Lenf düğümleri immün yanıtı düzenleyen immünolojik dokulardır ve aşılar için kritik bir hedeftir. Lenf düğümlerini daha iyi hedeflemek ve antijenlerin veya yardımcıların doğumlarını kontrol etmek için biyomalzemeler bunların uzaması haline getirildi. Bu makalede, lenf düğümlerine biyouyumlu polimer parçacıkları enjekte etmek için bu fikirleri birleştiren bir teknik açıklanmaktadır.
Adaptif immün yanıtın üretilmesi, bu yabancı moleküllerin T ve B lenfositlerine işlenmesi ve sunulması için lenf düğümlerine verimli drenaj veya antijen kaçakçılığına dayanır. Lenf düğümleri böylece yeni aşılar ve immünoterapiler için kritik hedefler haline gelmiştir. Bu dokuları hedeflemek için yeni bir strateji çözünür aşı bileşenlerinin doğrudan lenf nodu enjeksiyonudur ve bu tekniği içeren klinik çalışmalar umut verici olmuştur. Lenf nodu hedeflemesini iyileştirmek için çeşitli biyomalzeme stratejileri de araştırılmıştır, örneğin biyomalzeme aşı parçacıklarının optimal drenajı için parçacık boyutunu ayarlama. Bu yazıda, doğrudan lenf nodu enjeksiyonu ile antijen, adjuvan veya diğer aşı bileşenleriyle dolu olabilecek biyobozunur polimer parçacıklarını birleştiren yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemde polimerik mikropartiküller veya nanopartiküller lipid stabilizatörlerini içeren modifiye çift emülsiyon protokolü ile sentezlenir. Partikül özellikleri(örneğin boyut, kargo yükleme) sırasıyla lazer kırınım ve floresan mikroskopi ile doğrulanır. Fare lenf düğümleri daha sonra hedef enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesine ve daha sonra lenf düğümlerinde polimer parçacıklarının birikmesine izin veren toksik olmayan bir izleyici boyasının periferik enjeksiyonu ile tanımlanır. Bu teknik, lenf düğümlerine teslim edilen biyomalzemelerin ve aşı bileşenlerinin dozları ve kombinasyonları üzerinde doğrudan kontrol sağlar ve yeni biyomalzeme bazlı aşıların geliştirilmesinde kullanılabilir.
Lenf düğümleri (LN’ ler) bağışıklık sisteminin komuta merkezleridir. Bu immünolojik sitede, hücreleri sunan antijen, hücresel ve humoral immün yanıtları aktive etmek için belirli yabancı antijenlere karşı naif lenfositleri astarlar. Böylece LN’ler aşı ve immünoterapilerin teslimi için cazip bir hedef haline gelmiştir. Ne yazık ki, çoğu aşı stratejisi antijen ve yardımcıların lenfoid dokuya verimsiz, geçici olarak verilmesiyle sonuçlanır1. Bu nedenle, LN’lerde aşı bileşenlerinin hedef ve tutulmasını geliştiren yaklaşımlar, yeni aşıların gücü ve verimliliği üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.
Yeni klinik çalışmalara büyük ilgi gösteren LN hedeflemesinin zorluğunu atlatmak için bir strateji doğrudan, LN içi (i.LN.) enjeksiyon2-4. Bu denemelerde, basit bir ayakta tedavi prosedürü olarak LN’lere aşı ulaştırmak için ultrason rehberliği kullanıldı. Geleneksel periferik enjeksiyon yolları ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım alerjiler ve kanser2-4dahil olmak üzere terapötik bağlamlarda önemli dozdan sağlayıcı ve daha iyi etkinlik ile sonuçlandı. Bu çalışmalarda lenfatik drenaj ile hızla temizlenen çözünür aşıların(yani biyomalzeme içermeyen) i.LN. enjeksiyonu kullanıldı. Bu nedenle, bu etkileyici terapötik etkileri elde etmek için çoklu enjeksiyonlar veya çoklu enjeksiyon döngüleri uygulandı. LN’de daha iyi elde tutulması, antijen ve/veya adjuvan ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi artırarak bağışıklık hücresi astarlamanın gücünü daha da artırabilir. Bu potansiyel, antijen kinetiği ve adjuvan doğumun5-7oluşturulan spesifik immün yanıtın belirlenmesinde kritik bir rol oynadığını gösteren son çalışmalarla desteklenmektedir. Ayrıca, ilaç ve aşı dozlarının lokalize ve en aza indirilmesi kronik inflamasyon gibi sistemik etkileri azaltabilir veya ortadan kaldırabilir.
Biyomalzemeler aşıların gücünü ve verimliliğini artırmak için kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır1,8,9. Biyomalzeme taşıyıcılarında kapsülleme veya adsorpsiyon, kargoyu bozulmaya karşı fiziksel olarak koruyabilir ve çözünürlük sınırlamalarının üstesinden gelebilir. Polimerik mikro veya nanopartiküller gibi biyomalzeme taşıyıcıların bir diğer önemli özelliği, birkaç kargo sınıfını birlikte yükleyebilme ve daha sonra bu kargoları kontrollü aralıklarla serbest bırakma yeteneğidir. Bununla birlikte, in vivo biyomalzeme aşıları ve immünoterapileri engellemeye devam eden önemli bir sınırlama, bağışıklık hücrelerinin verimsiz hedeflenmesi ve lenf düğümlerine sınırlı kaçakçılıktır. Örneğin, biyomalzeme aşıların konvansiyonel rotalardan(örneğin intradermal, intramüsküler) periferik enjeksiyonu tipik olarak zayıf LN hedeflemesi sergiler ve enjekte edilen malzemenin% 99’u enjeksiyon yerinde kalır4,10. Daha yakın zamanda, biyomalzeme aşı taşıyıcılarının büyüklüğü, bu aşıların interstisyel akış yoluyla LN’lere tercihli ticaretini veya drenajını iyileştirmek için ayarlanmıştır8,10. Bu gelişmeler, LN ortamının yeni aşılar için hedeflenme ve mühendisliğinin öneminin altını çizerek hücresel ve humoral immün yanıtların artmasına yol açmıştır.
Bu makale, kontrollü salınımlı aşı depoları5,11oluşturmak için lipid stabilize polimer parçacıklarını ve i.LN. teslimatlarını birleştiren bir aşılama protokolü sunun. İ.LNiçin cerrahi teknikler kullanan son çalışmalara dayanarak. farelerde6,7,12,13, küçük hayvanlara biyomalzeme aşıları enjekte etmek için hızlı, cerrahi olmayan bir strateji geliştirdik5. i.LN. dağıtımını biyomalzeme aşı taşıyıcıları ile birleştirmek, kontrollü salınımlı aşı depolarının tek bir enjeksiyonundan sonraki 7 gün içinde CD8 T hücre yanıtını güçlü bir şekilde artırmıştır5. Güçlü bir humoral yanıt(yani antikor titreleri) de üretildi; her iki gelişme de, biyomalzeme taşıyıcılarından kontrollü salınımla aracılık edilen lenf düğümlerinde aşı bileşenlerinin daha fazla tutulmasıyla bağlantılıydı. İlginçtir ki, aşı parçacıklarının boyutu bu malzemelerin kaderini bir kez LN’lerde değiştirdi: nano ölçekli parçacıklar hücreler tarafından doğrudan alımın arttığını gösterirken, daha büyük mikropartiküller hücre dışı LN ortamında kaldı ve LN yerleşik antijen sunan hücreler tarafından alınan kargoyu(örneğin adjuvan) serbest bıraktı5. Bu veriler, i.LN enjekte edilen biyomalzemelerin boyutunu kontrol ederek yeni aşılar için yararlanabilecek iki yol olduğunu göstermektedir.
Bu makalede biyobozunur lipid stabilize polimer parçacıkları (mikro ve nano ölçekli) modifiye çift emülsiyon stratejisi kullanılarak sentezlenir5,11. Partikül özellikleri lazer kırınımı ve mikroskopi ile karakterizedir. Bu parçacıklar daha sonra yaygın, toksik olmayan bir izleyici boyası14kullanılarak cerrahi olmayan olarak tanımlanan kasık LN’lerine doğrudan enjekte edilir. LN’lerin histoloji veya akış sitometrisi ile enjeksiyon sonrası analizi, parçacıkların LN ortamında dağılımını doğrulamak ve zaman içinde parçacıkların hücresel alımını ve tutulmasını izlemek için kullanılabilir. Histolojik işleme ve akış sitometrisini ayrıntılı olarak açıklayan protokoller için, okuyucular son JoVE makalelerine ve dergi raporlarına atıfta bulunulur15-22. Tipik sonuçlar, güçlü, verimli bağışıklık yanıtları elde etmek veya hedef patojenler için bağışıklığı uyarlamak için yararlanılabilen bu depoların yerel LN hedeflemesini göstermektedir.
Bu protokolde açıklanan teknik, aşıların LN’lere ve LN yerleşik antijen sunan hücrelere kontrollü olarak ulaştırılmasını sağlar. Biyomalzeme kapsüllü kargo LN içinde yerelleştirilebilir ve LN mikroçevrimine teslim edilen bir veya daha fazla kargo türünün dozlarının manipülasyonunu sağlar. Polimer parçacıklarından lokalizasyon ve kontrollü salınımın, geleneksel yaklaşımlara göre önemli ölçüde daha düşük dozlarda güçlü bir hücresel ve humoral immün yanıt ürettiği gösterilmiştir. Ayrıca, biyomalzeme taşıyıcı boyutunun manipülasyonu yoluyla, hücresel işlemenin birincil modu nanopartiküllerin doğrudan alınması veya daha büyük mikropartiküllerden hücre dışı kargo salınımı arasında modüle edilebilir5. Bu sonuçlar, terapötik aşı dağıtımı için bir platform olarak i.LN. biyomalzeme teslimatının fizibilitesini ortaya oturtur.
PLGA parçacıklarının emülsiyon/solvent buharlaşması ile sentezi ilaç dağıtım uygulamalarında yaygın olarak23,24. Bu nedenle, bu teknikle ilişkili potansiyel zorluklar çoğunlukla LN hedef sahasında aşıların başarılı bir şekilde tanımlanması ve birikmesi ile ilgilidir. İzleyici boya kullanımı hedeflenen kasık LN’lerinin görselleştirilmesini kolaylaştırsa da, cildin altındaki hedef boyut ve derinlik küçüktür. Bu nedenle, yazarlar farelerin hazırlanmasını ve enjeksiyonlarını uygulamak için zaman ve fare tahsis etmeyi önerir. Hayvan hazırlığı sırasında(yani tıraş ve depilasyon uygulaması), bacağın karınla olan açısının cildi makaslardan yaralanmaya daha yatkın hale getirdiği hayvanın ventral tarafındaki fareleri kesmemeye özen edilmelidir. Ek olarak, hayvanların normal bakım davranışı sırasında kremi yutmasını önlemek için tüm epilasyon ılık suyla çıkarılmalıdır. LN enjeksiyonlarını uygulamak için, daha yüksek bir izleyici boya konsantrasyonu uygulanabilir ve hayvanlar ötenaziye tabi edilebilir ve daha sonra birden çok kez enjekte edilebilir. Enjeksiyon fareleri nekropsilenebilir ve enjekte edilen hayvanlardan gelen LN’lerin büyüklüğü, seçilmemiş bir kontrol LN ile karşılaştırılabilir. Bu tekniğin bir sınırlaması, LN yapısına yüklenebilen enjeksiyon hacminin fiziksel sınırıdır. Protokolümüz farelerde 10 μl enjeksiyon hacmi önermektedir, ancak diğer çalışmalar en az 20 μl kadar yüksek enjeksiyon hacimleri bildirmektedir.
Belirtildiği gibi, parçacıkların fiziksel özelliğini(yani boyutunu) değiştirmek, LN dokusundaki biyomalzemeler ve kapsüllenmiş kargolar tarafından indüklenen yolu veya sonuçları değiştirmek için etkili bir mekanizmadır. Emülsiyon/çözücü buharlaştırma protokolü, yüzey yükü veya işlevselliği ve biyobozunurluk/kargo salınımı oranı23,24gibi fiziksel veya kimyasal özellikleri değiştirmek için kolayca değiştirilebilir. Örneğin, salınım kinetiği alternatif polimer bileşimleri aracılığıyla ayarlanabilir ve yüzey fonksiyonu modifiye lipid bileşimleri veya poli (vinil alkol) kullanılarak değiştirilebilir. Parçacıklara yüklenen kargo, hedef patojenler için farklı antijenler veya adjuvanlar içerecek şekilde kolayca manipüle edilebilir. Bu yaklaşımın avantajı, i.LN. teslimatının biyomalzemelerden kargonun yerel, kontrollü salınımı ile birleştirilmesiyle elde edilir. Bu sinerji, dakika dozları kullanarak ve spesifik olmayan / sistemik yan etkileri azaltılmış adaptif bağışıklık yanıtları verimli bir şekilde üretmek için yararlanılabilir bir platform oluşturur.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen PhRMA vakfı ve Maryland Üniversitesi, College Park’tan bir Araştırma ve Akademik Ödülü tarafından finanse edildi. Prof. DarrellIrvine’e, “Lenf nodu mikroçevresinin adjuvan salınımlı polimer parçacıklarının intranodal enjeksiyonu yoluyla yerinde mühendisliği” tamamlanmasında yapılan ilk çalışmaların desteği için teşekkür ederiz. 5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |