I linfonodi sono i tessuti immunologici che orchestrano la risposta immunitaria e sono un obiettivo critico per i vaccini. I biomateriali sono stati impiegati per colpire meglio i linfonodi e per controllare la consegna di antigeni o coadiuvanti. Questo articolo descrive una tecnica che combina queste idee per iniettare particelle polimeriche biocompatibili nei linfonodi.
La generazione di risposta immunitaria adattiva si basa su un efficiente drenaggio o traffico di antigene ai linfonodi per la lavorazione e la presentazione di queste molecole estranee ai linfociti T e B. I linfonodi sono quindi diventati obiettivi critici per nuovi vaccini e immunoterapie. Una strategia recente per colpire questi tessuti è l’iniezione diretta di linfonodi di componenti del vaccino solubili, e gli studi clinici che coinvolgono questa tecnica sono stati promettenti. Sono state inoltre studiate diverse strategie di biomateriale per migliorare il targeting dei linfonodi, ad esempio la messa a punto delle dimensioni delle particelle per un drenaggio ottimale delle particelle del vaccino contro i biomateriali. In questo articolo presentiamo un nuovo metodo che combina l’iniezione diretta di linfonodi con particelle polimeriche biodegradabili che possono essere cariche di antigene, coadiuvante o altri componenti del vaccino. In questo metodo le microparticelle polimeriche o le nanoparticelle sono sintetizzati da un protocollo di doppia emulsione modificato che incorpora stabilizzatori lipidici. Le proprietà delleparticelle (ad esempio dimensioni, carico del carico) sono confermate rispettivamente dalla diffrazione laser e dalla microscopia fluorescente. I linfonodi del topo vengono quindi identificati mediante iniezione periferica di un colorante tracciante non tossico che consente la visualizzazione del sito di iniezione bersaglio e la successiva deposizione di particelle polimeriche nei linfonodi. Questa tecnica consente il controllo diretto sulle dosi e le combinazioni di biomateriali e componenti vaccinale consegnati ai linfonodi e potrebbe essere sfruttata nello sviluppo di nuovi vaccini a base di biomateriali.
I linfonodi (LN) sono i centri di comando del sistema immunitario. In questo sito immunologico, l’antigene che presenta le cellule primi linfociti ingenui contro specifici antigeni estranei per attivare risposte immunitarie cellulari e umoriali. Le LN sono quindi diventate un obiettivo attraente per la somministrazione di vaccini e immunoterapie. Sfortunatamente, la maggior parte delle strategie vaccinale si traducono in una consegna inefficiente e transitoria di antigene e coadiuvanti al tessuto linfoide1. Approcci che migliorino l’individuazione e la conservazione dei componenti dei vaccini nelle LN potrebbero quindi avere un impatto significativo sulla potenza e sull’efficienza dei nuovi vaccini.
Una strategia per aggirare la sfida del targeting LN che ha dimostrato grande interesse per i nuovi studi clinici è l’iniezione diretta, intra-LN (i.LN.)2-4. Questi studi hanno utilizzato la guida ecografico per fornire vaccini alle LN come semplice procedura ambulatoriale. Rispetto alle tradizionali vie di iniezione periferica, questo approccio ha portato a un significativo risparmio di dose e a una migliore efficacia in contesti terapeutici tra cui allergie ecancro 2-4. Questi studi hanno impiegato l’iniezione di vaccini solubili (cioè senza biomateriali)che sono stati rapidamente cancellati dal drenaggio linfatico. Pertanto, sono state somministrate iniezioni multiple o cicli di iniezioni multiple per ottenere questi impressionanti effetti terapeutici. Una migliore ritenzione nella LN potrebbe migliorare l’interazione tra antigene e/o adiuvante e cellule immunitarie, migliorando ulteriormente la potenza dell’adescamento delle cellule immunitarie. Questo potenziale è supportato da recenti studi che mostrano che la cinetica dell’antigene e del parto adiuvante gioca un ruolo fondamentale nel determinare la rispostaimmunitaria specifica generata 5-7. Inoltre, localizzare e ridurre al minimo le dosi di farmaci e vaccini potrebbe ridurre o eliminare gli effetti sistemici, come l’infiammazione cronica.
I biomateriali sono stati ampiamente studiati per migliorare la potenza e l’efficienza deivaccini 1,8,9. L’incapsulamento o l’adsorbimento sui trasportatori di biomateriali può proteggere fisicamente il carico dalla degradazione e superare i limiti di solubilità. Un’altra caratteristica degna di nota dei portatori di biomateriali, come micro o nanoparticelle polimeriche, è la capacità di coricarsi diverse classi di carico e, successivamente, rilasciare questi carichi a intervalli controllati. Tuttavia, una limitazione significativa che continua a ostacolare i vaccini biomateriali e le immunoterapie in vivo è il targeting inefficiente delle cellule immunitarie e il traffico limitato ai linfonodi. Ad esempio, l’iniezione periferica di vaccinibiomateriali attraverso percorsi convenzionali (ad esempio intradermico, intramuscolare) presenta in genere un cattivo targeting LN, con fino al 99% del materiale iniettato rimasto nel sito diiniezione 4,10. Più recentemente, le dimensioni dei portatori di vaccini biomateriali sono state ottimizzate per migliorare il traffico preferenziale o il drenaggio di questi vaccini verso le LN attraverso il flusso interstiziale8,10. Questi progressi hanno portato a maggiori risposte immunitarie cellulari e umoristico, sottoscrivendo l’importanza di indirizzare e progettare l’ambiente LN per nuovi vaccini.
Questo documento presenta un protocollo di vaccinazione che combina particelle polimeriche stabilizzate dai lipidi e consegna i.LN. per generare depositi di vaccini arilascio controllato 5,11. Sulla base di recenti studi che utilizzano tecniche chirurgiche per i.LN. neitopi 6,7,12,13, abbiamo sviluppato una strategia rapida e non chirurgica per iniettare vaccini biomateriali in piccoli animali5. Combinando la somministrazione di i.LN. con portatori di vaccini biomateriali, la risposta cellulare CD8 T è migliorata in modo potente entro 7 giorni dopo una singola iniezione di depositi di vaccini arilascio controllato 5. È stata generata anche unaforte risposta umorista (cioè tatri anticorpali); entrambi i miglioramenti erano legati ad una maggiore ritenzione di componenti del vaccino nei linfonodi che è stata mediata dal rilascio controllato dai portatori di biomateriali. È interessante notare che le dimensioni delle particelle vaccino hanno alterato il destino di questi materiali una volta nelle LN: le particelle su scala nanometrica hanno mostrato un maggiore assorbimento diretto da parte delle cellule, mentre microparticelle più grandi sono rimaste nell’ambiente LN extracellulare e hanno rilasciato carichi(ad esempio coadiuvanti) che sono stati ripresi dall’antigene residente nella LN che presentale cellule 5. Questi dati suggeriscono due percorsi che potrebbero essere sfruttati per nuovi vaccini controllando le dimensioni dei biomateriali iniettati i.LN.
In questo articolo le particelle polimeriche biodegradabili stabilizzate dai lipidi (micro e nanoscala) vengono sintetizzati utilizzando una strategia di doppiaemulsione modificata 5,11. Le proprietà delle particelle sono caratterizzate da diffrazione laser e microscopia. Queste particelle vengono quindi iniettate direttamente nelle LN inguinali identificate non chirurgicamente utilizzando un comune colorante tracciante non tossico14. L’analisi post-iniezione delle LN mediante istologia o citometria del flusso può essere utilizzata per verificare la distribuzione delle particelle all’interno dell’ambiente LN, nonché per monitorare l’assorbimento cellulare e la ritenzione di particelle nel tempo. Per i protocolli che descrivono in dettaglio l’elaborazione istologica e la citometria del flusso, i lettori sono riferiti ai recenti articoli jove e alle relazionidi giornale 15-22. I risultati tipici dimostrano il targeting locale di LN di questi depositi che potrebbero essere sfruttati per ottenere risposte immunitarie potenti ed efficienti o per personalizzare l’immunità per gli agenti patogeni bersaglio.
La tecnica descritta in questo protocollo consente la consegna controllata di vaccini alle LN e alle cellule di presentazione dell’antigene residente in LN. Il carico incapsulato di biomateriale può essere localizzato all’interno della LN, consentendo la manipolazione delle dosi di uno o più tipi di carico consegnate al microambiente LN. La localizzazione e il rilascio controllato da particelle polimeriche ha dimostrato di generare una potente risposta immunitaria cellulare e umorista a dosi significativamente inferiori rispetto agli approcci convenzionali. Inoltre, attraverso la manipolazione delle dimensioni del vettore di biomateriali, la modalità primaria di elaborazione cellulare può essere modulata tra l’assorbimento diretto di nanoparticelle o il rilascio di carichi extracellulari da microparticellepiù grandi 5. Questi risultati stabiliscono la fattibilità della somministrazione di biomateriali i.LN. come piattaforma per la somministrazione di vaccini terapeutici.
La sintesi delle particelle PLGA per evaporazione emulsione/solvente è stata ampiamente utilizzata nelle applicazioni disomministrazione di farmaci 23,24. Pertanto, le potenziali sfide associate a questa tecnica riguardano principalmente l’identificazione e la deposizione di vaccini di successo nel sito target della LN. Sebbene l’uso del colorante tracciante faciliti la visualizzazione delle LN inguinali mirate, le dimensioni e la profondità target sotto la pelle sono piccole. Pertanto, gli autori raccomandano di assegnare tempo e topi per praticare la preparazione e le iniezioni di topi. Durante la preparazione animale (cioè la rasatura e l’applicazione di depilatori), si deve fare attenzione a non tagliare i topi sul lato ventraledell’animale dove l’angolo della gamba con l’addome rende la pelle più soggetta a lesioni da tosaerba. Inoltre, tutti i depilatori devono essere rimossi con acqua tiepida per impedire agli animali di ingerire la crema durante il normale comportamento di toelettatura. Per praticare le iniezioni di LN, è possibile somministrata una maggiore concentrazione di coloranti traccianti e praticare gli animali, e quindi iniettati più volte. Dopo iniezione i topi possono essere necropificati e le dimensioni delle LN degli animali iniettati possono essere confrontate con un LN di controllo non iniettato. Una limitazione di questa tecnica è il limite fisico del volume di iniezione che può essere caricato nella struttura LN. Il nostro protocollo suggerisce un volume di iniezione di 10 μl nei topi, anche se altri studi hanno riportato volumi di iniezione maggiori almeno fino a 20 μl.13 Tuttavia, la somministrazione diretta di vaccini tramite iniezione i.LN. consente un drastico risparmio di dose, quindi la funzione di questi vaccini non dovrebbe generalmente essere limitata da vincoli di volume.
Come notato, cambiare la proprietà fisicadelle particelle (cioè le dimensioni) è un meccanismo efficace per alterare la via o i risultati indotti dai biomateriali e dai carichi incapsulati nel tessuto LN. Il protocollo di evaporazione emulsione/solvente può essere facilmente modificato per alterare proprietà fisiche o chimiche come la carica o la funzionalità della superficie e la velocità di biodegradazione / rilascio delcarico 23,24. Ad esempio, la cinetica di rilascio può essere sintonizzata attraverso composizioni polimeriche alternative e la funzione superficiale può essere modificata utilizzando composizioni lipidiche modificate o poly (alcol vinilico). Il carico caricato in particelle può essere facilmente manipolato per contenere diversi antigeni o coadiuvanti per agenti patogeni bersaglio. Il vantaggio di questo approccio si ottiene attraverso la combinazione della consegna i.LN. con il rilascio locale e controllato di merci da biomateriali. Questa sinergia stabilisce una piattaforma che può essere sfruttata per generare in modo efficiente risposte immunitarie adattive utilizzando dosi minute e con effetti collaterali non specifici / sistemici ridotti.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla fondazione PhRMA e da un Research and Scholar Award dell’Università del Maryland, College Park. Ringraziamo il Prof. Darrell Irvine per il supporto del lavoro iniziale condotto nel completamento di“Ingegneria in situ del microambiente linfonodo tramite iniezione intranodale di particelle polimeriche che rilasciano coadiuvanti”. 5 la commissione per i
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |