الغدد الليمفاوية هي الأنسجة المناعية التي تنسق الاستجابة المناعية وهي هدف حاسم لللقاحات. وقد استخدمت المواد الحيوية لاستهداف الغدد الليمفاوية بشكل أفضل والتحكم في تسليم المستضدات أو المساعدين. تصف هذه الورقة تقنية تجمع بين هذه الأفكار لحقن جزيئات البوليمر المتوافقة بيولوجيا في الغدد الليمفاوية.
يعتمد توليد الاستجابة المناعية التكيفية على الصرف الفعال أو الاتجار بالمضاد إلى الغدد الليمفاوية لمعالجة وعرض هذه الجزيئات الغريبة على الخلايا الليمفاوية T و B. وهكذا أصبحت الغدد الليمفاوية أهدافا حاسمة لللقاحات الجديدة و العلاجات المناعية. وتتمثل إحدى الاستراتيجيات الحديثة لاستهداف هذه الأنسجة في حقن العقدة الليمفاوية مباشرة بمكونات اللقاح القابل للذوبان، وكانت التجارب السريرية التي تنطوي على هذه التقنية واعدة. كما تم بحث العديد من استراتيجيات المواد الحيوية لتحسين استهداف العقد الليمفاوية، على سبيل المثال، ضبط حجم الجسيمات للصرف الأمثل لجسيمات لقاح المواد الحيوية. في هذه الورقة نقدم طريقة جديدة تجمع بين حقن العقدة الليمفاوية المباشرة مع جزيئات البوليمر القابلة للتحلل الحيوي التي يمكن أن تكون محملة بمضاد أو المساعد أو مكونات اللقاح الأخرى. في هذه الطريقة يتم تصنيع الجسيمات الدقيقة البوليمرية أو الجسيمات النانوية من خلال بروتوكول مستحلب مزدوج معدل يتضمن مثبتات الدهون. يتم تأكيد خصائص الجسيمات(مثل الحجم وتحميل البضائع) عن طريق الحيود بالليزر والمجهر الفلوري على التوالي. ثم يتم تحديد الغدد الليمفاوية الماوس عن طريق الحقن الطرفي للصبغة التتبع غير السامة التي تسمح التصور من موقع الحقن الهدف وترسب لاحقة من جزيئات البوليمر في الغدد الليمفاوية. وتسمح هذه التقنية بالتحكم المباشر في جرعات وتركيبات المواد الحيوية ومكونات اللقاح التي يتم توصيلها إلى الغدد الليمفاوية ويمكن تسخيرها في تطوير لقاحات جديدة قائمة على المواد الحيوية.
الغدد الليمفاوية (LNs) هي مراكز القيادة في الجهاز المناعي. في هذا الموقع المناعي، مستضد تقديم الخلايا رئيس الخلايا الليمفاوية السذاجة ضد مستضدات أجنبية محددة لتنشيط الاستجابات المناعية الخلوية والفكاهية. وهكذا أصبحت ال LNs هدفا جذابا لإيصال اللقاحات و العلاجات المناعية. لسوء الحظ ، فإن معظم استراتيجيات اللقاح تؤدي إلى تسليم مستضد ومطهرات غير فعالة وعابرة إلى الأنسجة اللمفاوية1. ولذلك يمكن أن يكون للنهج التي تحسن استهداف مكونات اللقاحات والاحتفاظ بها في اللقاحات المضادة للنواة تأثير كبير على فعالية وكفاءة اللقاحات الجديدة.
استراتيجية واحدة للتحايل على التحدي المتمثل في استهداف LN التي أظهرت اهتماما كبيرا في التجارب السريرية الجديدة مباشرة، داخل LN(i.LN.) حقن2-4. استخدمت هذه التجارب إرشادات بالموجات فوق الصوتية لتوصيل اللقاحات إلى LNs كإجراء بسيط للمرضى الخارجيين. بالمقارنة مع طرق الحقن الطرفية التقليدية، أدى هذا النهج إلى تجنيب جرعة كبيرة وتحسين فعالية في السياقات العلاجية بما في ذلك الحساسية والسرطان2-4. استخدمت هذه الدراسات حقن I.LN. من اللقاحات القابلة للذوبان(أي خالية من المواد الحيوية) التي تم تطهيرها بسرعة عن طريق التصريف اللمفاوي. لذلك، حقن متعددة- أو دورات من حقن متعددة- تدار لتحقيق هذه الآثار العلاجية المثيرة للإعجاب. تحسين الاحتفاظ في LN يمكن أن تعزز التفاعل بين مستضد و / أو الخلايا المساعد والمناعية، وزيادة تحسين فعالية فتيلة الخلايا المناعية. ويدعم هذه الإمكانات من الدراسات الحديثة التي تظهر الحركية من مستضد والتسليم المساعد تلعب دورا حاسما في تحديد الاستجابة المناعية المحددة ولدت5-7. وعلاوة على ذلك، فإن توطين الجرعات الدوائية وجرعات اللقاح وتقليلها إلى أدنى حد يمكن أن يقلل أو يزيل الآثار الجهازية، مثل الالتهاب المزمن.
وقد درست المواد الحيوية على نطاق واسع لتعزيز فعالية وكفاءة اللقاحات1،8،9. ويمكن للتغليف أو الامتزاز على ناقلات المواد الحيوية أن يحمي البضائع ماديا من التدهور وأن يتغلب على قيود الذوبان. ومن السمات البارزة الأخرى لحاملات المواد الحيوية، مثل الجسيمات الدقيقة أو النانوية البوليمرية، القدرة على تحميل عدة فئات من البضائع، ثم إطلاق هذه الشحنات على فترات خاضعة للرقابة. ومع ذلك، فإن أحد القيود الكبيرة التي لا تزال تعوق لقاحات المواد الحيوية والمواد المناعية في الجسم الحي هو الاستهداف غير الفعال للخلايا المناعية والاتجار المحدود بالغدد الليمفاوية. على سبيل المثال، الحقن المحيطي للقاحات المواد الحيوية من خلال الطرق التقليدية(مثل داخل الجلد، العضلي) عادة ما تظهر استهداف LN الفقراء، مع ما يصل إلى 99٪ من المواد المحقونة المتبقية في موقع الحقن4،10. وفي الآونة الأخيرة، تم ضبط حجم حاملات اللقاحات ذات المواد الحيوية لتحسين الاتجار التفضيلي بهذه اللقاحات أو تصريفها إلى ال LNs من خلال التدفق الخلالي8,10. وقد أدت هذه التطورات إلى تعزيز الاستجابات المناعية الخلوية والفكاهية، مما يؤكد على أهمية استهداف وهندسة بيئة ال LN للقاحات الجديدة.
تقدم هذه الورقة بروتوكول التطعيم الذي يجمع بين جزيئات البوليمر المثبتة بالدهون وتسليم I.LN. لتوليد مستودعات لقاح الإطلاق الخاضعة للرقابة5,11. بناء على الدراسات الحديثة التي تستخدم التقنيات الجراحية ل I.LN. في الفئران6,7,12,13, وضعنا استراتيجية سريعة وغير جراحية لحقن لقاحات المواد الحيوية فيالحيواناتالصغيرة 5 . الجمع بين تسليم i.LN. مع ناقلات لقاح المواد الحيوية عززت بقوة CD8 استجابة الخلايا التائية في غضون 7 أيام بعد حقنة واحدة من مستودعات لقاح الإطلاق الخاضعة للرقابة5. كما تم توليد استجابة فكاهة قوية(أي تيترز الأجسام المضادة) ؛ وارتبطت كلا التعزيزتين بزيادة الاحتفاظ بمكونات اللقاح في العقد اللمفاوية التي تم التوسط فيها عن طريق الإطلاق المراقب من ناقلات المواد الحيوية. ومن المثير للاهتمام أن حجم جزيئات اللقاح غير مصير هذه المواد مرة واحدة في LNs: أظهرت الجسيمات النانوية امتصاصا مباشرا متزايدا من قبل الخلايا ، في حين بقيت الجسيمات الدقيقة الأكبر في بيئة LN خارج الخلية وأطلقوا الشحنات(على سبيل المثال المساعد) التي تناولها مستضد مقيم في LN يقدم الخلايا5. وتشير هذه البيانات إلى مسارين يمكن استغلالهما للحصول على لقاحات جديدة عن طريق التحكم في حجم المواد الحيوية التي يتم حقنها بال i.LN.
في هذه المقالة يتم تصنيع جزيئات البوليمر القابلة للتحلل الحيوي المستقرة بالدهون (الصغرى والنوانوية) باستخدام استراتيجية مستحلب مزدوجمعدلة 5،11. خصائص الجسيمات تتميز الحيود الليزر والمجهر. ثم يتم حقن هذه الجسيمات مباشرة في LNs الإربية التي تم تحديدها غير جراحيا باستخدام صبغة التتبع الشائعة غير التكسينية14. يمكن استخدام تحليل ما بعد الحقن للشبكات غير الرقمية حسب الأنسجة أو قياس التدفق الخلوي للتحقق من توزيع الجسيمات داخل بيئة LN ، وكذلك لمراقبة امتصاص الخلايا والاحتفاظ بالجسيمات بمرور الوقت. للبروتوكولات التي تفصل المعالجة النسيجية وقياس التدفق الخلوي ، تتم إحالة القراء إلى مقالات JoVE الأخيرة وتقارير المجلات15-22. وتبين النتائج النموذجية استهداف ال LN المحلي لهذه المستودعات التي يمكن استغلالها لتحقيق استجابات مناعية فعالة وفعالة أو لتكييف المناعة لمسببات الأمراض المستهدفة.
وتسمح التقنية الموصوفة في هذا البروتوكول بتوصيل اللقاحات الخاضعة للرقابة إلى ال LNs وخلايا تقديم المستضد المقيم في LN. ويمكن توطين الشحنات المغلفة بالمواد الحيوية داخل ال LN، مما يتيح التلاعب بجرعات نوع أو أكثر من البضائع التي يتم تسليمها إلى البيئة الدقيقة ل LN. وقد ثبت أن التعريب والإطلاق المراقب من جزيئات البوليمر يولد استجابة مناعية خلوية وروح الدعابة قوية بجرعات أقل بكثير من النهج التقليدية. علاوة على ذلك ، من خلال التلاعب بحجم حامل المواد الحيوية ، يمكن تعديل الوضع الأساسي للمعالجة الخلوية بين الإقبال المباشر على الجسيمات النانوية أو إطلاق الشحن خارج الخلية من الجسيمات الدقيقة الأكبر5. وتحدد هذه النتائج جدوى إيصال المواد الحيوية من ال I.LN. كمنصة لإيصال اللقاحات العلاجية.
وقد تم تركيب جزيئات PLGA مستحلب / تبخر المذيبات تستخدم على نطاق واسع في تطبيقات تسليم المخدرات23،24. وبالتالي فإن التحديات المحتملة المرتبطة بهذه التقنية تتعلق في معظمها بنجاح تحديد اللقاحات وترسبها في الموقع المستهدف للN. على الرغم من أن استخدام صبغة التتبع يسهل تصور ال LNs الأربية المستهدفة ، فإن الحجم والعمق المستهدفين تحت الجلد صغيران. وهكذا ، يوصي المؤلفون بتخصيص الوقت والفئران لممارسة إعداد وحقن الفئران. أثناء إعداد الحيوان(أي الحلاقة وتطبيق إزالة الشعر) ، يجب الحرص على عدم قطع الفئران على الجانب البطني للحيوان حيث تجعل زاوية الساق مع البطن الجلد أكثر عرضة للإصابة من المقصات. بالإضافة إلى ذلك، يجب إزالة جميع مزيل الشعر بالماء الدافئ لمنع الحيوانات من تناول الكريم أثناء سلوك الاستمالة العادي. لممارسة حقن LN، يمكن إعطاء تركيز صبغة تتبع أعلى وممارسة الحيوانات يمكن القتل الرحيم، ومن ثم حقنها عدة مرات. يمكن أن تكون نخر الفئران حقن التالية ويمكن مقارنة حجم LNs من الحيوانات المحقونة مع LN السيطرة غير مصححة. أحد قيود هذه التقنية هو الحد المادي لحجم الحقن التي يمكن تحميلها في بنية LN. يقترح بروتوكولنا حجم حقن قدره 10 ميكرولتر في الفئران ، على الرغم من أن دراسات أخرى أبلغت عن أحجام حقن أكبر على الأقل يصل إلى 20 ميكرولتر.13 ومع ذلك ، فإن التسليم المباشر لللقاحات عن طريق حقن I.LN. يسمح بتجنيب الجرعة بشكل كبير لذلك لا ينبغي أن تكون وظيفة هذه اللقاحات محدودة بشكل عام بقيود الحجم.
وكما لوحظ، فإن تغيير الخاصية المادية للجسيمات(أي الحجم) هو آلية فعالة لتغيير المسار أو النتائج الناجمة عن المواد الحيوية والشحنات المغلفة في أنسجة LN. يمكن بسهولة تعديل بروتوكول التبخر المستحلب / المذيبات لتغيير الخصائص الفيزيائية أو الكيميائية مثل الشحنة السطحية أو الوظيفة ، ومعدل التحلل الحيوي / إطلاقالشحنة 23،24. على سبيل المثال، يمكن ضبطها الحركية الإفراج من خلال التراكيب البوليمر البديلة، ويمكن تغيير وظيفة السطح باستخدام التراكيب الدهنية المعدلة أو بولي (الفينيل الكحول). ويمكن بسهولة التلاعب بالشحنة المحملة في جزيئات لاحتواء مستضدات أو مواد مضادة مختلفة لمسببات الأمراض المستهدفة. وتتحقق ميزة هذا النهج من خلال الجمع بين تسليم i.LN. وإطلاق البضائع المحلية الخاضعة للرقابة من المواد الحيوية. هذا التآزر يؤسس منصة التي يمكن استغلالها لتوليد بكفاءة الاستجابات المناعية التكيفية باستخدام جرعات دقيقة ومع انخفاض الآثار الجانبية غير محددة / الجهازية.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة PhRMA وجائزة البحث والباحث من جامعة ماريلاند ، كوليدج بارك. نشكر البروفيسور داريل إيرفين على دعم العمل الأولي الذي تم إجراؤه في الانتهاء من “الهندسةالموقعية للجسم المجهري للعقدة الليمفاوية عن طريق الحقن داخل الأنف لجسيمات البوليمر المساعد”. 5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |