum bölümü Petota) ve model bitki Nicotiana benthamiana' ya uygularken protokollerimizi ve beklenen sonuçları sunuyoruz. Direnç (R) veya avirulence(Avr) genleri gibi tek genlerin fonksiyonel analizine ek olarak, agroinfiltrasyon tahlili, R ve Avr transgenes'i aynı hücreye teslim ederek belirli konak patojen etkileşimleriyle ilişkili R-AVR etkileşimlerini yeniden yakalamak için çok uygundur. Bununla birlikte, bazı bitki genotipleri Agrobacterium'a spesifik olmayan savunma yanıtları örneğin birkaç patates genotipi için gözlemlediğimiz gibi yükseltebilir. Agroinfiltrasyon ile karşılaştırıldığında, PVX agroinfection ile AVR aktivitesinin tespiti daha hassastır, fonksiyonel ekranlarda daha yüksek verim ve Agrobacterium'aspesifik olmayan savunma yanıtlarına karşı daha az hassastır. Bununla birlikte, PVX'e spesifik olmayan savunma oluşabilir ve virüs kaynaklı aşırı direnç nedeniyle yanıtları kaçırma riski vardır. Bu sınırlamalara rağmen, deneyimlerimize göre, agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, birbirlerinin sonuçlarını doğrulamak için aynı anda kullanılabilecek hem uygun hem de tamamlayıcı testlerdir.
Introduction
Effectoromics, yüksek verimli fonksiyonel genomik yaklaşım son zamanlarda mahsul bitkilerinde direnç (R) genlerini ve patojenlerin eşleşen avirulence(Avr) genlerini tanımlamak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır1-4. R genleri ile daha fazla zaman alan kararlı dönüşümün aksine, efekoromik stratejisi patojen gen dizilerinin geçici testlerine dayanmaktadır.
Genomik dönemden bu yana, bitki patojenlerinin genomları yaygın olarak araştırılmaktadır. Örneğin, en yıkıcı bitki patojenlerini içeren oomycetes için, bitki ile etkileşim sırasında rol oynayan genler için büyük dizi koleksiyonları oluşturulmuş ve analiz edilmiştir5-10. Patojen proteinlerinin bir sınıfı, enfeksiyonu (virülans faktörleri) kolaylaştırmak veya savunma yanıtlarını (avirulence faktörleri) tetiklemek için konak hücre yapısını ve işlevini manipüle eden efektörleri temsil eder11-13. R genleri içeren bitki hücrelerinde Avr genlerinin ekspresy ekspresyotiği genellikle aşırı duyarlı hücre ölüm yanıtı (HR)14,15ile sonuçlanır. R ve Avr genlerinin planta ifadesinde Agrobacterium tumefaciensgibi geçici ekspresyon sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir - tabanlı geçici dönüşüm (agroinfiltrasyon)16. Bu geçici dönüşüm viral ekspresyon sistemleri (agroinfection)17,18ile birlikte de uygulanabilir.
Agroinfiltrasyon için, en sık kullanılan ajan, dikot bitkilerinin geniş bir konak aralığı patojeni olan A . tumefaciens'tir. A . tumefaciens tümör indükleyen (Ti) plazmid içerir. Bir Ti plazmidinden DNA (T-DNA) transferi, bakterinin virülans makineleri aktive edildikten sonra bitki hücrelerine yerleştirilecektir. Bu, hafif asidik bir ortamda salınan düşük moleküler ağırlıklı fenolik bileşikler ve monoakkaritler tarafından yaralı bitki hücrelerinde tetiklenebilir19. Virülans geni, Agrobacterium süspansiyonlarının ana damarlar tarafından tanımlanan yaprak panellerine sızması sonrasında aktive edilir. Daha sonra yaprak panellerindeki bitki hücreleri dönüştürülecek ve T-DNA bölgesinde bulunan transgene(ler) ifade edilecektir.
Agroinfection, bir virüsün bitki hücrelerine nakline aracılık eden yara aşılanmış Agrobacterium'a dayanır. Virüs daha sonra Agrobacteriumyokluğunda bitişik bitki dokularına daha da yayılır. Agroinfection için birkaç bitki virüsü kullanılabilir. RNA virüsleri gen ekspresyörü için ideal vektörlerdir çünkü enfekte bitkilerde çok yüksek seviyelere çarpabilirler. Bitki RNA virüsleri arasında, Patates Virüsü X (PVX) efekoromik ekranlar için yaygın olarak kullanılır. Eklenen bir gen için fonksiyonel testleri kolaylaştırmak için, Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü ve nopalin sintans terminatörü tarafından kuşatılan PVX genomu içeren ikili vektörler, A. tumefaciens20'ninT-DNA'sına klonlandı. T-DNA bitki hücrelerine aktarıldıktan sonra, T-DNA'da bulunan PVX genom 35S promotöründen yazıya dökülür. Daha sonra virüs parçacıkları enfekte bitkilerde sistemik olarak yayılır ve eklenen genin ekspresykülü ile sonuçlanır. Hem Agrobacterium hem de PVX'e dayanan bu yönteme PVX agroinfection denir.
Burada hem agroinfiltrasyon hem de PVX agroinfection tahlilleri için örnekler gösteriyoruz. Konak bitkiler olarak, efekoromik yaklaşımların öncülük edildiği ve başarılı olduğu kanıtlanmış patates germplasm(Solanum bölümü Petota)kullanıyoruz3,4. Biz de kullanırız Nicotiana benthamiana, Solanaceous bitkilerinde bir model bitki olarak ünlüdür14,21,22.
Protocol
1. Bitki Yetiştirme ve Test Koşulları
- Bitkileri 18-22 °C sıcaklık aralığında ve doğal ışık rejimi altında veya 16 saat/8 saat gündüz/gece rejimi ile kontrollü seralarda veya iklim odalarında yetiştirin ve bakımını sağlayın. Bitkileri daha yönetilebilir hale getirmek için aksiller dalları çıkarın.
- Patates için, Murashige-Skoog (MS) ortamı (20 g/L sakkaroz) içeren steril plastik kavanozlarda in vitro plantletleri muhafaza edin, 5 g/L MS vitaminli tuz, 8 g/L agar, pH 5.8) 18 °C'deki iklim odalarında kontrollü koşullarda iki hafta boyunca 16 saat/8 saat gündüz/gece rejimi ile ve daha sonra düzenlenmiş sera bölmelerinde sterilize edilmiş toprak saksılara aktarın.
2. Agroinfiltrasyon
- Bitki malzemesi:
Nicotiana benthamianaiçin, yaklaşık 4-5 haftalık tohum yetiştirilen bitkileri kullanın. Patates için, in vitrodanyaklaşık 4-5 haftalık nakiller kullanın. Sızmalar için genç, sağlıklı ve tamamen gelişmiş yaprakları seçin. -
Agrobakteri kültürü:
- YEB ortamını önceden hazırlayın (Tablo 1). 50 ml'lik tüpleri 1 μl asetosyringon (200 mM), 100 μl MES tamponu (2-(N-morpholino)-etan sülfik asit, 1 M) ve uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 10 ml YEB ortamı ile doldurun. Yeb içine istenen suşların pipet20μl gliserol stoku ( Tablo 2 ) (ilgi genini içeren). Bu testteki tüm Agrobacterium suşları için kültürleri aynı anda başlatın. Hücreleri 28 °C ve 200 rpm'de 1-2 gün boyunca yaklaşık 1.0'ın OD600'üne sallayarak kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatant dökün ve peleti taze yapılmış MMA ortamında ( Tablo 3 )0.3'ünOD600'üne yeniden harcayın. Onları yeniden diriltmek için hafifçe girdap hücreleri. İki bakteri suşunun coinfiltrasyonunu için kültürü 1:1 oranında karıştırın.
- Sızmalardan önce kültürü oda sıcaklığında 1-6 saat boyunca tezgahta bırakın. Bu arada, sızılacak bitkileri ve deney tarihini etiketleyin.
- Sızmalar:
Agrobacterium süspansiyonlarına sızmak için 1 ml iğnesiz şırınga kullanın. Şırıngan süspansiyonları ile yaprak panelleri dikkatlice ve yavaşça enjekte edin (sağlık ve güvenlik nedenleriyle bu işlem sırasında göz koruması giyilmelidir). Her suş için en az üç bitkiye sız. Üç taraflı olarak hizmet etmek için bitki başına üç yaprak kullanın.
Not: Normalde, 1 ml Agrobacterium süspansiyon s 3 N. benthamianabitkisi için yeterli olabilir. Patates için daha fazla süspansiyona ihtiyaç vardır, çünkü Solanum türlerinin yapraklarına sızmak daha zordur. Gerekli süspansiyon hacimleri Solanum türlerine bağlıdır. Eldivenleri değiştirerek veya eldivenleri sızmalar arasında etanol ile sterilize ederek ve aşıdan sonraki güne kadar bitkileri sulamayarak çapraz kontaminasyondan kaçının. - Puanlama:
Hücre ölümü fenotipi net olduğunda sızmadan yaklaşık 3 gün sonra makroskopik yanıtlar puanlama(Şekil 1). Hücre ölümü fenotipi nicel ise, verilen kriterleri kullanın (Şekil 2). Kısaca, hücre ölümünün makroskopik olarak puanlama ölçekleri esas olarak sızılan bölgenin hücre ölüm yüzdelerine bağlıdır. Hücre ölüm yüzdeleri %0 (semptomsuz) ile %100 (birikmiş hücre ölümü) arasında bir ölçekte tasvir edilir. Ara yanıtlar kloroz gibi zayıf yanıtlardan artan hücre ölümü seviyelerine kadar uzanır. İstenirse, makroskopik puanlama modern fotoğraf görüntüleme ekipmanı kullanılarak nicel olarak da değerlendirilebilir.
3. PVX Agroinfection
- Bitki malzemesi:
N. benthamianaiçin, yaklaşık 2-3 haftalık tohum yetiştirilen bitkileri kullanın. Patates için, in vitrodanyaklaşık 2-3 haftalık nakiller kullanın. Büyük ölçekli testler için, biraz daha eski (4-5 hafta) bitkiler kullanın, çünkü bu bitkiler daha fazla sayıda Agrobacterium aşı lekesini barındırmak için daha fazla ve daha büyük yapraklara sahiptir. -
Agrobacterium kültürü:
- YEB ortamını önceden hazırlayın. 10 ml'lik tüpleri uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 3 ml YEB ile doldurun. Yeb içine istenen suşların pipet20μl gliserol stoku ( Tablo 2 ) (ilgi genini içeren). Bu testteki tüm Agrobacterium suşları için kültürleri aynı anda başlatın. Hücreleri 28 °C ve 200 rpm'de 1-2 gün boyunca yaklaşık 1.0'ın OD600'üne sallayarak kuluçkaya yatırın.
- Pipet her Agrobacterium suşunun yaklaşık 300 μl'si ve bunları uygun antibiyotiklerle desteklenmiş LB katı agar orta plakalarına yayın ve 28 °C'de 1-2 gün boyunca hücreleri kuluçkaya yatır.
- Enfeksiyon:
Tabakta Agrobacterium kültürünü toplamak için bir spatula kullanın. Spatula üzerindeki Agrobacterium kültürüne ahşap bir kürdan batırın ve çok miktarda bakteri aşılamak için yaprakları delin. Her suş için en az üç bitki aşılayın. Üç taraflı olarak hizmet etmek için bitki başına üç yaprak kullanın. Her yaprakta, her suş için birden fazla aşılama bölgesi yapın. - Puanlama:
Aşılamadan yaklaşık iki hafta sonra makroskopik yanıtlar puanlama(Şekil 3). Yüksek aktarım hızına sahip ekranlar için, her aşı noktası için nitel yanıtları (evet/hayır) kaydedin. Ardından yanıt veren sitelerin yüzdesini hesaplayın ve bunları denetimlerle karşılaştırın.
Representative Results
Şekil 1 patates ve N. benthamiana'da 7 farklı efektör (E1-E7) ile agroinfiltrasyonun temsili bir deneyini göstermektedir. Hücre ölümü, sızmadan yaklaşık 3 gün sonra sızan yaprak panellerinde görülür. Hücre ölümü fenotipinin kapsamı kontrollerle karşılaştırılmalıdır. PBINplus-R3a ve pK7WG2-AVR3a içeren Agrobacterium strain AGL1(pVirG)23 karışımı pozitif kontrol24,25, AGL1 (pVirG) ise negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Şekil 1A ve 1B patates genotipi MaR8 (Mastenbroek R8)26 ve N. benthamiana, sırasıyla, agroinfiltrasyon için çok uygun olan agroinfiltrasyon iyi örnekler göstermektedir. Pozitif kontrol ile çakışan yaprak panelinde birikmiş hücre ölümü bulunurken, negatif kontrol veya pBINplus-R3a ile hücre ölümü yanıtı oluşmaz. MaR8'de, iki efektör AVR3a (E2) ve AVR4 (E3) bir hücre ölümüne neden olurken, diğer efektörler (E1 ve E4-E7) bunu yapmaz. Şekil 1C ve 1D, agroinfiltrasyon tekniği için uygun olmayan yabani patates Solanum berthaultii 483-1 ve Solanum rechei 210-5'teki agroinfiltrasyon örneklerini göstermektedir. S. berthaultii 483-1'de yaprak dokusu negatif kontrollere ve test edilen tüm efektörlere spesifik olmayan bir nekroz gösterir. S. rechei 210-5'te, sızan yaprak panelleri pozitif kontrole karşı çok zayıf hücre ölümü yanıtı gösterir.
Şekil 2, agroinfiltrated Agrobacterium'averilen yanıtı ölçmek için kullanılabilecek bir dizi puanlama ölçeğini göstermektedir. Hücre ölüm yüzdeleri% 0-100 ölçeğinde tasvir edilir. Gözlenen fenotipler makroskopik olarak görünmeyen semptomlardan (%0), kloroz gösteren ve hücre ölüm seviyelerini artıran bir dizi ara yanıttan konfüler hücre ölümüne (%100) kadar değişmektedir.
Şekil 3, patateste PVX agroinfection'dan sonra temsili bir deney göstermektedir. Normalde, diş çekme inoktülasyonundan yaklaşık iki hafta sonra sitelerde hücre ölümünün genişletilmesine rastlanabilir. Her iki şekil panelinde de gösterildiği gibi, pGR106-CRN2 (efektör crinkler Crn2 kullanılarak pozitif kontrol) ile aşılanan diş çekme bölgelerinde hücre ölümünün genişletilmesi mevcuttur, bu da P. infestans27'dengen indükleyen genel bir hücre ölümüdür. Yaralamaya verilen küçük tepkinin yanı sıra, pGR106-boş (negatif kontrol) ile aşılanan diş çekme bölgelerinde genişleyen hücre ölümü belirtilmez. Patates genotipi MaR3'ü (Mastenbroek R3) temsil eden Şekil 3A'da,iki pGR106 etkili (E1 ve E2) hücre ölümünü teşvik etmedi. Şekil 3B'de, vahşi Solanum huancabambense 354-1'de efektör taramasının olumlu bir sonucu sunulmaktadır; hücre ölümü yanıtı iki pGR106 etkiliye (E1-E3, elicitinleri temsil eden)28gözlendi.
Şekil 1. Patates ve N. benthamiana'da agroinfiltrasyon örnekleri. (A) patates genotipi MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 ve (D) Solanum rechei 210-5 dahil olmak üzere bitkilere sızıldı pBINplus-R3a ve pK7WG2-AVR3a (pozitif kontrol), AGL1(pvirG) (negatif kontrol), pBINplus-R3a içeren Agrobacterium strain AGL1(pVirG) 23 karışımı, ve yedi efektör (E1-E7). Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 2. Agroinfiltrasyon yanıtlarının nicelleştirilmesi. Fotoğrafta hücre ölümü için %0 (semptom yok) ile %100 (konfluent hücre ölümü) arasında değişen temsili puanlama ölçekleri göstermektedir. Ara yanıtlar kloroz gibi zayıf yanıtlardan artan hücre ölümü seviyelerine kadar uzanır. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 3. Patateste PVX agroinfection örnekleri. Patates genotipi MaR3 (Mastenbroek R3) (A) ve Solanum huancabambense 354-1(B) pGR106-CRN2 (pozitif kontrol), pGR106-boş (negatif kontrol) ve pGR106-E1-2 (efektörler) veya pGR106-E1-E3 ile aşılanmış diş çekme. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Tablo 1. YEB ortamı
| 1 L | damıtılmış H2O |
| 5 g | Sakaroz |
| 5 g | sığır eti özü |
| 5 g | bakteriyolojik pepton |
| 1 g | maya özü |
| 2 ml | MgSO4 (1 M) |
Tablo 2. Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection için kullanılan vektörler ve suşlar. Birkaç ikili vektör kullanılabilir. Aşağıdaki listedeki vektörler, aday genlerin yüksek oranda ifade olmasına izin verir ve elimizde iyi çalışmıştır. Biz N. benthamiana Agrobacterium suşu GV3101 (pMP90)29 kullanmayı tercih ve yardımcı plazmid pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D) içeren AGL130 bulmak 23 patates31daha uygun. Ek suşlar, N. benthamiana dahil olmak üzere çeşitli model bitkilerde diğer gruplarda analiz edilmiştir, ancak patates32'dedeğildir.
GW: ağ geçidi sürüm36
Tablo 3. MMA ortamı.
pH'ı 5,6'ya ayarlayın.
Discussion
Agroinfiltrasyon ve agroinfection gibi geçici tahliller, modern moleküler bitki patolojisi araştırmaları için hayati önem taşıyan etkili yöntemlerdir. Bazı sınırlamalara rağmen, bu yöntemler tesislerde verimli ve sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılar.
Agroinfiltrasyon sistemi, çeşitli bitki türlerinde yaygın olarak kullanılan işlevsel bir testtir. Agroinfiltrasyon, etkileşime giren proteinlerin eşzamanlı ifadesiyle aynı hücreye birkaç transjenin verilmesini kolaylaştırır. Bu, Avr genlerini ifade eden Agrobacterium suşlarını eşleşen R genlerini ifade eden suşlarla birleştirmekle R-AVR ilişkilerinin yeniden kapsüllanması için avantajlıdır. Ayrıca, bilinen R-AVR çiftleri için, bu tür coinfiltrations pozitif kontroller olarak kullanılabilir. Bu tür denetimlerin dahil edilmesi önemlidir, çünkü bazı bitki genotiplerinde, dönüşüm verimliliği yanıtları algılamak için eşiğin altında olabilir. Negatif kontroller de dahil olmak üzere, örneğin gen kesici ucu olmayan bir vektör içeren bir Agrobacterium suşu, belirli bir bitki genotipinin Agrobacterium'aspesifik olmayan savunma yanıtlarını yükseltip yükseltmediğini belirlemek için de gereklidir. Bu özellik patates germplazmasında belirli bir sıklıkta ortaya çıkar ve tüm Solanum türleri bu Agrobakterimbazlı ifade sistemi için iyi uygun değildir. Genellikle, agroinfiltrasyon tahlilleri N. benthamiana ve çoğu patates genotipinde çok iyi çalışır. Efekoromiklere ek olarak, agroinfiltrasyon tekniği için transgenelerden protein üretimi ve konfokal mikroskopi ile bitki hücrelerinde protein lokalizasyonu gibi çeşitli potansiyel uygulamalar vardır.
PVX agroinfection oldukça hassas bir tarama sistemidir ve genellikle yüksek verimli taramalar için daha uygundur. Agrobacterium artık sadece yerel olarak mevcut olduğundan, PVX virüsü transjenin daha fazla yayılmasını ele aldığından, bu bakteriye spesifik olmayan yanıtlar artık çok rahatsız edici değildir. Bununla birlikte, bitkiler PVX'e karşı dirençli olabilir veya aşırı direnç (ER) yanıtları monte edebilir ve bu durumda agroinfeksiyon yöntemi uygun değildir. PVX agroinfection yönteminin bir başka sınırlaması, ilgi çekici genin kesici uç boyutudur. Gözlenen yanıt fenotipleri, yarayı çevreleyen yoğun siyah nekrozdan aşı noktasının yakınındaki soluk nekroza kadar değişebilir. Hem N. benthamiana hem de Solanum türlerinde, PVX agroinfection agroinfiltrasyondan daha hassas olarak kabul edilir.
Çeşitli test edilmiş bitki genotiplerinin genetik arka planının bazı kısıtlamalara sahip olabileceğini göz önünde bulundurarak (yukarıya bakın), genellikle PVX agroinfection ve agroinfiltrasyon ile benzer sonuçlar elde ediyoruz. Bu sonuçlar, protein infiltrationları29 ve ELISA3gibi diğer tahlillerde elde edildiği gibi karşılaştırılabilir. Her iki sistemin avantajlarını ve sınırlamalarını göz önünde bulundurarak, birbirini tamamlamak veya bağımsız sonuçları onaylamak için her iki yöntemi de kullanmanızı öneririz.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Çalışma kısmen Wageningen Üniversite Fonu (WUF), Çin Lisansüstü Öğrenciler Burs Konseyi Programı ve 12378 NWO-VIDI hibesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
| Incubator | Infors HT | Multitron II | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |
References
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors. Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).
- Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes. Plos One. 3, 1-10 (2008).
- Oh, S. K., et al. In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2. Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).
- Tyler, B. M., et al. Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis. Science. 313, 1261-1266 (2006).
- Haas, B. J., et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans. Nature. 461, 393-398 (2009).
- Levesque, C. A., et al. Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire. Genome Biol. 11, 1-22 (2010).
- Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. Oomycete genomics: new insights and future directions. FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).
- Stassen, J. H. M., et al. Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing. Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).
- Kemen, E., et al. Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).
- Win, J., et al. Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , Cold Spring Harbor. 1-13 (2012).
- Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).
- Kamoun, S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes. Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).
- van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 122, 101-108 (1997).
- Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. In planta expression of oomycete and fungal genes. Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).
- Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H. In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics. Diversity, Interactions, and Research Tools. Lamour, K., Kamoun, S. 23, 455-475 (2009).
- Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE. J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).
- Lu, R., et al. High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance. EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).
- Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves. Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).
- Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., Ané, J. M., Jiang, J. Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato. Plos One. 4, 1-8 (2009).
- van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).
- Huang, S., et al. Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42, 251-261 (2005).
- Armstrong, M. R., et al. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).
- Kim, H. J., et al. Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes. Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).
- Torto, T. A., et al. EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora. Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).
- Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum. Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).
- Koncz, C., Schell, J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary. Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).
- Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).
- Rietman, H. Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , Wageningen University. (2011).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- van engelen, F. A., et al. pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).
- Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. A mini binary vector series for plant transformation. Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).
- Curtis, M. D., Grossniklaus, U. A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).
