Los ganglios linfáticos son los tejidos inmunológicos que orquestan la respuesta inmunitaria y son un objetivo crítico para las vacunas. Los biomateriales se han empleado para dirigirse mejor a los ganglios linfáticos y para controlar la administración de antígenos o adyuvantes. Este papel describe una técnica que combina estas ideas para inyectar partículas biocompatibles del polímero en nodos de linfa.
La generación de respuesta inmune adaptativa se basa en el drenaje eficiente o el tráfico de antígenos a los ganglios linfáticos para el procesamiento y la presentación de estas moléculas extrañas a los linfocitos T y B. Los ganglios linfáticos se han convertido así en objetivos críticos para las nuevas vacunas e inmunoterapias. Una estrategia reciente para apuntar a estos tejidos es la inyección directa de ganglios linfáticos de componentes solubles de la vacuna, y los ensayos clínicos que involucran esta técnica han sido prometedores. También se han investigado varias estrategias de biomateriales para mejorar la focalización de los ganglios linfáticos, por ejemplo, ajustar el tamaño de partícula para un drenaje óptimo de las partículas de la vacuna de biomateriales. En este papel presentamos un nuevo método que combine la inyección directa del nodo de linfa con las partículas biodegradables del polímero que se pueden carcar con el antígeno, el coadyuvante, u otros componentes de la vacuna. En este método las micropartículas poliméricas o nanopartículas se sintetizan mediante un protocolo de doble emulsión modificado que incorpora estabilizadores lipídicos. Las propiedades de las partículas(por ejemplo, tamaño, carga de carga) se confirman mediante difracción láser y microscopía fluorescente, respectivamente. Los ganglios linfáticos de ratón se identifican mediante la inyección periférica de un tinte trazador no tóxico que permite la visualización del sitio de inyección objetivo y la posterior deposición de partículas de polímero en los ganglios linfáticos. Esta técnica permite el control directo sobre las dosis y combinaciones de biomateriales y componentes de la vacuna entregados a los ganglios linfáticos y podría aprovecharse en el desarrollo de nuevas vacunas basadas en biomateriales.
Los ganglios linfáticos (LNs) son los centros de mando del sistema inmunitario. En este sitio inmunológico, las células presentadoras del antígeno priman linfocitos ingenuos contra los antígenos extranjeros específicos para activar inmunorespuestas celulares y humorales. De este modo, las N se han convertido en un objetivo atractivo para la administración de vacunas e inmunoterapias. Desafortunadamente, la mayoría de las estrategias de vacunación resultan en la entrega ineficiente y transitoria de antígenos y adyuvantes al tejido linfoide1. Por lo tanto, los enfoques que mejoran la focalización y la retención de los componentes de la vacuna en las N podrían tener un impacto significativo en la potencia y la eficiencia de las nuevas vacunas.
Una estrategia para sortear el desafío de la focalización de LN que ha demostrado un gran interés en nuevos ensayos clínicos es la inyección directa, intra-LN(i.LN.)2-4. Estos ensayos emplearon la guía por ultrasonido para administrar vacunas a los LN como un procedimiento ambulatorio simple. En comparación con las rutas de inyección periféricas tradicionales, este enfoque resultó en una reducción significativa de la dosis y una mejora de la eficacia en contextos terapéuticos que incluyen alergias y cáncer2-4. Estos estudios emplearon la inyección i.LN. de vacunas solubles(es decir, libres de biomateriales) que fueron rápidamente despejadas por drenaje linfático. Por lo tanto, se administraron múltiples inyecciones, o ciclos de inyecciones múltiples, para lograr estos impresionantes efectos terapéuticos. La retención mejorada en el LN podría aumentar la interacción entre el antígeno y/o las células ayudantes e inmunes, mejorando más lejos la potencia del cebado de la célula inmune. Este potencial está avalar por estudios recientes que muestran que la cinética del antígeno y la administración adyuvante juegan un papel crítico en la determinación de la respuesta inmune específica generada5-7. Además, localizar y minimizar las dosis de medicamentos y vacunas podría reducir o eliminar los efectos sistémicos, como la inflamación crónica.
Los biomateriales han sido ampliamente estudiados para mejorar la potencia y eficiencia de las vacunas1,8,9. La encapsulación o adsorción en los portadores de biomateriales puede proteger físicamente la carga de la degradación y superar las limitaciones de solubilidad. Otra característica notable de los portadores de biomateriales, como las micro o nanopartículas poliméricas, es la capacidad de cocargar varias clases de carga y, posteriormente, liberar estas cargas en intervalos controlados. Sin embargo, una limitación significativa que sigue obstaculizando las vacunas e inmunoterapias de biomateriales in vivo es la focalización ineficiente de las células inmunitarias y el tráfico limitado a los ganglios linfáticos. Por ejemplo, la inyección periférica de vacunas de biomateriales a través de vías convencionales(por ejemplo, intradérmicas, intramusculares) típicamente exhiben una mala focalización de LN, con hasta el 99% del material inyectado permaneciendo en el sitio de inyección4,10. Más recientemente, el tamaño de los portadores de vacunas de biomateriales se ha ajustado para mejorar el tráfico preferencial o el drenaje de estas vacunas a LNs a través del flujo intersticial8,10. Estos avances han llevado a respuestas inmunes celulares y humorales mejoradas, subrayando la importancia de apuntar y de la ingeniería del ambiente del LN para las nuevas vacunas.
Este trabajo presenta un protocolo de vacunación que combina partículas poliméricas estabilizadas por lípidos y la entrega de i.LN. para generar depósitos de vacunas de liberación controlada5,11. Basándose en estudios recientes que emplean técnicas quirúrgicas para i.LN. en ratones6,7,12,13,desarrollamos una estrategia rápida y no quirúrgica para inyectar vacunas biomateriales en animales pequeños5. La combinación de la administración de i.LN. con portadores de vacunas de biomateriales mejoró poderosamente la respuesta de las células T CD8 dentro de los 7 días posteriores a una sola inyección de depósitos de vacunas de liberación controlada5. Una respuesta humoral fuerte(es decir títulos del anticuerpo) también fue generada; ambas mejoras se vincularon a una mayor retención de los componentes de la vacuna en los ganglios linfáticos que fue mediada por la liberación controlada de los portadores de biomateriales. Curiosamente, el tamaño de las partículas de la vacuna alteró el destino de estos materiales una vez en los LN: las partículas a nanoescala mostraron una mayor absorción directa por parte de las células, mientras que las micropartículas más grandes permanecieron en el entorno extracelular de LN y liberaron carga (porejemplo, adyuvante) que fue tomada por las células presentadoras de antígenos residentes en LN5. Estos datos sugieren dos vías que podrían ser explotadas para nuevas vacunas mediante el control del tamaño de los biomateriales inyectados i.LN.
En este artículo se sintetizan partículas de polímeros biodegradables estabilizados en lípidos (micro y nanoescala) utilizando una estrategia de doble emulsión modificada5,11. Las propiedades de las partículas se caracterizan por la difracción láser y la microscopía. Estas partículas se inyectan directamente en los LNs inguinales identificados no quirúrgicamente utilizando un colorante trazador común, no tóxico14. El análisis postinyección de LNs por histología o citometría de flujo se puede utilizar para verificar la distribución de partículas dentro del entorno LN, así como para monitorear la absorción celular y la retención de partículas a lo largo del tiempo. Para los protocolos que detallan el procesamiento histológico y la citometría de flujo, los lectores son referidos a artículos recientes de JoVE e informesde revistas 15-22. Los resultados típicos demuestran la focalización local de LN de estos depósitos que podrían explotarse para lograr respuestas inmunitarias potentes y eficientes o para adaptar la inmunidad a los patógenos diana.
La técnica descrita en este protocolo permite la entrega controlada de vacunas a los LNs y a las células presentadoras del antígeno LN-residentes. La carga encapsulada de biomateriales se puede localizar dentro de la LN, lo que permite la manipulación de las dosis de uno o más tipos de carga entregadas al microambiente de la LN. Se ha demostrado que la localización y liberación controlada de partículas poliméricas genera una potente respuesta inmune celular y humoral a dosis significativamente más bajas que los enfoques convencionales. Además, a través de la manipulación del tamaño del portador de biomateriales, el modo primario de procesamiento celular puede modularse entre la absorción directa de nanopartículas o la liberación de carga extracelular de micropartículas más grandes5. Estos resultados establecen la viabilidad de la entrega de biomateriales i.LN. como plataforma para la administración de vacunas terapéuticas.
La síntesis de partículas de PLGA por evaporación emulsión/disolvente ha sido ampliamente empleada en aplicaciones de administración de fármacos23,24. Por lo tanto, los desafíos potenciales asociados con esta técnica se relacionan principalmente con la identificación y deposición exitosas de vacunas en el sitio objetivo de LN. Aunque el uso del tinte trazador facilita la visualización de los LNs inguinales apuntados, el tamaño y la profundidad de la blanco debajo de la piel son pequeños. Por lo tanto, los autores recomiendan asignar tiempo y ratones para practicar la preparación e inyecciones de ratones. Durante la preparación animal(es decir, el afeitado y la aplicación de depilatorio), se debe tener cuidado de no cortar los ratones en el lado ventral del animal donde el ángulo de la pierna con el abdomen hace que la piel sea más propensa a las lesiones de los cortadores. Además, todos los depilatorios deben eliminarse con agua tibia para evitar que los animales ingieran la crema durante el comportamiento normal de aseo. Para practicar las inyecciones de LN, se puede administrar una mayor concentración de colorante trazador y los animales de práctica pueden ser eutanasiados y luego inyectados varias veces. Después de la inyección, los ratones pueden ser necropsiados y el tamaño de los LN de los animales inyectados se puede comparar con un LN de control no inyectado. Una limitación de esta técnica es el límite físico del volumen de inyección que se puede cargar en la estructura LN. Nuestro protocolo sugiere un volumen de inyección de 10 μl en ratones, aunque otros estudios han reportado volúmenes de inyección más grandes al menos tan altos como 20 μl.13 Sin embargo, la administración directa de vacunas a través de la inyección de i.LN. permite un ahorro dramático de dosis, por lo que la función de estas vacunas generalmente no debe estar limitada por restricciones de volumen.
Como se ha señalado, el cambio de la propiedad física de las partículas (esdecir, el tamaño) es un mecanismo eficaz para alterar la vía o los resultados inducidos por los biomateriales y las cargas encapsuladas en el tejido LN. El protocolo de evaporación de emulsión/disolvente puede modificarse fácilmente para alterar las propiedades físicas o químicas, como la carga o funcionalidad de la superficie, y la tasa de biodegradación/liberación de carga23,24. Por ejemplo, la cinética de liberación se puede ajustar a través de composiciones de polímeros alternativos, y la función de la superficie se puede alterar utilizando composiciones lipídicas modificadas o poli (alcohol vinílico). La carga cargada en partículas puede ser fácilmente manipulada para contener diferentes antígenos o adyuvantes para patógenos diana. La ventaja de este enfoque se logra mediante la combinación de la entrega i.LN. con la liberación local y controlada de carga de biomateriales. Esta sinergia establece una plataforma que puede ser explotada para generar de manera eficiente respuestas inmunes adaptativas utilizando dosis diminutas y con efectos secundarios inespecíficos/sistémicos reducidos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado en parte por la fundación PhRMA y un Premio a la Investigación y Académico de la Universidad de Maryland, College Park. Agradecemos al Prof. Darrell Irvine por el apoyo al trabajo inicial realizado en la finalización de la “Ingenieríain situ del microambiente de los ganglios linfáticos a través de la inyección intranodal de partículas poliméricas liberadoras de adyuvantes”. 5.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |