Abstract
Как ретроградные маркировки ганглиозных клеток сетчатки (РГК) можно выделить РГК somata от смерти сайтов, он стал золотым стандартом для подсчета РГК в РСК выживания и экспериментов по регенерации. Многие исследования были проведены у млекопитающих животных для исследования РГК выживаемость после зрительного повреждения нерва. Тем не менее, ретроградная маркировка РГК в взрослых данио до сих пор не сообщили, хотя некоторые альтернативные методы могут рассчитывать числа клеток в слоях сетчатки клеток ганглиев (RGCL). Учитывая небольшой размер взрослого данио черепа и высоким риском смерти после бурения на черепе, мы открываем череп с помощью кислотно-травления и запечатать дыру с легким отверждения связи, которые могут существенно улучшить выживаемость. После поглощения красителей в течение 5 дней, почти все РГК помечены. Поскольку этот метод не нужно секут зрительный нерв, он незаменим в исследовании РСК выживания после зрительного давке нерва в взрослых данио. Здесь мы вводимэтот метод шаг за шагом и получения репрезентативных результатов.
Introduction
Как взрослый данио имеют сильную способность к регенерации аксонов после зрительного повреждения нерва 1, правильный метод для подсчета весь РГК важно оценить РГК выживания и регенерации 2. На основе методов ретроградных маркировки РГК в млекопитающих и золотая рыбка 3 - 5, мы построили метод маркировать РГК из тектуме в взрослых данио. Для взрослых данио, две критические технические проблемы Следует отметить: череп взрослых данио очень мала 6; они живут в водной среде. Здесь мы рассматриваем череп с травителя, который сводит к минимуму опасности, связанные с бурением 5. Затем мы запечатать дыру с легким отверждения связи, который улучшает выживаемость животных после операции.
Ранее несколько другие методы были приняты для подсчета количества РГК косвенным образом. Его окрашивания в секциях сетчатки этикетки всех видов клеток в RGCL 7. Маркировка антитела в целом гЭтина, таких как островок-1, также могут маркировать амакринных клетки 8. Хотя ретроградный этикетка от зрительного нерва культи может обозначить все РГК в сетчатке, он не может быть принят в модели на раздавливание, поскольку он вызывает дополнительное повреждение зрительного нерва. Воспользовавшись ретроградной этикетке от тектуме, мы исследовали РГК выживания и регенерации в зрительного нерва давки. Результаты показывают, что почти все РГК выжил и более 90% РГК регенерируется в тектуме в первую неделю в краш-модели 9.
Для того чтобы успешно обозначить все РГК, DiI паста была выбрана после сравнения с несколькими другими коммерческими красителей 10. Во-первых, оно специально разработано для в естественных тканей маркировки. Во-вторых, это липофильный краситель, который не может диффундировать в воду. Кроме того, эта флуоресценция может сохраняться в течение длительного времени, что делает его отличным кандидатом для исследования выживаемости РСК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Построить Хирургия Аппарат
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения рыба остается живой во время и после операции, капельное анестезия решение этил-3-аминобензоат метансульфонат (MS-222, или Tricaine) на половинной концентрации (0,015%) со скоростью 1 капля / сек через рта рыбы с использованием системы капельного самодельных показано на рисунке 1.
- Сделать окно, как показано на рисунке 1а (длина 28 см, ширина 10 см, высота 5 см), положить губку (длина 6 см, ширина 9 см, высота 4 см) в середине и открыть Разрыв на нем.
- Сделать гладкую шаровидную поверхность на конце иглы с фотополимеризации связи (рис. 1В), который будет вставлен в рот рыбы. Убедитесь, что поверхность иглы гладкая для предотвращения рта рыбы от повреждений.
- Добавить концентрацию половине MS-222 (левый камера, длина 6 см, ширина 10 см, высота 8 см) и солевым раствором (справа камера, длина 4 см, ширина 10 см, высота 8 см) в резервуарах как показано на рисунке 1С. Примечание: Свежий MS-222 рекомендуется.
- Обезболить рыбу в 0,03% MS-222 в течение 2 мин.
- Поместите рыбу в зазоре губки и исправить рыбу с двумя парами булавок, вставленных за грудного плавника и рядом с клоаки поры, соответственно 11.
- Подключите рта рыбы, MS-222, и разведение водой с типа Т трубки как показано на рисунке 1С.
- Включите трубку, присоединенную к MS-222.
2. Ретроградные маркировки РГК с правого TECTUM
ПРИМЕЧАНИЕ: До начала лечить все аппараты с 70-75% этанола, чтобы ни этанол не остается.
- Россинг: немного снять кожу на весь череп с sclerectome (спинной вид черепа показано на рисунках 2А и 2В
- Клиринговый: мыть череп с солевым раствором и затем высушить его с уха стиральной лампочки.
- Начальная коррозии: коррозии череп с травителя в течение 10 сек.
- Клиринговый: полностью вытереть протравку ватным тампоном, а затем промойте эту зону физиологическим раствором и высушить его.
- Защита: в целях защиты череп в других областях, кроме правой тектуме от избыточного коррозии, покрывают эти области светом отверждения связи, а затем вылечить его воздействием синего света с портативного источника света.
- Полный коррозии: поставить травителя в центральной области правого тектуме снова для полного травления в течение 2 мин. Примечание: Так как черепа старых рыб кальцинированная, коррозии займет больше времени.
- Клиринговый: полностью вытереть протравку ватным тампоном, а затем промойте эту зону физиологическим раствором и высушить его снова.
- Открытие Череп: осторожно снимите размягчений череп (рис. 2в) щипцами, чтобы разоблачить прямо Tectum (рис. 2D
- Клиринговый: протрите слизи и выделяющие крови из отверстия с кусочками Gelfoam и промойте его физиологическим раствором, пока кровотечение не остановится.
- Размещение Краска: положить краситель (ткань-маркировка вставки) на всей правой тектуме и покрыть ее Gelfoam.
- Сегрегации: закройте отверстие стерильным шкале от того же животного.
- Уплотнение: Место свет отверждения связь на весы, а затем вылечить его синим светом снова в течение 40 сек.
- Возрождение: промыть поверхность облигации и возродить животное с физиологическим раствором.
- Уход и разведение: Держите рыбу в 28,5 ° C эмбриона среды (ZFIN) в течение 5 дней и кормить 2 раза / сут. Не включайте рыбу которого краситель не может остаться в тектуме в течение 5 дней в эксперименте. Примечание: Эмбрион среднего (ЭМ) решение является жизненно важным для выживания рыбы и температура является ключевым фактором для DII маркировки.
3. Wholemounting Retina и обработка изображений
- Поместите рыбу в темной области в течение 2 часов до сетчатки, которыеlemount.
- Обезболить рыбу смесью воды со льдом.
- Прокол отверстие в краю роговицы и сделать наглазник путем удаления роговицы с Венерой ножницами.
- Извлеките объектив и затем промыть центр сетчатки ледяной 1x PBS.
- Промойте разрыв между сетчаткой и склеры с ледяной 1x PBS до полного пигмент не осталось.
- Разрежьте зрительный нерв на диске.
- Держите слой RGC вверх и удерживайте сетчатку с самодельной стеклянной ложкой (3А и 3В). Пипетка также может быть использован для передачи на сетчатку.
- Положите на сетчатку в капле ледяной 30% глицерина на слайде со слоем РГК вверх (рис. 3C).
- Снимите глицерин, а затем сгладить сетчатку на стекло перед резки сетчатку на четыре квадранта (рис. 3D). Ведение сетчатку развернулась с РГК слоя вверх будет полезно для выравнивания сетчатку.
- Капельное ледяной 50% глицерина на тон сетчатка, чтобы смыть фрагменты пигмента.
- Снимите глицерин, а затем падение 20 мкл ледяной 75% глицерина на сетчатке.
- Накройте образец с 1,8 см х 1,8 см квадратных покровное.
- Уплотнение покровное с лаком для ногтей. Немедленное томография сетчатки рекомендуется.
- Номера для чересстрочной развертки изображения вся сетчатка под объективом 20X (NA = 0,70) с DP72 CCD (каждое изображение 1360 х 1024 пикселей). Каждое поле имеет три различные цели.
- Продлить глубину каждого поля с помощью инструмента "расширенной глубиной резкости" в программном обеспечении.
- Соберите виртуальный сетчатку с функцией Photomerge.
- Выберите три поля 680 х 512 пикселей (фактическая площадь составляет 350 мкм на 264 мкм, 0,092 мм 2) в каждой ориентации сетчатки проанализировать среднюю плотность РГК (рис. 4а).
- Получить области с функцией измерения - создать полигональный в изображениипрограммное обеспечение.
- Рассчитайте общее количество РГК уравнением "число РГК = судьба х площадь" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как фиг.4В-D показывают, количество DII + клеток составляет две трети DAPI + клеток в RGCL. В нормальной сетчатки, монтаж изображение всей сетчатки (рис. 4E) показывает, что DiI + РСК распределены по всей сетчатке, а в регенерированной сетчатки (рис. 4F), а РСК в центральной области не регенерируют к цели на первая неделя, они не могли быть помечены.
Рисунок 1. Операция аппарат, используемый для ретроградного маркировки РГК. (А) Используйте губку (а) исправить рыбу. Операционная платформа (длина 28 см, ширина 10 см, высота 5 см) и вливание трубка соединены через металлическую иглу (B). Избыток воды хранится в полости (с). (B) Крупный план на металлической иглы. Голова ушко обернут свет отверждения связи (г). (C) Резервуары предназначены для хранения MS-222 (е, длина 6 см, ширина 10 см, высота 8 см) и физиологический раствор (е, длина 4 см, ширина 10 см, высота 8 см), соответственно. Настой трубка (г) соединяет резервуар и металлическую иглу.
Рисунок 2. Спинной вид черепа взрослых данио. (А) Неповрежденный черепа до Россинг. Желтый пунктирная линия отмечает Tectum; красная пунктирная линия отмечает конечного мозга; и зеленая пунктирная линия отмечает мозжечок. (В) Череп после снятой кожей. (С) После коррозии с травителя, череп размягчений и вогнутая область указал щипцов (белый *). (D) правой Tectum подвергается после череп удаляется. Масштаб 500 & #956; м.
Рисунок 3. Основные этапы wholemounting сетчатку. (А) самодельных стекло ложка для черпая сетчатку, Нижнее изображение показывает весь вид. (B) Держите сетчатку с "ложкой" (отмечены пунктиром). (С) Транспорт сетчатку в ледяной 30% глицерина. ( D) Вырезать сетчатку на 4 квартала; Стрелка указывает ориентацию резки. Масштабные бары (A) 1 мм; (BD) 500 мкм.
F На рис 4. Выборка РГК подсчета в виртуальном сетчатки. (А) Схематическое изображение сетчатки имеет четыре поля (N, D, V, полевые Т) и каждый из них имееттри поля, которые показаны в белой коробке. Обратите внимание, что диск зрительного нерва, как правило, расположены в брюшной временной ориентации (черная точка). (В) DiI помечены РГК. (С) DAPI помечены ядро. (D) Merged картина РГК и ядра. (Е) Монтаж образ всей сетчатки в нормальном рыбок данио. (F) Монтаж изображение, показывающее регенерированного сетчатку после зрительного повреждения нерва. Центральная площадь сетчатки не помечены как РГК не регенерируется к своим целям в первую неделю. Сокращения: N = носа, D = спинной, V = вентральной, Т = временная. Масштабные бары: 30 мкм (BD); 500 мкм (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retrograde маркировка РСК важно, чтобы исследования РСК выживаемость у млекопитающих, но это не был использован в данио рерио. Альтернативные методы, ОН окрашивания 7 и окрашивание антител 8, не золотые стандарты для подсчета количества ГКС, и трансгенных линий со всеми РСК меченых еще не были построены 12, 13. В этом видео, введем метод ретроградной РГК этикеток в сетчатке взрослых данио. Хотя около 1% аксонов проекта в обонятельной луковице или других областей 14, этот метод может маркировать почти все РГК в сетчатке.
Как данио слишком хрупки, чтобы нести физические травмы, открывая череп взрослых данио с скальпеля разрез 3 или дрелью 5, 15 может привести к смерти. Смягчение череп с травителя можно свести к минимуму повреждение мозга. За счет уплотнения отверстие с легкой отверждения связи и фиксации его под голубым светом,большинство рыб выжить после операции. Это займет всего 12-15 минут, чтобы выполнить операцию под опытным работы, что является более удобным и эффективным по сравнению с крысой и других млекопитающих животных 5.
DiI ткани маркировки паста липофильный краситель. По сравнению с DII кристаллов или микроинъекции концентрированных растворах, это улучшает проникновение красителя в ткань, маркировка аксонов и на и под поверхностью. Кроме того, флуоресценция может сохраняться в течение длительного периода времени 10. С другой стороны, этот краситель поглощается пассивного транспортного пути, поэтому необходимо оставить краситель в тектуме в течение по крайней мере 5 дней для полного маркировки.
Данио является отличным модельный организм визуального регенерации. В течение 7 дней после зрительного нерва давке, почти все РГК Axon регенерации в тектуме, но только половина из РГК регенерации в зрительном разреза нерва модели 9. Этот метод является идеальным способом для поиска RGCс выживания и регенерации после зрительного нерва давке, которая может избежать дополнительной травмы на зрительный нерв.
Мы представили полный протокол для успешного ретроградных маркировки РГК в взрослых данио и измерения количества РГК в Wholemount сетчатки. Кроме того, с помощью света отверждения связь, мы увеличивают выживаемость данио, которые делают этот метод более эффективным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
