Linfonodos são os tecidos imunológicos que orquestram a resposta imune e são um alvo crítico para as vacinas. Os biomateriais têm sido empregados para melhor direcionar linfonodos e controlar a entrega de antígenos ou adjuvantes. Este artigo descreve uma técnica que combina essas ideias para injetar partículas de polímeros biocompatíveis em linfonodos.
A geração de resposta imune adaptativa depende de drenagem eficiente ou tráfico de antígeno para linfonodos para processamento e apresentação dessas moléculas estranhas aos linfócitos T e B. Os linfonodos tornaram-se, assim, alvos críticos para novas vacinas e imunoterapias. Uma estratégia recente para atingir esses tecidos é a injeção direta de linfonodos de componentes de vacinas solúveis, e os ensaios clínicos envolvendo essa técnica têm sido promissores. Várias estratégias de biomateriais também têm sido investigadas para melhorar o direcionamento do linfonodo, por exemplo, ajustando o tamanho das partículas para a drenagem ideal de partículas de vacinas biomateriais. Neste artigo apresentamos um novo método que combina injeção direta de linfonodo com partículas de polímeros biodegradáveis que podem ser carregadas com antígeno, adjuvante ou outros componentes da vacina. Neste método, micropartículas poliméricas ou nanopartículas são sintetizadas por um protocolo de dupla emulsão modificado que incorpora estabilizadores lipídicos. As propriedades das partículas (por exemplo, tamanho, carga de carga) são confirmadas por difração a laser e microscopia fluorescente, respectivamente. Os linfonodos do rato são então identificados pela injeção periférica de um corante rastreador nãotóxico que permite a visualização do local de injeção alvo e a subsequente deposição de partículas de polímeros em linfonodos. Esta técnica permite o controle direto sobre as doses e combinações de biomateriais e componentes de vacinas entregues a linfonodos e poderia ser aproveitada no desenvolvimento de novas vacinas baseadas em biomateriais.
Os linfonodos (LNs) são os centros de comando do sistema imunológico. Neste sítio imunológico, o antígeno que apresenta células é linfócito ingênuo contra antígenos estranhos específicos para ativar respostas imunes celulares e humorais. As LNs tornaram-se, assim, um alvo atraente para a entrega de vacinas e imunoterápicos. Infelizmente, a maioria das estratégias de vacina resultam em entrega ineficiente e transitória de antígeno e adjuvantes ao tecido linfoide1. Abordagens que melhorem a segmentação e retenção de componentes de vacinas em LNs podem, portanto, ter um impacto significativo na potência e eficiência de novas vacinas.
Uma estratégia para contornar o desafio da segmentação da LN que demonstrou grande interesse em novos ensaios clínicos é a injeção direta, intra-LN (i.LN.)2-4. Esses ensaios utilizaram orientações de ultrassom para fornecer vacinas às LNs como um simples procedimento ambulatorial. Em comparação com as rotas tradicionais de injeção periférica, essa abordagem resultou em uma significativa economia de doses e eficácia melhorada em contextos terapêuticos, incluindo alergias e câncer2-4. Estes estudos utilizaram a injeção de vacinas solúveis ( ouseja, livres de biomateriais) que foram rapidamente liberadas por drenagem linfática. Portanto, várias injeções ou ciclos de múltiplas injeções foram administrados para alcançar esses efeitos terapêuticos impressionantes. Uma retenção melhorada na LN poderia melhorar a interação entre antígeno e/ou células imunes e adjuvantes, melhorando ainda mais a potência da escorva de células imunes. Esse potencial é apoiado por estudos recentes que mostram cinética de antígeno e entrega adjuvante desempenham um papel crítico na determinação da resposta imune específica gerada5-7. Além disso, a localização e a minimização das doses de medicamentos e vacinas poderia reduzir ou eliminar efeitos sistêmicos, como inflamação crônica.
Os biomateriais têm sido estudados extensivamente para aumentar a potência e a eficiência das vacinas1,8,9. Encapsulamento ou adsorção em transportadores de biomateriais pode proteger fisicamente a carga da degradação e superar as limitações de solubilidade. Outra característica notável dos transportadores de biomateriais, como micro-partículas poliméricas ou nanopartículas, é a capacidade de cocarregar várias classes de carga e, posteriormente, liberar essas cargas sobre intervalos controlados. No entanto, uma limitação significativa que continua a dificultar vacinas biomateriais e imunoterápicos in vivo é alvo ineficiente de células imunes e tráfico limitado a linfonodos. Por exemplo, a injeção periférica de vacinas biomateriais através de rotas convencionais (por exemplo, intradérmicas, intramusculares) normalmente apresentam má segmentação de LN, com até 99% do material injetado permanecendo no local da injeção4,10. Mais recentemente, o tamanho dos portadores de vacinas biomateriais foi ajustado para melhorar o tráfico preferencial ou a drenagem dessas vacinas para LNs através do fluxo intersticial8,10. Esses avanços levaram a uma maior resposta imune celular e humoral, ressaltando a importância de direcionar e projetar o ambiente LN para novas vacinas.
Este artigo apresenta um protocolo de vacinação que combina partículas de polímeros estabilizadas lipídicas e entrega de I.LN. para gerar depósitos de vacinas de liberação controlada5,11. Baseando-se em estudos recentes que empregam técnicas cirúrgicas para i.LN. em camundongos6,7,12,13, desenvolvemos uma estratégia rápida e não-úrgica para injetar vacinas biomateriais em animais de pequeno porte5. Combinando a entrega da I.LN com os portadores de vacinas biomateriais potencialmente melhorou a resposta das células CD8 T dentro de 7 dias após uma única injeção de depósitos de vacinas de liberação controlada5. Também foi gerada uma forte resposta humoral (ou seja, titulantes de anticorpos; ambos os aprimoramentos foram ligados ao aumento da retenção de componentes vacinais em linfonodos que foram mediados pela liberação controlada dos portadores de biomateriais. Curiosamente, o tamanho das partículas de vacina alterou o destino desses materiais uma vez nas LNs: partículas nanoescala mostraram maior absorção direta por células, enquanto micropartículas maiores permaneceram no ambiente de LN extracelular e liberaram cargas(por exemplo, adjuvante) que foram absorídas pelo antígeno residente em LN que apresentava células5. Esses dados sugerem dois caminhos que poderiam ser explorados para novas vacinas controlando o tamanho de biomateriais injetados i.LN.
Neste artigo, partículas de polímero biodegradáveis estabilizadas por lipídios (micro e nanoescala) são sintetizadas usando uma estratégia de dupla emulsão modificada5,11. As propriedades das partículas são caracterizadas por difração a laser e microscopia. Essas partículas são então injetadas diretamente nas LNs inguinais identificadas nãourgicamente usando um corante rastreador comum e nãotóxico14. A análise pós-injeção de LNs por histologia ou citometria de fluxo pode ser usada para verificar a distribuição de partículas dentro do ambiente LN, bem como para monitorar a absorção celular e a retenção de partículas ao longo do tempo. Para protocolos detalhando processamento histológico e citometria de fluxo, os leitores são encaminhados para artigos recentes do JoVE e relatórios de revistas15-22. Resultados típicos demonstram o direcionamento local da LN desses depósitos que poderiam ser explorados para alcançar respostas imunes potentes e eficientes ou para adaptar a imunidade para patógenos-alvo.
A técnica descrita neste protocolo permite a entrega controlada de vacinas às LNs e às células de apresentação de antígenos residentes em LN. A carga encapsulada por materiais biomagráficos pode ser localizada dentro da LN, permitindo a manipulação das doses de um ou mais tipos de carga entregues ao microambiente LN. A localização e a liberação controlada de partículas de polímeros tem sido demonstrada para gerar uma potente resposta imune celular e humoral em doses significativamente menores do que as abordagens convencionais. Além disso, através da manipulação do tamanho do transportador de biomateriais, o modo primário de processamento celular pode ser modulado entre a absorção direta de nanopartículas ou a liberação de carga extracelular de micropartículas maiores5. Esses resultados estabelecem a viabilidade da entrega de biomateriais como plataforma de entrega de vacinas terapêuticas.
A síntese de partículas PLGA por evaporação de emulsão/solvente tem sido amplamente empregada em aplicações de entrega de medicamentos23,24. Assim, os desafios potenciais associados a essa técnica referem-se principalmente à identificação e deposição bem-sucedidas de vacinas no local alvo da LN. Embora o uso de corante rastreador facilite a visualização das LNs inguinais direcionadas, o tamanho do alvo e a profundidade sob a pele são pequenos. Assim, os autores recomendam o tempo de alocação e camundongos para a prática da preparação e injeções de camundongos. Durante a preparação animal (ou seja, barbear e aplicação de depilatório), deve-se tomar cuidado para não cortar os camundongos no lado ventral do animal onde o ângulo da perna com o abdômen torna a pele mais propensa a lesões de cortadores. Além disso, todo depilatório deve ser removido com água morna para evitar que os animais ingeram o creme durante o comportamento normal de preparo. Para praticar injeções de LN, uma maior concentração de corante rastreador pode ser administrada e praticar animais podem ser eutanizados e, em seguida, injetados várias vezes. Após a injeção os camundongos podem ser necropsiados e o tamanho de LNs de animais injetados pode ser comparado com um controle não injetado LN. Uma limitação dessa técnica é o limite físico do volume de injeção que pode ser carregado na estrutura LN. Nosso protocolo sugere um volume de injeção de 10 μl em camundongos, embora outros estudos tenham relatado volumes de injeção maiores pelo menos até 20 μl.13 No entanto, a entrega direta de vacinas via injeção i.LN. permite uma dose dramática para que a função dessas vacinas geralmente não deve ser limitada por restrições de volume.
Como observado, mudar a propriedade física das partículas (ou seja, tamanho) é um mecanismo eficaz para alterar a via ou os desfechos induzidos por biomateriais e cargas encapsuladas no tecido LN. O protocolo de evaporação de emulsão/solvente pode ser facilmente modificado para alterar propriedades físicas ou químicas, como carga ou funcionalidade de superfície, e a taxa de biodegradação/liberação de carga23,24. Por exemplo, a cinética de liberação pode ser ajustada através de composições alternativas de polímeros, e a função da superfície pode ser alterada usando composições lipídicas modificadas ou poli (álcool vinil). A carga carregada em partículas pode ser facilmente manipulada para conter diferentes antígenos ou adjuvantes para patógenos alvo. A vantagem dessa abordagem é alcançada através da combinação de entrega de I.LN. com a liberação local e controlada de carga de biomateriais. Essa sinergia estabelece uma plataforma que pode ser explorada para gerar respostas imunes adaptativas de forma eficiente usando doses minuciosas e com efeitos colaterais não específicos/sistêmicos reduzidos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação PhRMA e um Prêmio de Pesquisa e Estudos da Universidade de Maryland, College Park. Agradecemos ao Prof. Darrell Irvine pelo apoio ao trabalho inicial realizado na conclusão da “Engenharia In situ do microambiente de linfonodos através da injeção intranodal de partículas de polímeros liberantes adjuvante”. 5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |