Lymfeknuter er det immunologiske vevet som orkestrerer immunrespons og er et kritisk mål for vaksiner. Biomaterialer har blitt brukt til bedre å målrette lymfeknuter og for å kontrollere levering av antigener eller adjuvanser. Dette papiret beskriver en teknikk som kombinerer disse ideene for å injisere biokompatible polymerpartikler i lymfeknuter.
Generering av adaptiv immunrespons er avhengig av effektiv drenering eller smugling av antigen til lymfeknuter for behandling og presentasjon av disse fremmede molekylene til T- og B-lymfocytter. Lymfeknuter har dermed blitt kritiske mål for nye vaksiner og immunterapier. En nylig strategi for å målrette disse vevene er direkte lymfeknuteinjeksjon av løselige vaksinekomponenter, og kliniske studier som involverer denne teknikken har vært lovende. Flere biomaterialestrategier er også undersøkt for å forbedre lymfeknutemålrettingen, for eksempel tuning av partikkelstørrelse for optimal drenering av biomaterialevaksinepartikler. I dette papiret presenterer vi en ny metode som kombinerer direkte lymfeknuteinjeksjon med biologisk nedbrytbare polymerpartikler som kan lades med antigen, adjuvans eller andre vaksinekomponenter. I denne metoden syntetiseres polymere mikropartikler eller nanopartikler av en modifisert dobbel emulsjonsprotokoll som inkorporerer lipidstabilisatorer. Partikkelegenskaper(f.eks. størrelse, lastlasting) bekreftes av henholdsvis laserdiffraksjon og fluorescerende mikroskopi. Muselymfoder identifiseres deretter ved perifer injeksjon av et ikke-giftig sporstoff som tillater visualisering av målinjeksjonsstedet og etterfølgende avsetning av polymerpartikler i lymfeknuter. Denne teknikken tillater direkte kontroll over doser og kombinasjoner av biomaterialer og vaksinekomponenter levert til lymfeknuter og kan utnyttes i utviklingen av nye biomaterialebaserte vaksiner.
Lymfeknuter ( LNer) er kommandosentrene i immunsystemet. På dette immunologiske stedet presenterer antigen som presenterer celler naive lymfocytter mot spesifikke fremmede antigener for å aktivere cellulære og humorale immunresponser. NOM har dermed blitt et attraktivt mål for levering av vaksiner og immunterapi. Dessverre resulterer de fleste vaksinestrategier i ineffektiv, forbigående levering av antigen og adjuvanser til lymfoidvevet1. Tilnærminger som forbedrer målrettingen og oppbevaringen av vaksinekomponenter i LN-er, kan derfor ha en betydelig innvirkning på styrken og effektiviteten til nye vaksiner.
En strategi for å omgå utfordringen med LN-målretting som har vist stor interesse for nye kliniske studier er direkte, intra-LN (i.LN.) injeksjon2-4. Disse studiene benyttet ultralydveiledning for å levere vaksiner til LN-er som en enkel poliklinisk prosedyre. Sammenlignet med tradisjonelle perifere injeksjonsruter, resulterte denne tilnærmingen i betydelig dosesparende og forbedret effekt i terapeutiske sammenhenger, inkludert allergier og kreft2-4. Disse studiene benyttet i.LN. injeksjon av løselige vaksiner (dvs. biomaterialefri) som raskt ble ryddet av lymfatisk drenering. Derfor ble flere injeksjoner – eller sykluser av flere injeksjoner – administrert for å oppnå disse imponerende terapeutiske effektene. Forbedret oppbevaring i LN kan forbedre samspillet mellom antigen og/eller adjuvans og immunceller, noe som ytterligere forbedrer styrken til immuncellepriming. Dette potensialet støttes av nyere studier som viser kinetikk av antigen og adjuvant levering spiller en kritisk rolle i å bestemme den spesifikke immunresponsen generert5-7. Videre kan lokalisering og minimering av legemiddel- og vaksinedoser redusere eller eliminere systemiske effekter, for eksempel kronisk betennelse.
Biomaterialer har blitt studert mye for å forbedre styrken og effektiviteten til vaksiner1,8,9. Innkapsling i eller adsorpsjon på biomaterialer kan fysisk beskytte lasten mot nedbrytning og overvinne løselighetsbegrensninger. Et annet bemerkelsesverdig trekk ved biomaterialer, som polymere mikro- eller nanopartikler, er evnen til å coload flere klasser av last og deretter frigjøre disse lastene over kontrollerte intervaller. Imidlertid er en betydelig begrensning som fortsetter å hindre biomaterialer vaksiner og immunterapi in vivo ineffektiv målretting av immunceller og begrenset smugling til lymfeknuter. For eksempel viser perifer injeksjon av biomaterialevaksiner gjennom konvensjonelle ruter(f.eks. intradermal, intramuskulær) vanligvis dårlig LN-målretting, med opptil 99% av det injiserte materialet som gjenstår på injeksjonsstedet4,10. Mer nylig har størrelsen på biomaterialer vaksinebærere blitt innstilt for å forbedre preferansehandel eller drenering av disse vaksinene til LNer gjennom interstitiell strømning8,10. Disse fremskrittene har ført til forbedrede cellulære og humorale immunresponser, noe som understreker viktigheten av å målrette og konstruere LN-miljøet for nye vaksiner.
Dette papiret presenterer en vaksinasjonsprotokoll som kombinerer lipidstabiliserte polymerpartikler og i.LN. levering for å generere kontrollerte utslippsvaksinedepoter5,11. Bygger på nyere studier som benytter kirurgiske teknikker for i.LN. i mus6,7,12,13, utviklet vi en rask, ikke-urgisk strategi for injeksjon av biomaterialevaksiner hos små dyr5. Kombinere i.LN. levering med biomateriale vaksine bærere kraftig forbedret CD8 T celle respons innen 7 dager etter en enkelt injeksjon av kontrollert utgivelsen vaksine depoter5. En sterk humoral respons (dvs. antistofftitrer) ble også generert; begge forbedringene var knyttet til økt oppbevaring av vaksinekomponenter i lymfeknuter som ble mediert ved kontrollert frigjøring fra biomaterialebærere. Interessant nok endret størrelsen på vaksinepartikler skjebnen til disse materialene en gang i BN-ene: nanoskalapartikler viste økt direkte opptak av celler, mens større mikropartikler forble i det ekstracellulære LN-miljøet og frigjort last(f.eks. adjuvans) som ble tatt opp av LN-resident antigen som presenterer cellene5. Disse dataene antyder to veier som kan utnyttes for nye vaksiner ved å kontrollere størrelsen på biomaterialer injisert i.LN.
I denne artikkelen syntetiseres biologisk nedbrytbare lipidstabiliserte polymerpartikler (mikro- og nanoskala) ved hjelp av en modifisert dobbel emulsjonsstrategi5,11. Partikkelegenskaper er preget av laserdiffraksjon og mikroskopi. Disse partiklene injiseres deretter direkte i inguinale LNer identifisert ikke-urgisk ved hjelp av et vanlig, ikke-giftig tracerfargestoff14. Etterinjeksjonsanalyse av LNer ved histologi eller strømningscytometri kan brukes til å verifisere fordelingen av partikler i LN-miljøet, samt til å overvåke cellulært opptak og oppbevaring av partikler over tid. For protokoller som beskriver histologisk behandling og flytcytometri, blir leserne henvist til nylige JoVE-artikler og journalrapporter15-22. Typiske resultater viser lokal LN-målretting av disse depotene som kan utnyttes for å oppnå potente, effektive immunresponser eller for å skreddersy immunitet for målpatogener.
Teknikken beskrevet i denne protokollen tillater kontrollert levering av vaksiner til LNer og til LN-hjemmehørende antigen som presenterer celler. Biomateriale innkapslet last kan lokaliseres innenfor LN, slik at manipulering av doser av en eller flere typer last levert til LN mikromiljøet. Lokaliseringen og kontrollert frigjøring fra polymerpartikler har vist seg å generere en potent cellulær og humoral immunrespons ved betydelig lavere doser enn konvensjonelle tilnærminger. Videre, gjennom manipulering av biomaterialebærerstørrelse, kan den primære modusen for cellulær behandling moduleres mellom direkte opptak av nanopartikler eller ekstracellulær lastutløsning fra større mikropartikler5. Disse resultatene etablerer muligheten for i.LN. biomaterialelevering som en plattform for terapeutisk vaksinelevering.
Syntesen av PLGA-partikler ved emulsjon/løsningsmiddelfordampning har vært mye brukt i søknader om legemiddellevering23,24. Dermed er potensielle utfordringer knyttet til denne teknikken hovedsakelig knyttet til vellykket identifisering og avsetning av vaksiner på LN-målstedet. Selv om bruken av tracerfarge letter visualiseringen av de målrettede inguinale ALT-ene, er målstørrelsen og dybden under huden liten. Dermed anbefaler forfatterne å tildele tid og mus for å praktisere forberedelse og injeksjoner av mus. Under dyreforberedelse(dvs. barbering og påføring av depilatorisk), bør det tas hensyn til ikke å kutte musene på den ventrale siden av dyret der vinkelen på benet med magen gjør huden mer utsatt for skade fra clippers. I tillegg bør all depilatorium fjernes med varmt vann for å forhindre at dyr inntar kremen under normal grooming oppførsel. For å praktisere LN-injeksjoner kan en høyere sporstoffkonsentrasjon administreres og praktisere dyr kan avlives, og deretter injiseres flere ganger. Etter injeksjon mus kan være nekropsied og størrelsen på LNer fra injiserte dyr kan sammenlignes med en uinjisert kontroll LN. En begrensning ved denne teknikken er den fysiske grensen for injeksjonsvolumet som kan lastes inn i LN-strukturen. Vår protokoll antyder et injeksjonsvolum på 10 μl hos mus, selv om andre studier har rapportert større injeksjonsvolumer minst så høyt som 20 μl.13 Imidlertid tillater direkte levering av vaksiner via i.LN. injeksjon dramatisk dosesparing, slik at funksjonen til disse vaksinene generelt ikke bør begrenses av volumbegrensninger.
Som nevnt er endring av partiklenes fysiske egenskap (dvs. størrelse) en effektiv mekanisme for å endre banen eller resultatene forårsaket av biomaterialer og innkapslede last i LN-vev. Fordampningsprotokollen for emulsjon/løsningsmiddel kan enkelt modifiseres for å endre fysiske eller kjemiske egenskaper som overflatelading eller funksjonalitet, og hastigheten på biologisk nedbrytning /lastutløsning23,24. For eksempel kan frigjøringskinetikken justeres gjennom alternative polymersammensetninger, og overflatefunksjonen kan endres ved hjelp av modifiserte lipidblandinger eller poly (vinylalkohol). Lasten lastet i partikler kan lett manipuleres til å inneholde forskjellige antigener eller adjuvanser for målpatogener. Fordelen med denne tilnærmingen oppnås gjennom kombinasjonen av i.LN. levering med lokal, kontrollert frigjøring av last fra biomaterialer. Denne synergien etablerer en plattform som kan utnyttes til effektivt å generere adaptive immunresponser ved hjelp av minuttdoser og med reduserte ikke-spesifikke / systemiske bivirkninger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis finansiert av PhRMA foundation og en Research and Scholar Award fra University of Maryland, College Park. Vi takker prof. Darrell Irvine for støtte til det første arbeidet som ble utført i ferdigstillelsen av “In situ engineering av lymfeknutemikromiljøet via intranodal injeksjon av adjuvant-frigjørende polymerpartikler.” 5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |