Lymfeklieren zijn de immunologische weefsels die de immuunrespons orkestreren en een cruciaal doelwit zijn voor vaccins. Biomaterialen zijn gebruikt om lymfeklieren beter te richten en de levering van antigenen of hulpstoffen te controleren. Dit artikel beschrijft een techniek die deze ideeën combineert om biocompatibele polymeerdeeltjes in lymfeklieren te injecteren.
Het genereren van adaptieve immuunrespons is afhankelijk van efficiënte drainage of handel in antigeen naar lymfeklieren voor de verwerking en presentatie van deze vreemde moleculen naar T- en B-lymfocyten. Lymfeklieren zijn dus kritische doelwitten geworden voor nieuwe vaccins en immunotherapieën. Een recente strategie voor het richten van deze weefsels is directe lymfeklierinjectie van oplosbare vaccincomponenten, en klinische proeven met deze techniek zijn veelbelovend. Verschillende biomaterialenstrategieën zijn ook onderzocht om de lymfekliertargeting te verbeteren, bijvoorbeeld het afstemmen van deeltjesgrootte voor optimale drainage van biomateriaalvaccindeeltjes. In dit artikel presenteren we een nieuwe methode die directe lymfeklierinjectie combineert met biologisch afbreekbare polymeerdeeltjes die kunnen worden beladen met antigeen, adjuvans of andere vaccincomponenten. In deze methode worden polymere microdeeltjes of nanodeeltjes gesynthetiseerd door een gemodificeerd dubbel emulsieprotocol met lipidenstabilisatoren. Deeltjeseigenschappen(bijv. grootte, ladinglading) worden bevestigd door respectievelijk laserdiffractie en fluorescerende microscopie. Muislymfeklieren worden vervolgens geïdentificeerd door perifere injectie van een niet-toxische tracerkleurstof die visualisatie van de doelinjectieplaats en daaropvolgende afzetting van polymeerdeeltjes in lymfeklieren mogelijk maakt. Deze techniek maakt directe controle mogelijk over de doses en combinaties van biomaterialen en vaccincomponenten die aan lymfeklieren worden geleverd en kan worden gebruikt bij de ontwikkeling van nieuwe vaccins op basis van biomaterialen.
De lymfeklieren (LN’s) zijn de commandocentra van het immuunsysteem. Op deze immunologische site presenteert antigeen cellen prime naïeve lymfocyten tegen specifieke vreemde antigenen om cellulaire en humorale immuunresponsen te activeren. LN’s zijn daarmee een aantrekkelijk doelwit geworden voor de levering van vaccins en immunotherapieën. Helaas resulteren de meeste vaccinstrategieën in inefficiënte, voorbijgaande toediening van antigeen en hulpstoffen aan het lymfoïde weefsel1. Benaderingen die de targeting en het behoud van vaccincomponenten in LAN’s verbeteren, kunnen daarom een aanzienlijke impact hebben op de potentie en efficiëntie van nieuwe vaccins.
Een strategie om de uitdaging van LN-targeting te omzeilen die grote belangstelling heeft getoond voor nieuwe klinische proeven is directe , intra-LN (i.LN.) injectie2-4. Deze onderzoeken maakten gebruik van ultrasone begeleiding om vaccins aan LN’s te leveren als een eenvoudige poliklinische procedure. In vergelijking met traditionele perifere injectieroutes resulteerde deze aanpak in aanzienlijke dosissparende en verbeterde werkzaamheid in therapeutische contexten, waaronder allergieën en kanker2-4. Deze studies maakten gebruik van i.LN. injectie van oplosbare vaccins(d.w.z. biomateriaalvrij) die snel werden gewist door lymfedrainage. Daarom werden meerdere injecties- of cycli van meerdere injecties – toegediend om deze indrukwekkende therapeutische effecten te bereiken. Verbeterde retentie in de LN kan de interactie tussen antigeen en/of adjuvans en immuuncellen verbeteren, waardoor de potentie van immuuncelpriming verder wordt verbeterd. Dit potentieel wordt ondersteund door recente studies die aantonen dat kinetiek van antigeen en adjuvante toediening een cruciale rol spelen bij het bepalen van de specifieke immuunrespons gegenereerd5-7. Verder kan het lokaliseren en minimaliseren van medicijn- en vaccindoses systemische effecten, zoals chronische ontstekingen, verminderen of elimineren.
Biomaterialen zijn uitgebreid bestudeerd om de potentie en efficiëntie van vaccins te verbeteren1,8,9. Inkapseling of adsorptie op biomateriaaldragers kan lading fysiek beschermen tegen afbraak en oplosbaarheidsbeperkingen overwinnen. Een ander opmerkelijk kenmerk van biomaterialendragers, zoals polymere micro- of nanodeeltjes, is de mogelijkheid om verschillende klassen lading te coloaden en vervolgens deze ladingen over gecontroleerde intervallen vrij te geven. Een significante beperking die biomateriaalvaccins en immunotherapieën in vivo blijft belemmeren, is echter inefficiënte targeting van immuuncellen en beperkte handel naar lymfeklieren. Perifere injectie van biomateriaalvaccins via conventionele routes(bijv. intradermaal, intramusculair) vertoont bijvoorbeeld meestal een slechte LN-targeting, waarbij tot 99% van het geïnjecteerde materiaal op de injectieplaats overblijft4,10. Meer recentelijk is de omvang van de dragers van biomaterialenvaccins afgestemd op het verbeteren van de preferentiële handel of drainage van deze vaccins naar LN’s via interstitiële stroom8,10. Deze vooruitgang heeft geleid tot verbeterde cellulaire en humoristische immuunresponsen, wat het belang onderstreept van het richten en ontwerpen van de LN-omgeving voor nieuwe vaccins.
Dit artikel presenteert een vaccinatieprotocol dat lipide-gestabiliseerde polymeerdeeltjes en i.LN. levering combineert om vaccindepots met gereguleerde afgifte te genereren5,11. Voortbouwend op recente studies met chirurgische technieken voor i.LN. bij muizen6,7,12,13ontwikkelden we een snelle, niet-chirurgische strategie voor het injecteren van biomateriaalvaccins bij kleine dieren5. Combinatie van i.LN. toediening met biomateriaal vaccindragers krachtig verbeterde CD8 T celrespons binnen 7 dagen na een enkele injectie van gecontroleerde afgifte vaccin depots5. Er werd ook een sterke humoristische respons(d.w.z. antilichaamtiters) gegenereerd; beide verbeteringen werden gekoppeld aan een verhoogde retentie van vaccincomponenten in lymfeklieren die werd gemedieerd door gecontroleerde afgifte van de biomateriaaldragers. Interessant is dat de grootte van vaccindeeltjes het lot van deze materialen ooit in de LAN’s veranderde: nanoschaaldeeltjes vertoonden verhoogde directe opname door cellen, terwijl grotere microdeeltjes in de extracellulaire LN-omgeving bleven en lading vrijkwamen(bijv. adjuvans) die werd opgenomen door LN-ingezeten antigeen dat cellenpresenteerde 5. Deze gegevens suggereren twee trajecten die kunnen worden benut voor nieuwe vaccins door de grootte van de geïnjecteerde biomaterialen i.LN te controleren.
In dit artikel worden biologisch afbreekbare lipide-gestabiliseerde polymeerdeeltjes (micro- en nanoschaal) gesynthetiseerd met behulp van een gemodificeerde dubbele emulsiestrategie5,11. Deeltjeseigenschappen worden gekenmerkt door laserdiffractie en microscopie. Deze deeltjes worden vervolgens rechtstreeks in de inguinale LN’s geïnjecteerd die niet-assurgisch zijn geïdentificeerd met behulp van een gemeenschappelijke, niet-toxische tracerkleurstof14. Post-injectie analyse van LN’s door histologie of flow cytometrie kan worden gebruikt om de verdeling van deeltjes binnen de LN-omgeving te verifiëren, evenals om de cellulaire opname en retentie van deeltjes in de loop van de tijd te controleren. Voor protocollen met histologische verwerking en flowcytometrie worden lezers verwezen naar recente JoVE-artikelen en tijdschriftrapporten15-22. Typische resultaten tonen lokale LN-targeting van deze depots aan die kunnen worden misbruikt om krachtige, efficiënte immuunresponsen te bereiken of om immuniteit op maat te maken voor doelpathogenen.
De in dit protocol beschreven techniek maakt gecontroleerde toediening van vaccins aan LAN’s en aan in LN-ingezeten antigeen presenterende cellen mogelijk. Biomateriaal ingekapselde lading kan worden gelokaliseerd binnen de LN, waardoor manipulatie van de doses van een of meer soorten lading geleverd aan de LN micro-omgeving. Het is aangetoond dat de lokalisatie en gecontroleerde afgifte van polymeerdeeltjes een krachtige cellulaire en humorale immuunrespons genereert bij aanzienlijk lagere doses dan conventionele benaderingen. Verder kan door de manipulatie van de grootte van de biomaterialendrager de primaire modus van cellulaire verwerking worden gemoduleerd tussen directe opname van nanodeeltjes of extracellulaire ladingafgifte uit grotere microdeeltjes5. Deze resultaten bepalen de haalbaarheid van i.LN. biomateriaallevering als platform voor therapeutische vaccinafgifte.
De synthese van PLGA-deeltjes door emulsie/oplosmiddelverdamping is op grote schaal toegepast in toepassingen voor de levering van geneesmiddelen23,24. Potentiële uitdagingen in verband met deze techniek hebben dus vooral betrekking op succesvolle identificatie en depositie van vaccins op de LN-doellocatie. Hoewel het gebruik van tracerkleurstof de visualisatie van de beoogde inguinale LAN’s vergemakkelijkt, zijn de doelgrootte en diepte onder de huid klein. Daarom raden de auteurs aan om tijd en muizen toe te wijzen voor het oefenen van de voorbereiding en injecties van muizen. Tijdens de voorbereiding van het dier(d.w.z. scheren en aanbrengen van ontharing) moet ervoor worden gezorgd dat de muizen aan de ventrale kant van het dier niet worden gesneden, waarbij de hoek van het been met de buik de huid vatbaarder maakt voor letsel door tondeuses. Bovendien moet al het ontharen worden verwijderd met warm water om te voorkomen dat dieren de crème binnenkrijgen tijdens normaal verzorgingsgedrag. Om LN-injecties te oefenen, kan een hogere tracerkleurstofconcentratie worden toegediend en kunnen oefendieren worden geëuthanaseerd en vervolgens meerdere keren worden geïnjecteerd. Na injectie kunnen muizen worden necropsie ondergaan en de grootte van LAN’s van geïnjecteerde dieren kan worden vergeleken met een niet-geïnjecteerde controle-LN. Een beperking van deze techniek is de fysieke limiet van het injectievolume dat in de LN-structuur kan worden geladen. Ons protocol suggereert een injectievolume van 10 μl bij muizen, hoewel andere studies grotere injectievolumes hebben gemeld die minstens zo hoog zijn als 20 μl.13 De directe toediening van vaccins via i.LN. injectie maakt echter dramatische dosissparen mogelijk, zodat de functie van deze vaccins over het algemeen niet mag worden beperkt door volumebeperkingen.
Zoals opgemerkt, is het veranderen van de fysische eigenschap van de deeltjes(d.w.z. grootte) een effectief mechanisme om de route of resultaten te veranderen die worden geïnduceerd door biomaterialen en ingekapselde ladingen in LN-weefsel. Het emulsie-/oplosmiddelverdampingsprotocol kan eenvoudig worden gewijzigd om fysische of chemische eigenschappen zoals oppervlaktelading of functionaliteit en de snelheid van biologische afbraak/ladingafgifte te wijzigen23,24. De afgiftekinetiek kan bijvoorbeeld worden afgestemd door middel van alternatieve polymeersamenstellingen en de oppervlaktefunctie kan worden gewijzigd met behulp van gemodificeerde lipidesamenstellingen of poly (vinylalcohol). De lading geladen in deeltjes kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om verschillende antigenen of hulpstoffen voor doelpathogenen te bevatten. Het voordeel van deze aanpak wordt bereikt door de combinatie van i.LN. levering met lokale, gecontroleerde vrijgave van lading uit biomaterialen. Deze synergie creëert een platform dat kan worden benut om efficiënt adaptieve immuunresponsen te genereren met behulp van minieme doses en met verminderde niet-specifieke / systemische bijwerkingen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de PhRMA foundation en een Research and Scholar Award van de University of Maryland, College Park. We danken prof. Darrell Irvine voor de ondersteuning van het eerste werk dat is uitgevoerd bij de voltooiing van “In situ engineering van de micromilieu van de lymfeklier via intranodale injectie van adjuvans-releasing polymeerdeeltjes.” 5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |