Abstract
Als retrograde Markierung retinalen Ganglienzellen (RGC) kann RGZ Somata von sterbenden Websites zu isolieren, hat sich der Goldstandard für die Zählung in RGZ RGZ Überleben und Regenerationsversuche. Viele Studien haben in Säugetieren durchgeführt, um RGZ Überleben nach Verletzung des Sehnervs zu erforschen. Allerdings hat retrograde Markierung von RGC in erwachsenen Zebrafisch noch nicht berichtet worden, obwohl einige alternative Methoden können Zellzahlen in retinalen Ganglienzellschichten (RGCL) zählen. In Anbetracht der geringen Größe des erwachsenen Zebrafisch Schädel und das hohe Risiko des Todes nach dem Bohren auf dem Schädel, öffnen wir den Schädel mit Hilfe von Säure-Ätz-und versiegeln das Loch mit einem lichthärtenden Bindung, die die Überlebensrate deutlich verbessern konnte. Nach Absorption der Farbstoffe für 5 Tage, sind fast alle markierten RGCs. Da diese Methode muss nicht den Sehnerv durchschneiden, ist es in der Forschung der RGZ Überleben unersetzlich nach Sehnerv verknallt in erwachsenen Zebrafisch. Hier stellen wirdieses Verfahren Schritt für Schritt und repräsentative Ergebnisse liefern.
Introduction
Wie erwachsenen Zebrafisch haben eine starke Fähigkeit zur Axone nach Verletzung des Sehnervs 1 regenerieren, eine geeignete Methode zu zählen, die ganze RGZ ist wichtig, um das Überleben und die Regeneration RGZ 2 auszuwerten. Basierend auf den Methoden der retrograde Markierung RGZ in Säugetier-und Goldfisch 3-5 konstruierten wir die Methode, um von der RGZ Tectum in erwachsenen Zebrafisch zu beschriften. Bei erwachsenen Zebrafisch, sollten zwei kritischen technischen Belange beachtet werden: der Schädel des erwachsenen Zebrafisch ist sehr klein, 6; sie leben in einer Wasserumgebung. Hier behandeln wir den Schädel mit Ätzmittel, die die Gefahren, die mit Bohrungen 5 zugeordnet minimiert. Dann haben wir das Loch versiegeln mit lichthärtenden Bindung, die das Überleben der Tiere nach der Operation verbessert.
Bisher wurden mehrere andere Techniken angenommen, um RGZ Nummer auf indirekte Weise zu zählen. HE-Färbung in der Retina Abschnitte Etiketten aller Arten von Zellen in der RGCL 7. Antikörpermarkierung in der ganzen retina wie Insel-1, können auch beschriften Amacrinzellen 8. Obwohl retrograde Label aus der Sehnerv Stumpf können alle RGZ in der Netzhaut zu kennzeichnen, kann er nicht in das Gedränge Modell übernommen werden, da sie bewirkt, dass zusätzliche Schädigung des Sehnervs. Unter Ausnutzung der retrograden Etikett von der Tectum haben wir RGZ Überleben und die Regeneration im Sehnerv verknallt erforscht. Die Ergebnisse zeigen, dass fast alle RGZ überlebt und über 90% der RGZ regeneriert, um der Tectum in der ersten Woche im Gedränge Modell 9.
Um alle RGZ erfolgreich zu kennzeichnen, wurde Dil Paste nach Vergleich mit mehreren anderen Handelsfarbstoffen 10 gewählt. Erstens ist es insbesondere für in vivo Gewebemarkierungs gestalten. Zweitens ist es ein lipophiler Farbstoff, der nicht in Wasser diffundieren kann. Zusätzlich kann diese Fluoreszenz für eine lange Zeit, die es zu einem hervorragenden Kandidaten für RGCs Überleben Forschung macht anhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruieren Sie das Gerät Chirurgie
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass während und nach der Operation, Tropfanästhesie-Lösung Ethyl-3-Aminobenzoat methanesulfonate (MS-222 oder Tricaine) bei einem halben Konzentration (0,015%) mit einer Geschwindigkeit von 1 Tropfen / s durch den Mund des Fisches die Fische am Leben bleibt mit einem in Abbildung 1 dargestellt selbstgebauten Tropfsystem.
- Machen Sie ein Feld wie in 1A gezeigt (Länge 28 cm, Breite 10 cm, Höhe 5 cm), legte ein Schwamm (Länge 6 cm, Breite 9 cm, Höhe 4 cm) in der Mitte, und öffnen Sie ein Lücke auf sie.
- Machen Sie eine glatte Fläche auf der Kugelstern Ende der Nadel mit lichthärtenden Bindung (Abbildung 1B), die dann in das Fischmaul eingefügt werden. Sicherzustellen, dass die Oberfläche der Nadel glatt an den Mund des Fisches vor Beschädigung zu schützen ist.
- Fügen Sie die Hälfte Konzentration von MS-222 (linke Kammer, Länge 6 cm, Breite 10 cm, Höhe 8 cm) und Salzlösung (rechte Kammer, Länge 4 cm, Breite 10 cm, Höhe 8 cm) mit den Reservoirs, wie in 1C gezeigt. Hinweis: Frische MS-222 wird empfohlen.
- Anesthetize Fisch in 0,03% MS-222 für 2 min.
- Den Fisch in die Lücke der Schwamm und fixieren Sie die Fische mit zwei Paaren von Stiften, hinter der Brustflosse und neben der Kloakenporen bzw. 11 eingesetzt.
- Verbinden Sie den Fisch in den Mund, MS-222 und Aufzucht Wasser mit einem T-Typ Rohr wie in 1C gezeigt.
- Schalter auf dem Rohr zu dem MS-222 verbunden.
2. Retrograde Label-RGZ von rechts Tectum
HINWEIS: Vor Beginn Desinfektion aller Geräte, die mit 70-75% Ethanol, so dass kein Ethanol bleibt.
- Rossing: die Haut über den ganzen Schädel mit sclerectome leicht entfernen (dorsale Ansicht des Schädels in den 2A und 2B gezeigt
- Clearing: Waschen Sie den Schädel mit Kochsalzlösung und dann trocknen Sie es mit Ohrwasch Glühbirne.
- Initial Korrosion: Korrosion der Schädel mit dem Ätzmittel für 10 Sekunden.
- Clearing: vollständig abwischen das Ätzmittel mit einem Wattestäbchen und dann waschen Sie den Bereich mit Kochsalzlösung und trocknen.
- Schutz: Um den Schädel in anderen Bereichen außer dem Recht Tectum von überschüssigem Korrosion zu schützen, decken diese Bereiche mit lichthärtenden Bindung und dann heilen sie durch die Einwirkung von blauem Licht mit tragbaren Leucht.
- Komplette Korrosion: Legen Sie das Ätzmittel im zentralen Bereich des rechten Tectum wieder für die komplette Ätzen für 2 min. Hinweis: Da Schädel von älteren Fische sind verkalkt, wird Korrosion länger dauern.
- Clearing: vollständig abwischen das Ätzmittel mit einem Wattestäbchen und dann waschen Sie den Bereich mit Kochsalzlösung und trocknen Sie es noch einmal.
- Schädel Eröffnung: vorsichtig die malacic Schädel (2C) mit einer Pinzette, um die richtige Tectum (2D aussetzen
- Clearing: Wischen Sie den Schleim und Blut aus dem Loch ausströmende mit Stücken von Gelschaum und waschen Sie es mit Kochsalzlösung, bis die Blutung aufgehört hat.
- Dye Platzierung: setzen Sie den Farbstoff (Gewebe-Markierungspaste) auf der gesamten rechten Tectum und bedecken Sie es mit Gelschaum.
- Trennung: decken Sie das Loch mit einer sterilen Skala von demselben Tier.
- Dichtung: Ort, Lichthärte Bindung auf die Waage und dann heilen sie mit Blaulicht wieder für 40 Sekunden.
- Revival: Waschen Sie die Oberfläche der Anleihe und beleben das Tier mit Kochsalzlösung.
- Pflege und Zucht: Halten Sie den Fisch in 28,5 ° C Embryo Medium (ZFIN) für 5 Tage und Zulauf 2 mal / Tag. Sie sind nicht Fisch, dessen Farbstoff nicht in der Tectum für 5 Tage in dem Experiment bleiben. Hinweis: Embryo-Medium (EM)-Lösung ist für Fische Überleben und Temperatur ist der Schlüsselfaktor für Dil-Kennzeichnung.
3. Wholemounting Retina und Imaging
- Legen Sie den Fisch in einem Dunkelfeld für 2 Stunden, bevor die Netzhautlemount.
- Anesthetize die Fische mit Eiswasser.
- Stechen Sie ein Loch in den Rand der Hornhaut und eine Augenmuschel durch Entfernen der Hornhaut mit venus Schere.
- Nehmen Sie die Linse und dann spülen Sie das Zentrum der Netzhaut mit eiskaltem 1x PBS.
- Spülen Sie die Lücke zwischen Netzhaut und Lederhaut mit eiskaltem 1x PBS, bis kein Pigment übrig ist.
- Schneiden Sie den Sehnerv an der Scheibe.
- Halten Sie die RGC-Schicht nach oben und halten Sie die Netzhaut mit einem selbstgefertigten Glaslöffel (3A und 3B). Eine Pipette kann auch verwendet werden, um die Netzhaut übertragen werden.
- Setzen Sie die Netzhaut in einem Tropfen eisigen 30% Glycerin auf einem Objektträger mit der RGC-Schicht nach oben (3C).
- Entfernen Sie das Glycerin und dann flach auf die Netzhaut auf dem Glasträger vor dem Schneiden Netzhaut in vier Quadranten (Abbildung 3D). Halten Sie die Netzhaut entfaltet mit RGC Schicht nach oben hilfreich für die Abflachung der Netzhaut sein.
- Drip eisigen 50% Glycerin auf Ter Netzhaut weg zu waschen die Fragmente der Pigment.
- Entfernen Sie das Glycerin und dann fallen 20 ul eisigen 75% Glycerin auf der Netzhaut.
- Decken Sie die Probe mit einem 1,8 cm x 1,8 cm im Quadrat Deckglas.
- Deckglas mit Nagellack. Unmittelbare Abbildung der Netzhaut empfohlen.
- Bild ohne Zeilensprung die ganze Netzhaut unter einem 20fach Objektiv (NA = 0,70) mit DP72 CCD (jedes Bild ist 1360 x 1024 Pixel). Jedes Feld hat drei unterschiedliche Schwerpunkte.
- Verlängern Sie die Tiefe jedes Feld mit dem Instrument der "erweiterten Schärfentiefe" in der Software.
- Montieren Sie einen virtuellen Netzhaut mit der Funktion der Photomerge.
- Wählen drei Felder von 680 x 512 Pixel (tatsächliche Fläche beträgt 350 &mgr; m 264 &mgr; m, 0,092 mm 2) in jeder Ausrichtung der Retina durchschnittlichen Dichte von RGCs (4A) zu analysieren.
- Erhalten Sie den Bereich mit der Funktion der Messungen - erstellen Sie ein Polygon-Feature im BildSoftware.
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der RGZ durch die Gleichung "RGZ Nummer = Schicksal x-Bereich" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wie 4B-D-Show, ist die Anzahl der DiI +-Zellen zwei Drittel der DAPI +-Zellen in RGCL. In einer normalen Netzhaut, ein Montagebild der gesamten Netzhaut (Fig. 4E) zeigt Dil + RGCs werden über die gesamte Netzhaut, sondern in einem regenerierten Netzhaut (Fig. 4F), wie RGCs im Zentralbereich nicht zu ihrem Ziel zu regenerieren verteilten In der ersten Woche, konnten sie nicht markiert werden.
Abbildung 1. Die Operation Vorrichtung zur retrograden Markierung von RGC verwendet. (A) mit einem Schwamm (a), um die Fische zu beheben. Die Betriebssystem-Plattform (Länge 28 cm, Breite 10 cm, Höhe 5 cm) und Infusionsschlauch über eine Metallnadel (b) verbunden. Überschüssiges Wasser wird in dem Hohlraum (c) gespeichert. (B) A close-up für die Metall-Nadel. Der Kopf der Nadel ist mit Lichthärtebindung (d) gewickelt. (C) Ausgleichsbehälter sind zur Lagerung MS-222 verwendet (e, Länge 6 cm, Breite 10 cm, Höhe 8 cm) und Salzlösung (f, Länge 4 cm, Breite 10 cm, Höhe 8 cm) sind. Die Infusionsröhre (g) den Behälter und die Metallnadel.
2. Rückenansicht des Schädels erwachsenen Zebrafisch. (A) Intact Schädel vor Rossing. Die gelb gestrichelte Linie markiert die Tectum; die rote gestrichelte Linie markiert die Telen; und die grüne gestrichelte Linie markiert das Kleinhirn. (B) nach Schädel Haut entfernt. (C) Nach der Korrosion mit Ätzmittel, der Schädel ist malacic und eine konkave Fläche wird durch die Zange (weiß *) hingewiesen. (D) mit der rechten Tectum ausgesetzt ist nach dem Schädel entfernt wird. Scale ist 500 & #956, m.
Abbildung 3. Key Schritte wholemounting Netzhaut. (A) Homebuilt Glaslöffel zum Schöpfen Netzhaut zeigt unteren Bild die ganze Sicht. (B) Halten Sie die Netzhaut mit der "Löffel" (durch die gestrichelte Linie gekennzeichnet). (C) zum Transport der Netzhaut in eiskaltes 30% Glycerin. ( D) Schneiden Sie die Netzhaut in 4/4; Pfeil zeigt die Orientierung der Schneiden. Maßstabsbalken (A) = 1 mm; (BD) 500 &mgr; m.
B ild 4. Die Probenahme Zählen von RGCs in virtuellen Retina. (A) Schematische Darstellung der Netzhaut hat vier Felder (N, D, V, T-Feld), und jeder von ihnen hatdrei Felder, die in einem weißen Feld angezeigt werden. Beachten Sie die Papille ist in der Regel an der ventralen-zeitliche Orientierung (schwarzer Punkt) befindet. (B) Dil (E) Montage Bild des ganzen Netzhaut gekennzeichnet RGZ. (C) DAPI markierten Zellkern. (D) fusioniert Bild von RGZ und Kern. in normalen Zebrafisch. (F) Montage-Bild zeigt regeneriert Netzhaut Sehnerv nach Verletzung. Der zentrale Bereich der Netzhaut nicht markiert als RGCs nicht ihre Ziele in der ersten Woche regeneriert. Abkürzungen: N = nasal, D = Rücken-, V = ventralen, T = zeitlich. Maßstabsbalken: 30 um (BD); 500 um (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retrograde Markierung von RGCs ist wichtig, RGCs Überleben in Säugetieren zu erforschen, aber es war nicht in Zebrafisch verwendet. Die alternativen Methoden, HE-Färbung 7 und 8 Antikörper-Färbung, sind nicht Goldstandards zum Zählen RGZ Nummer und transgenen Linien mit allen RGZ markiert wurde noch nicht gebaut 12, 13 ist. In diesem Video stellen wir eine Methode, um Label RGZ in der Netzhaut des erwachsenen Zebrafisch rückläufig. Obwohl etwa 1% der Axone zu Riechkolben oder anderen Bereichen 14, kann dieses Verfahren fast alle RGCs in der Netzhaut zu beschriften.
Wie Zebrafische sind zu fragil, um die Verletzungen zu tragen, das Öffnen der Schädel des erwachsenen Zebrafisch mit Skalpell Schnitt 3 oder einem Bohrer 5, 15 können zum Tod führen. Erweichung der Schädel mit Ätzmittel können die Schäden am Gehirn zu minimieren. Durch die Versiegelung das Loch mit einem Lichthärtebindung und die Festsetzung es unter blauem Licht,die meisten Fische überleben nach der Operation. Es dauert nur 12-15 Minuten, bis die Operation unter kompetenter Operation durchzuführen, die im Vergleich zu Ratten und andere Säugetiere 5 bequemer und effizienter ist.
Dil Gewebe-Kennzeichnung Paste ist eine lipophile Farbstoff. Verglichen mit DiI Kristalle oder Mikroinjektion von konzentrierten Lösungen, verbessert dies die Penetration des Farbstoffs in das Gewebe, Kennzeichnung Axone auf und unter der Oberfläche. Zusätzlich kann die Fluoreszenz für eine lange Zeitdauer 10 bestehen. Andererseits wird dieser Farbstoff durch passive Transportweges aufgenommen, so ist es notwendig, den Farbstoff in der Tectum für mindestens 5 Tage für eine vollständige Kennzeichnung zu verlassen.
Der Zebrafisch ist ein ausgezeichneter Modellorganismus der visuellen Regeneration. An 7 Tagen nach Sehnerv verknallt, die fast alle RGC Axone regenerieren Tectum, aber nur die Hälfte der RGZ regenerieren im Sehnerven Schnittmodell 9. Diese Methode ist eine ideale Möglichkeit, RGC Forschungs Überleben und die Regeneration nach dem Sehnerv zu vernichten, was zusätzliche Verletzungen auf den Sehnerv zu vermeiden könnte.
Wir haben eine vollständige Protokoll für die erfolgreiche retrograde Markierung RGZ in erwachsenen Zebrafisch und die Messung der RGZ-Nummer in einem Retina wholemount vorgestellt. Zusätzlich wird durch Verwendung eines Lichthärtebindung, erhöhen wir die Überlebensrate von Zebrafisch, der diese Methode effektiver zu gestalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
