淋巴结是协调免疫反应的免疫组织,是疫苗的关键目标。生物材料已被用于更好地瞄准淋巴结和控制抗原或辅助剂的传递。本文描述了一种将这些想法相结合的技术,将生物相容的聚合物颗粒注入淋巴结。
自适应免疫反应的产生依赖于高效排水或将抗原贩运到淋巴结,以便处理和将这些外来分子呈现给T和B淋巴细胞。因此,淋巴结已成为新疫苗和免疫疗法的关键目标。最近针对这些组织的一项战略是直接注射可溶性疫苗成分的淋巴结,涉及该技术的临床试验很有希望。还研究了几种生物材料战略,以改善淋巴结靶向,例如调整颗粒大小,以最佳排水生物材料疫苗颗粒。本文介绍了一种将直接淋巴结注射与可富含抗原、佐剂或其他疫苗成分的可生物降解聚合物颗粒相结合的新方法。在这种方法中,聚合物微粒或纳米粒子通过结合脂质稳定剂的改性液协议合成。粒子特性(如大小、货物装载)分别通过激光衍射和荧光显微镜得到确认。然后,通过非毒示踪染料的外周注射识别小鼠淋巴结,从而可可视化目标注射部位,并随后在淋巴结中沉积聚合物颗粒。这项技术允许直接控制生物材料和疫苗成分输送到淋巴结的剂量和组合,并可用于开发新的生物材料疫苗。
淋巴结 (LNs) 是免疫系统的指挥中心。在这个免疫学站点,抗原呈现细胞对特定的外来抗原原始天真淋巴细胞,以激活细胞和幽默免疫反应。因此,LN已成为疫苗和免疫疗法的有吸引力的目标。不幸的是,大多数疫苗策略导致低效的,暂时交付抗原和辅助剂淋巴组织1。因此,改进LN疫苗成分的靶向和保留的方法可能对新疫苗的效力和效率产生重大影响。
一种绕过LN靶向挑战的策略,已经显示出对新的临床试验的极大兴趣是直接,LN(lN.)注射2-4。这些试验采用超声波指导,将疫苗输送到LN,作为简单的门诊程序。与传统的外周注射途径相比,这种方法在治疗环境中,包括过敏和癌症2-4,产生了显著的剂量节省和提高疗效。这些研究采用 了lN. 注射可溶性疫苗(即无生物物质疫苗),这些疫苗通过淋巴排泄迅速清除。因此,多次注射 -或多次注射周期 – 被管理,以实现这些令人印象深刻的治疗效果。LN的保留性提高可以增强抗原和/或佐剂与免疫细胞之间的相互作用,进一步提高免疫细胞的启动能力。最近的研究表明,抗原和佐剂输送的动力学在确定产生5-7的特定免疫反应方面起着至关重要的作用,这支持了这一潜力。此外,本地化和尽量减少药物和疫苗剂量可以减少或消除系统性影响,如慢性炎症。
生物材料已广泛研究,以提高疫苗的效力和效率1,8,9。生物材料载体的封装或吸附可以物理保护货物免受降解,并克服溶解性限制。生物材料载体的另一个显著特点,如聚合物微粒或纳米粒子,是能够共装几类货物,然后通过受控间隔释放这些货物。然而,继续阻碍体内生物材料疫苗和免疫疗法的重大 限制是免疫细胞的低效靶向和对淋巴结的贩运有限。例如,通过常规途径(如皮肤内、肌肉内)进行生物材料疫苗的外围注射通常表现出不良的LN靶向,注射地剩余的注射材料高达99%为4,10。最近,生物材料疫苗携带者的规模已调整,以改善这些疫苗的优先贩运或排水到LN通过间歇流动8,10。这些进展提高了细胞和幽默免疫反应,强调了针对LN环境为新疫苗设计的重要性。
本文提出了一个疫苗接种协议,结合脂质稳定的聚合物颗粒和i.LN.交付产生控制释放疫苗库5,11。以最近的研究为基础,采用外科技术为i.LN。在小鼠6,7,12,13,我们开发了一个快速,非手术策略,注射生物材料疫苗的小动物5。结合i.LN.交付与生物材料疫苗载体有力地增强了CD8 T细胞反应后7天内,一次注射控制释放疫苗库5。也产生了强烈的幽默反应(即抗体滴定器):这两种增强都与淋巴结中疫苗成分的保留增加有关,淋巴结是由生物材料载体的控制释放所调解的。有趣的是,疫苗颗粒的大小改变了这些材料的命运一次在LNs:纳米级粒子显示细胞直接吸收增加,而较大的微粒留在细胞外LN环境中,并释放货物(如辅助剂),由LN驻地抗原呈现细胞5。这些数据表明,通过控制注射的i.LN生物材料的大小,可以利用两种途径来获得新疫苗。
本文采用改性液策略5 , 11合成可生物降解脂质稳定聚合物颗粒(微尺度和纳米尺度)。粒子特性的特点是激光衍射和显微镜。然后,这些颗粒被直接注射到非手术识别的内在LN中,使用一种常见的无毒示踪剂染料14。通过组织学或流动细胞学对 LN 进行注射后分析可用于验证 LN 环境中粒子的分布,以及监测颗粒的细胞吸收和保留情况。对于详细的组织学处理和流动细胞测量的协议,读者被引用到最近的JoVE文章和期刊报告15-22。典型结果表明,这些库的局部 LN 目标可被利用来实现有效、高效的免疫反应或为目标病原体量身定做免疫力。
本协议中描述的技术允许将疫苗控制地输送到LN和LN驻地抗原呈现细胞。生物材料封装货物可在 LN 内本地化,从而能够操纵交付给 LN 微环境的一种或多种类型的货物的剂量。聚合物颗粒的本地化和受控释放已被证明能以明显低于传统方法的剂量产生强大的细胞和幽默免疫反应。此外,通过生物材料载体尺寸的操纵,可以在直接吸收纳米粒子或从较大的微粒5释放的细胞外货物之间调节细胞处理的主要模式。这些结果确定了 作为 治疗性疫苗交付平台的生物材料交付的可行性。
乳液/溶剂蒸发合成PLGA颗粒已广泛应用于药物输送应用23,24。因此,与这项技术相关的潜在挑战主要与LN靶点疫苗的成功识别和沉积有关。虽然使用示踪剂染料有助于靶向导入 LN 的可视化,但皮肤下方的目标大小和深度较小。因此,作者建议分配时间和小鼠练习小鼠的制备和注射。在动物准备(即剃须和应用去皮化)时,应注意不要割伤动物腹侧的老鼠,因为腿部与腹部的角度使皮肤更容易受到剪子的伤害。此外,所有脱毛应用温水去除,以防止动物在正常梳妆行为期间摄入奶油。要练习 LN 注射,可以管理更高的示踪剂染料浓度,练习动物可以安乐死,然后多次注射。注射后的小鼠可以被坏死,注射动物的LNs大小可以与未弹出的控制LN进行比较。此技术的一个限制是可加载到 LN 结构中的注射体积的物理限制。我们的协议建议小鼠的注射量为10微克,尽管其他研究报告注射量较大,至少高达20微克。13 然而,通过 i.LN. 注射直接交付疫苗可以大幅减少剂量,因此这些疫苗的功能一般不应受到量限制。
如前所述,改变粒子(即大小)的物理特性是改变生物材料和LN组织中封装货物诱发的通路或结果的有效机制。乳液/溶剂蒸发协议可以很容易地修改,以改变物理或化学性质,如表面电荷或功能,和生物降解/货物释放率23,24。例如,释放动力学可以通过替代聚合物成分进行调整,并且使用改性脂质成分或聚(乙烯基酒精)改变表面功能。装载在颗粒中的货物可以很容易地纵,以包含目标病原的不同抗原或辅助剂。这种方法的优势是通过将 i.LN. 交付与生物材料中货物的局部、可控释放相结合来实现。这种协同作用建立了一个平台,可以利用该平台,利用微量剂量和减少非特异性/系统副作用,高效生成自适应免疫反应。
The authors have nothing to disclose.
这项工作部分由PHRMA基金会资助,马里兰大学帕克学院颁发的研究和学者奖。我们感谢达雷尔·欧文教授支持完成”通过在体内注入辅助释放聚合物颗粒来原位 工程淋巴结微环境”的初步工作。5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |