Lymfkörtlar är de immunvävnader som orkestrerar immunsvar och är ett kritiskt mål för vacciner. Biomaterial har använts för att bättre rikta in sig på lymfkörtlar och för att kontrollera leverans av antigener eller adjuvanser. Detta dokument beskriver en teknik som kombinerar dessa idéer för att injicera biokompatierbara polymerpartiklar i lymfkörtlar.
Generering av adaptiv immunsvar förlitar sig på effektiv dränering eller handel med antigen till lymfkörtlar för bearbetning och presentation av dessa främmande molekyler till T- och B-lymfocyter. Lymfkörtlar har därmed blivit kritiska mål för nya vacciner och immunterapier. En ny strategi för att rikta in sig på dessa vävnader är direkt lymfkörtelinjektion av lösliga vaccinkomponenter, och kliniska prövningar som involverar denna teknik har varit lovande. Flera biomaterialstrategier har också undersökts för att förbättra lymfkörtelinriktningen, till exempel justering av partikelstorlek för optimal dränering av biomaterialvaccinpartiklar. I detta dokument presenterar vi en ny metod som kombinerar direkt lymfkörtelinjektion med biologiskt nedbrytbara polymerpartiklar som kan lastas med antigen, adjuvans eller andra vaccinkomponenter. I denna metod syntetiseras polymera mikropartiklar eller nanopartiklar genom ett modifierat dubbelemulsionsprotokoll som innehåller lipidstabilisatorer. Partikelegenskaper(t.ex. storlek, lastlastning) bekräftas av laserdiffraktion respektive fluorescerande mikroskopi. Muslymfkörtlar identifieras sedan genom perifer injektion av ett giftfri spårämne som möjliggör visualisering av målinjektionsstället och efterföljande nedfall av polymerpartiklar i lymfkörtlar. Denna teknik möjliggör direkt kontroll över doser och kombinationer av biomaterial och vaccinkomponenter som levereras till lymfkörtlar och kan utnyttjas vid utveckling av nya biomaterialbaserade vacciner.
Lymfkörtlarna (LNs) är immunsystemets kommandocentraler. På denna immunologiska plats, antigen presenterar celler prime naiva lymfocyter mot specifika främmande antigener att aktivera cellulära och humorala immunsvar. LNs har därmed blivit ett attraktivt mål för leverans av vacciner och immunterapier. Tyvärr resulterar de flesta vaccinstrategier i ineffektiv, övergående leverans av antigen och adjuvanser till lymfvävnaden1. Metoder som förbättrar inriktningen och kvarhållandet av vaccinkomponenter i LN kan därför ha en betydande inverkan på styrkan och effektiviteten hos nya vacciner.
En strategi för att kringgå utmaningen med LN-inriktning som har visat stort intresse för nya kliniska prövningar är direkt, intra-LN (i.LN.) injektion2-4. Dessa studier använde ultraljud vägledning för att leverera vacciner till LNs som en enkel öppenvården förfarande. Jämfört med traditionella perifera injektionsvägar resulterade detta tillvägagångssätt i betydande dossparande och förbättrad effekt i terapeutiska sammanhang inklusive allergier och cancer2-4. I dessa studier användes i.LN. injektion av lösliga vacciner(dvs. biomaterialfria) som snabbt rensades genom lymfatisk dränering. Därför administrerades flera injektioner- eller cykler av flera injektioner- för att uppnå dessa imponerande terapeutiska effekter. Förbättrad retention i LN kan förbättra interaktionen mellan antigen och/eller adjuvant och immunceller, ytterligare förbättra styrkan i immun cell priming. Denna potential stöds av nyligen genomförda studier som visar kinetik av antigen och adjuvant leverans spelar en avgörande roll för att bestämma det specifika immunsvar somgenereras 5-7. Vidare kan lokalisera och minimera läkemedels- och vaccindoser minska eller eliminera systemiska effekter, såsom kronisk inflammation.
Biomaterial har studerats utförligt för att förbättra styrkan och effektiviteten hos vacciner1,8,9. Inkapsling eller adsorption på biomaterialbärare kan fysiskt skydda lasten från nedbrytning och övervinna löslighetsbegränsningar. Ett annat anmärkningsvärt inslag hos biomaterialbärare, såsom polymera mikro- eller nanopartiklar, är förmågan att lasta flera lastklasser och därefter släppa dessa laster över kontrollerade intervaller. En betydande begränsning som fortsätter att hindra biomaterialvacciner och immunterapier in vivo är dock ineffektiv inriktning på immunceller och begränsad handel med lymfkörtlar. Till exempel uppvisar perifer injektion av biomaterialvacciner genom konventionella vägar(t.ex. intradermal, intramuskulär) vanligtvis dålig LN-inriktning, med upp till 99% av det injicerade materialet kvar på injektionsstället4,10. På senare tid har storleken på biomaterialvaccinbärare justerats för att förbättra förmånshandeln eller dräneringen av dessa vacciner till LN genom interstitielltflöde 8,10. Dessa framsteg har lett till förbättrade cellulära och humorala immunsvar, vilket understryker vikten av att rikta in sig på och konstruera LN-miljön för nya vacciner.
Detta dokument presenterar ett vaccinationsprotokoll som kombinerar lipidstabiliserade polymerpartiklar och i.LN. leverans för att generera kontrollerade frisättningsvaccindepåer5,11. Bygger på nyligen genomförda studier som använder kirurgiska tekniker för i.LN. hos möss6,7,12,13, utvecklade vi en snabb, icke-surgisk strategi för att injicera biomaterialvacciner hos små djur5. Kombinera i.LN. leverans med biomaterial vaccin bärare kraftigt förbättrad CD8 T cell svar inom 7 dagar efter en enda injektion av kontrollerade frisättningvaccindepåer 5. Ett starkt humoristiskt svar (dvs. antikroppstitrar) genererades också; Båda förbättringarna var kopplade till ökad retention av vaccinkomponenter i lymfkörtlar som förmedlades av kontrollerade utsläpp från biomaterial bärare. Intressant nog förändrade storleken på vaccinpartiklar ödet för dessa material en gång i LNs: partiklar i nanoskala visade förhöjd direkt upptag av celler, medan större mikropartiklar förblev i den extracellulära LN-miljön och släppte ut last (t.ex. adjuvans) som togs upp av LN-bosatta antigen som presenterar celler5. Dessa data tyder på två vägar som kan utnyttjas för nya vacciner genom att kontrollera storleken på biomaterial injiceras i.LN.
I denna artikel syntetiseras biologiskt nedbrytbara lipidstabiliserade polymerpartiklar (mikro- och nanoskala) med hjälp av en modifierad dubbel emulsionsstrategi5,11. Partikelegenskaper kännetecknas av laserdiffraktion och mikroskopi. Dessa partiklar injiceras sedan direkt i de inguinala LNs identifieras nonsurgically med hjälp av en gemensam, nontoxic tracer färgämne14. Analys efter injektion av LN genom histologi eller flödescytometri kan användas för att verifiera fördelningen av partiklar inom LN-miljön, samt för att övervaka cellulärt upptag och retention av partiklar över tid. För protokoll som beskriver histologisk bearbetning och flödescytometri hänvisas läsarna till de senaste JoVE-artiklarna och tidskriftsrapporterna15-22. Typiska resultat visar lokala LN inriktning av dessa depåer som kan utnyttjas för att uppnå potenta, effektiva immunsvar eller för att skräddarsy immunitet för mål patogener.
Tekniken som beskrivs i detta protokoll tillåter kontrollerad leverans av vacciner till LNs och till LN-residenta antigen presenterar celler. Biomaterial inkapslad last kan lokaliseras inom LN, vilket möjliggör manipulering av doser av en eller flera typer av last som levereras till LN-mikromiljön. Lokalisering och kontrollerad frisättning från polymerpartiklar har visat sig generera ett potent cellulärt och humoralt immunsvar vid betydligt lägre doser än konventionella metoder. Genom manipulering av biomaterialbärarens storlek kan dessutom det primära cellulära bearbetningssättet moduleras mellan direkt upptag av nanopartiklar eller extracellulär lastfrisättning från större mikropartiklar5. Dessa resultat fastställer genomförbarheten av i.LN. biomaterial leverans som en plattform för terapeutisk vaccin leverans.
Syntesen av PLGA-partiklar genom emulsion/lösningsmedelsavdunstning har använts i stor utsträckningi läkemedelsleveransapplikationer 23,24. Således gäller potentiella utmaningar i samband med denna teknik främst framgångsrik identifiering och deponering av vacciner på LN-målplatsen. Även om användningen av spårämne underlättar visualiseringen av de riktade inguinal LNs, är målstorleken och djupet under huden små. Således rekommenderar författarna allotting tid och möss för att öva beredning och injektioner av möss. Underdjurpreparat (dvs. rakning och applicering av depilatory) bör man vara försiktig så att mössen inte skärs på djurets ventrala sida där vinkeln på benet med buken gör huden mer benägen att skadas av klippare. Dessutom bör alla depilatoriska avlägsnas med varmt vatten för att förhindra att djur intar grädden under normalt groomingbeteende. För att öva LN-injektioner kan en högre färgämneskoncentration administreras och öva djur kan avlivas och sedan injiceras flera gånger. Efter injektion kan möss obduceras och storleken på LN från injicerade djur kan jämföras med en oinsatt kontroll LN. En begränsning av denna teknik är den fysiska gränsen för injektionsvolymen som kan laddas in i LN-strukturen. Vårt protokoll föreslår en injektionsvolym på 10 μl hos möss, även om andra studier har rapporterat större injektionsvolymer som är minst så höga som 20 μl.13 Men direkt leverans av vacciner via i.LN. injektion möjliggör dramatisk dossparning så att dessa vacciner i allmänhet inte bör begränsas av volymbegränsningar.
Som nämnts är förändring av partiklarnas fysiska egenskaper(dvs. storlek) en effektiv mekanism för att ändra den eller de resultat som orsakas av biomaterial och inkapslade laster i LN-vävnad. Emulsions-/lösningsmedelsavdunstningsprotokollet kan enkelt ändras för att ändra fysiska eller kemiska egenskaper såsom ytladdning eller ytfunktionalitet och frekvensen av biologisk nedbrytbarhet/lastfrisättning23,24. Till exempel kan frisättningskinetiken justeras genom alternativa polymerkompositioner, och ytfunktionen kan ändras med modifierade lipidkompositioner eller poly (vinylalkohol). Lasten som lastas i partiklar kan lätt manipuleras för att innehålla olika antigener eller adjuvanser för målpatogener. Fördelen med detta tillvägagångssätt uppnås genom kombinationen av i.LN. leverans med lokal, kontrollerad frisättning av last från biomaterial. Denna synergi etablerar en plattform som kan utnyttjas för att effektivt generera adaptiva immunsvar med hjälp av minutdoser och med minskade ospecificerade/systemiska biverkningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades delvis av PhRMA foundation och en Research and Scholar Award från University of Maryland, College Park. Vi tackar prof. Darrell Irvine för stöd till det inledande arbetet med att slutföra “In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injektion av adjuvansfrisättande polymerpartiklar.” 5 (på 5)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |