Abstract
وضع العلامات خلايا الشبكية العقدة كما الوراء (RGCs) يمكن عزل RGCs somata من الموت المواقع، فقد أصبح معيار الذهب لحساب RGCs في بقاء RGCs والتجارب التجدد. وقد أجريت العديد من الدراسات في الحيوانات الثديية للبحث بقاء RGCs بعد إصابة العصب البصري. ومع ذلك، لم يتم حتى الآن وضع العلامات ذكرت الوراء من RGCs في الزرد الكبار، على الرغم من بعض طرق بديلة يمكن الاعتماد أعداد الخلايا في شبكية العين طبقات الخلايا العقدية (RGCL). بالنظر إلى حجم صغير من الكبار الجمجمة الزرد ومخاطر عالية للوفاة بعد الحفر على الجمجمة، ونحن فتح الجمجمة مع مساعدة من حمض النقش وختم الحفرة مع السندات علاج الخفيفة، والتي يمكن أن تحسن كبير في معدل البقاء على قيد الحياة. بعد امتصاص الأصباغ لمدة 5 أيام، وصفت تقريبا جميع RGCs. كما لا تحتاج هذه الطريقة إلى القطع العصب البصري، بل هو لا يمكن الاستغناء عنه في مجال البحث من بقاء RGCs بعد سحق البصرية العصبية في الزرد الكبار. هنا، ونحن نقدمهذه الخطوة خطوة، وطريقة تقديم نتائج ممثل.
Introduction
كما الزرد الكبار لديهم قدرة قوية لتجديد محاور عصبية بعد إصابة العصب البصري 1، وهي الطريقة الصحيحة لحساب RGCs كله أمر ضروري لتقييم بقاء RGCs والتجديد 2. استنادا إلى طرق وضع العلامات RGCs إلى الوراء في الثدييات وذهبية 3-5، اقمنا طريقة لتسمية RGCs من السقف في الزرد الكبار. لالزرد الكبار، وتجدر الإشارة إلى شاغلين التقنية الحرجة: جمجمة الزرد الكبار صغيرة جدا 6؛ أنهم يعيشون في بيئة المياه. هنا، ونحن علاج الجمجمة مع منمش مما يقلل المخاطر المرتبطة حفر 5. ثم، فإننا ختم حفرة مع السندات علاج ضوء الذي يحسن البقاء على قيد الحياة الحيوانية بعد الجراحة.
سابقا، تم اعتماد العديد من التقنيات الأخرى لحساب عدد RGCs بطرق غير مباشرة. سعادة تلطيخ في الأقسام الشبكية تسميات جميع أنواع الخلايا في RGCL 7. وضع العلامات الأجسام المضادة في ص كلهetina، مثل جزيرة-1، ويمكن أيضا تسمية الخلايا عديم الاستطالات 8. على الرغم من التسمية إلى الوراء من الجدعة العصب البصري يمكن تسمية كل RGCs في شبكية العين، فإنه لا يمكن اعتمادها في نموذج سحق لأنه يسبب الإصابة إضافية إلى العصب البصري. الاستفادة من التسمية إلى الوراء من السقف، ولقد بحثت بقاء RGCs والتجديد في سحق البصرية العصبية. تظهر النتائج أن ما يقرب من جميع RGCs نجا وأكثر من 90٪ من RGCs مجدد إلى السقف في الأسبوع الأول في النموذج سحق 9.
من أجل تسمية كل RGCs بنجاح، وقد تم اختيار معجون الجاذبة بعد المقارنة مع العديد من الأصباغ التجارية الأخرى 10. أولا، ومصمم خصيصا لوضع العلامات في الجسم الحي الأنسجة. ثانيا، بل هو صبغ محبة للدهون التي لا يمكن منتشر في الماء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا مضان تستمر لفترة طويلة مما يجعله مرشح ممتاز للبقاء RGCs البحوث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بناء جهاز جراحة
ملاحظة: لضمان بقاء الأسماك على قيد الحياة أثناء وبعد العملية، التخدير بالتنقيط الحل إيثيل methanesulfonate 3 أمينوبنزوات (MS-222، أو تريكين) في نصف تركيز (0.015٪) مع سرعة 1 قطرة / ثانية من خلال فم السمكة باستخدام نظام homebuilt بالتنقيط هو مبين في الشكل 1.
- جعل مربع كما هو مبين في الشكل 1A (طولها 28 سم، عرض 10 سم، ارتفاع هو 5 سم)، وضعت اسفنجة (طولها 6 سم، والعرض هو 9 سم، هو الارتفاع 4 سم) في الوسط، وفتح الفجوة على ذلك.
- جعل سطح كروي سلس في نهاية الإبرة مع السندات علاج ضوء (الشكل 1B) التي سيتم بعد ذلك إدخالها في فم السمكة. تأكد من أن سطح الإبرة على نحو سلس لمنع فم السمكة من التلف.
- إضافة تركيز نصف MS-222 (غرفة اليسار، طولها 6 سم، والعرض هو 10 جم، هو الارتفاع 8 سم) والمياه المالحة (غرفة الحق، هو طول 4 سم، عرض 10 سم، ارتفاع 8 سم) إلى الخزانات كما هو مبين في الشكل 1C. ملاحظة: ينصح الطازجة MS-222.
- تخدير الأسماك في 0.03٪ MS-222 لمدة 2 دقيقة.
- وضع الأسماك في الفجوة من الاسفنج وإصلاح السمك مع اثنين من أزواج من الدبابيس، وإدراج وراء الزعنفة الصدرية وبجانب المسام مذرقي، على التوالي 11.
- ربط فم السمكة، MS-222، والماء تربية مع أنبوب نوع T كما هو مبين في الشكل 1C.
- تشغيل الأنبوب متصلا MS-222.
2. RGCs التسمية إلى الوراء من السقف الحق
ملاحظة: قبل البداية، تطهير جميع الأجهزة مع 70-75٪ من الإيثانول، وضمان أن لا يبقى الايثانول.
- Rossing: إزالة قليلا من الجلد فوق الجمجمة كله مع sclerectome (يظهر رأي ظهري من الجمجمة في أرقام 2A و 2B
- المقاصة: غسل الجمجمة بمحلول ملحي ثم جففه مع الأذن غسل مبة.
- تآكل الأولي: تآكل الجمجمة مع منمش لمدة 10 ثانية.
- المقاصة: يمسح تماما بعيدا منمش مع مسحة القطن ومن ثم غسل المنطقة بمحلول ملحي وجففه.
- الحماية: من أجل حماية الجمجمة في مجالات أخرى عدا السقف الحق من التآكل الزائد، وتغطي هذه المناطق مع السندات ضوء التصلب ومن ثم علاجه عن طريق التعرض للضوء الأزرق مع إنارة المحمولة.
- تآكل كاملة: وضع منمش في المنطقة الوسطى من السقف الحق مرة أخرى لاستكمال الحفر لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: منذ الجماجم من الأسماك الأكبر سنا متكلسة، وسوف يستغرق وقتا أطول للتآكل.
- المقاصة: يمسح تماما بعيدا منمش مع مسحة القطن ومن ثم غسل المنطقة بمحلول ملحي وجففها مرة أخرى.
- فتح الجمجمة: إزالة بعناية الجمجمة متلين (الشكل 2C) مع ملقط لفضح 2D السقف اليمين (الشكل
- المقاصة: مسح المخاط والدم effusing من الحفرة مع قطع من جلفوم وغسله بمحلول ملحي حتى توقف النزيف.
- وضع الصبغة: وضع الصبغة (لصق الأنسجة وضع العلامات) على السقف الحق كله، وتغطية ذلك مع جلفوم.
- فصل: تغطية الحفرة مع مقياس العقيمة من نفس الحيوان.
- وختم: السندات ضوء المكان المعالجة على نطاق وثم علاجه مع الضوء الأزرق مرة أخرى لمدة 40 ثانية.
- إحياء: غسل السطح من السندات وإحياء الحيوانات بمحلول ملحي.
- التمريض والتربية: الحفاظ على الأسماك في 28.5 درجة مئوية الجنين المتوسطة (ZFIN) لمدة 5 أيام وإطعام 2 مرات / يوم. لا تشمل الأسماك التي تفشل في البقاء في السقف لمدة 5 أيام في التجربة الصبغة. ملاحظة: الأجنة المتوسطة (EM) حل أمر حيوي لبقاء الأسماك ودرجة الحرارة هي العامل الرئيسي لوضع العلامات الجاذبة.
3. Wholemounting الشبكية والتصوير
- وضع الأسماك في حقل مظلم لمدة 2 ساعة قبل شبكية العين الذيlemount.
- تخدير السمكة مع الماء المثلج.
- ثقب حفرة في هامش القرنية وجعل كوب العين عن طريق إزالة القرنية مع مقص فينوس.
- إزالة العدسة ثم مسح مركز شبكية العين مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
- مسح الفجوة بين شبكية العين والصلبة مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X حتى يتم ترك أي الصباغ.
- قطع العصب البصري في القرص.
- الحفاظ على طبقة RGC التصاعدي مع الاستمرار على شبكية العين مع ملعقة كوب عصامي (أرقام 3A 3B و). ويمكن أيضا أن تستخدم بالقطارة لنقل شبكية العين.
- وضع شبكية العين في قطرة من الجليدية 30٪ الجلسرين على شريحة مع طبقة RGC التصاعدي (الشكل 3C).
- إزالة الجلسرين ثم تتسطح شبكية العين على شريحة زجاجية قبل قطع الشبكية إلى أربعة أجزاء (الشكل 3D). الحفاظ على شبكية العين تكشفت مع طبقة RGC التصاعدي سوف تكون مفيدة لتسطيح الشبكية.
- بالتنقيط الجليدية 50٪ الجلسرين على رانه الشبكية ليغسل شظايا الصباغ.
- إزالة الجلسرين ثم إسقاط 20 ميكرولتر من الجليدية 75٪ الجلسرين على شبكية العين.
- تغطية عينة مع 1.8 سم × 1.8 سم ساترة مربع.
- ختم ساترة مع طلاء الأظافر. ينصح التصوير الفوري للشبكية العين.
- الصورة غير حابك-شبكية العين بأكملها تحت عدسة الكائن 20X (NA = 0.70) مع DP72 CCD (كل صورة 1360 x 1024 بكسل). كل حقل من ثلاثة يركز مختلفة.
- تمديد عمق كل حقل باستخدام أداة "عمق ممتدة من الميدان" في البرنامج.
- تجميع الشبكية الافتراضية مع وظيفة الدمج الصوري.
- حدد ثلاثة مجالات 680 X 512 بكسل (المساحة الفعلية هي 350 ميكرون بواسطة 264 ميكرون، 0.092 ملم 2) في كل اتجاه الشبكية لتحليل متوسط كثافة RGCs (الشكل 4A).
- الحصول المنطقة مع وظيفة القياسات - إنشاء ميزة المضلع في الصورةالبرمجيات.
- حساب العدد الإجمالي للRGCs بواسطة المعادلة "RGCs عدد = س مصير المنطقة" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما الأرقام 4B-D المعرض، عدد الجاذبة + الخلايا ثلثي دابي + الخلايا في RGCL. في شبكية العين العادية، صورة المونتاج من شبكية العين بأكملها (الشكل 4E) يدل على أن الجاذبة + RGCs وموزعة على شبكية العين بأكملها ولكن في شبكية العين مجدد (الشكل 4F)، كما RGCs في المنطقة الوسطى لم يجدد لهدفهم في الأسبوع الأول، وأنها لا يمكن أن توصف.
الشكل 1. الجهاز الجراحة تستخدم لوضع العلامات إلى الوراء من RGC. (أ) استخدام اسفنجة (أ) لإصلاح الأسماك. منصة التشغيل (طولها 28 سم، عرض 10 سم، ارتفاع هو 5 سم) ويتم توصيل أنبوب ضخ عن طريق إبرة معدنية (ب). يتم تخزين المياه الزائدة في تجويف (ج). (ب) عن قرب لإبرة معدنية. ومن لف رأس إبرة مع السندات علاج ضوء (د). تستخدم (C) خزانات لتخزين MS-222 (ه، هو طول 6 سم، عرض 10 سم، ارتفاع 8 سم) والمياه المالحة (و، هو طول 4 سم، عرض 10 سم، ارتفاع 8 سم)، على التوالي. أنبوب ضخ (ز) يربط بين الخزان وإبرة معدنية.
الشكل 2. عرض ظهري من الجمجمة من الزرد الكبار. (أ) الجمجمة سليمة قبل rossing. خط منقط الأصفر يمثل السقف؛ خط منقط أحمر يصادف لل telencephalon؛ وخط منقط الأخضر يمثل المخيخ. (B) الجمجمة بعد إزالة الجلد. (C) بعد تآكل مع منمش، الجمجمة هو متلين وأشار منطقة مقعرة بها ملقط (أبيض *). (D) يتعرض السقف الحق بعد إزالة الجمجمة. المقياس هو 500 & #956، م.
الرقم 3. الخطوات الرئيسية لwholemounting شبكية العين. (A) ملعقة كوب Homebuilt لشفط شبكية العين، ويظهر صورة أسفل منظر كامل. (B) امسك الشبكية مع "ملعقة" (تميزت خط منقط). (C) نقل شبكية العين في الجليد الباردة الجلسرين 30٪. ( D) قطع الشبكية إلى 4/4؛ السهم يشير إلى اتجاه القطع. أشرطة النطاق (A) 1 مم؛ (BD) 500 ميكرون.
F igure 4. وأخذ عينات من RGCs العد في شبكية العين الظاهري. (A) عرض تخطيطي لشبكية العين لديها أربعة حقول (N، D، V، مجال T) ولكل واحد منهم لديهثلاثة حقول التي تظهر في مربع أبيض. إشعار يقع القرص البصري عادة في التوجه بطني والزمانية (نقطة سوداء). (B) الجاذبة المسمى RGCs. (C) دابي المسمى النواة. (D) صورة مدموجة من RGCs والنواة. (E) صورة مونتاج للشبكية كاملة في الزرد العادية. (F) مونتاج صورة تظهر الشبكية مجدد بعد إصابة العصب البصري. لا يسمى المنطقة الوسطى من الشبكية RGCs كما لم يجدد إلى أهدافهم في الأسبوع الأول. الاختصارات: N = الأنف، D = الظهرية، V = بطني، T = الزمني. أشرطة النطاق: 30 ميكرومتر (BD)؛ 500 ميكرون (E، F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وضع العلامات إلى الوراء من RGCs المهم للبحث بقاء RGCs في الحيوانات الثديية، ولكن لم يتم استخدامه في الزرد. الطرق البديلة، وسعادة تلطيخ 7 و 8 تلوين الأجسام المضادة، ليست معايير الذهب لحساب عدد RGCs، وخطوط المعدلة وراثيا مع جميع RGCs وصفت لم يتم بناؤها 12، 13. في هذا الفيديو، ونحن نقدم طريقة لتسمية الوراء RGCs في شبكية الزرد الكبار. على الرغم من حوالي 1٪ من محاور المشروع إلى البصلة الشمية أو مناطق أخرى 14، ويمكن هذا الأسلوب تسمية RGCs كلها تقريبا في شبكية العين.
كما الزرد هشة جدا لتحمل الأذى الجسدي، وفتح الجمجمة من الزرد الكبار مع مشرط شق 3 أو حفر 5 و 15 قد يسبب الموت. يمكن تليين الجمجمة مع منمش لحد من تلف في خلايا المخ. بواسطة ختم الحفرة مع السندات ضوء التصلب وتحديد ذلك تحت الضوء الأزرق،معظم الأسماك البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة. فإنه يأخذ فقط 12-15 دقيقة لإجراء الجراحة في إطار عملية يتقن، والذي هو أكثر ملاءمة وكفاءة مقارنة مع الفئران والحيوانات الثديية الأخرى 5.
الجاذبة لصق الأنسجة وضع العلامات هو صبغ محبة للدهون. بالمقارنة مع بلورات الجاذبة أو Microinjection من الحلول المركزة، وهذا يحسن تغلغل الصبغة في الأنسجة، واصفة محاور داخل وتحت سطح الأرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمضان تستمر لفترة زمنية طويلة 10. من ناحية أخرى، ويتم امتصاص هذه الصبغة عن طريق ممر النقل السلبي، ولذلك فمن الضروري ترك الصبغة في السقف لمدة 5 أيام على الأقل لوضع العلامات كاملة.
الزرد هو نموذج حي ممتازة للتجديد البصرية. في 7 أيام بعد سحق البصرية العصبية، RGCs تقريبا كل محوار تجديد إلى السقف، ولكن فقط نصف RGCs تجديد في العصب البصري قطع نموذج 9. هذا الأسلوب هو وسيلة مثالية للبحث RGCق البقاء والتجديد بعد سحق العصب البصري، والتي يمكن أن تجنب وقوع إصابات إضافية على العصب البصري.
قدمنا بروتوكول كامل لوضع العلامات RGCs الوراء بنجاح في الزرد الكبار وقياس عدد RGCs في شبكية العين wholemount. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام السندات ضوء التصلب، ونحن زيادة معدل البقاء على قيد الحياة من الزرد، والتي تجعل هذه الطريقة أكثر فعالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
