Summary
myography לחץ משמש כדי להעריך vasoactivity של עורקים קטנים המתפתחים התכווצות מתמשכת כאשר לחץ. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט להעריך במגזרים בודדים של עורקי mesenteric קטנים מחולדות, vasoactivity ואת ההשפעה של לחץ intraluminal על קוטר כלי דם.
Abstract
עורקי התנגדות קטנים להצר ולהרחיב בהתאמה בתגובה לעלייה או ירידה בלחץ intraluminal; תופעה זו ידועה כתגובת myogenic היא רגולטור מרכזי של זרימת דם מקומית. בתנאי isobaric עורקי התנגדות קטנים לפתח ספגו התכווצות הידועה כטון myogenic (MT), אשר הוא הקובע עיקרי של התנגדות המערכתית של כלי דם (SVR). מכאן, הכנות בלחץ vivo לשעבר של עורקי התנגדות קטנים הן כלים עיקריים ללמוד לתפקד כלי דם במדינות קרובים-פיסיולוגיות. כדי להשיג זאת, קטע שלם מבודד טרי של עורק קטן התנגדות (קוטר ~ 260 מיקרומטר) הוא רכוב על שתי קנולות זכוכית קטנה ודחוסות. הכנות עורקים אלה לשמר ביותר במאפייני vivo והערכת היתר של טון של כלי דם בזמן אמת. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להערכת vasoactivity בעורקי mesenteric ההתנגדות קטנות בלחץ מחולדות; עורקים אלה לפתחהתכווצות כלי דם מתמשך - כ -25% מקוטר מקסימאלי - כאשר לחץ על 70 מ"מ כספית. הכנות עורקים אלה ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעה של תרכובות מחקריות על קשר בין לחץ וvasoactivity התוך עורקים ולקבוע שינויים בתפקוד כלי דם במודלים של בעלי חיים במחלות שונות.
Introduction
עורקי התנגדות קטנים הם גורמים עיקריים של SVR ולשחק תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיה של מחלות רבות 1,2. תנאים כגון סוכרת 3, הריון 4, איסכמיה reperfusion 5, השמנת יתר ולחץ דם 6,7 לעתים קרובות קשורים בתפקוד כלי דם שונה. myography כלי דם לא יכול רק לספק תובנות חשובות שינויים בתפקוד כלי דם במחלות שונות, אלא גם לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות ולהעריך את היעילות של תרכובות vasoactive. תפקוד כלי דם נחקר באמצעות עורקים קטנים מבודדים בתנאי כלי איזומטרי או isobaric 8. תיאור מפורט של myography איזומטרי מסופק במקום אחר 9. עם זאת יש הבדלים בנתונים המתקבלים מאיזומטרי לעומת הכנות isobaric 10-12. מאז הכנות עורקים בלחץ תאפשר המחקר של פונקצית כלי דם בתנאים קרובים-פיסיולוגיים,ממצאים שהתקבלו עשויים להיות מתואמים טובים יותר עם התנהגות של מיטת כלי דם 8,13 in vivo.
בשינה 1902 בייליס תואר לראשונה את ההשפעה של לחץ transmural בקוטר כלי דם 14. הוא נצפה בעורקי התנגדות קטנים מהמיטות כלי דם שונות של ארנבים, חתולים וכלבים שירידה בלחץ בעקבות התרחבות, ועלייה בלחץ בעקבות התכווצות כלי דם. תופעה זו ידועה בשם תגובת myogenic. בייליס וחוקרים שלאחר מכן הבחינו כי בתנאי isobaric עורקי התנגדות קטנה לפתח התכווצות מתמשכת הידועה כMT 15,16. שתי תגובת myogenic וMT ניתן להעריך באמצעות myography לחץ טכניקה (PM). PM משמש בעיקר כדי לקבוע vasoactivity של עורקים קטנים, ורידים וכלי שיט אחרים. בנוסף להערכת ההשפעה של תרכובות vasoactive בקוטר כלי דם, אחר הצהריים - כשמו מציין - משמש כדי להעריך CH-תיווך לחץ תוך-Anges בקוטר כלי דם. במהלך העשורים האחרונים התקדמות בתוכנת מחשב, שמשופרות מיקרוסקופיה הווידאו ופיפטה הזכוכית מושכים קדימה, עשו PM קל יותר לבצע. עם זאת, דיסקציה של מגזרים שלמים קיימא של כלי דם קטנים נשארה מייגע ולעתים מאתגרת. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט ללמוד תגובת myogenic בעורקי התנגדות mesenteric הקטנים המבודדים מחולדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דוגמאות שהובאו כאן הן מניסויים שאושרו על ידי IACUC בג'ורג'יה עוצרים אוניברסיטה - פרוטוקול לא: # 2011-0408
1. הכנת ריאגנטים
- הכן מניית פתרון לנתיחה: עבור 500 מיליליטר של תמיסת נתיחת המניות (5x), לפזר 21.18 גרם NaCl, 0.875 גרם KCl, .739 MgSO ז 4, 1.049 מגבים גרם ו0.019 EDTA גרם ב450 מיליליטר מים מילי- Q. התאם ל- pH 7.3-7.4 באמצעות 1 N NaOH. מרכיבים את הנפח 500 מיליליטר עם מים מילי- Q. פתרון מניות יכול להיות מאוחסן עד 7-10 ימים. ראה טבלה 1 לרשימה של כימיקלים והספקים שלהם. ראה טבלה 2 לריכוז במ"מ.
- הכן את הפתרון לנתיחה עובד: הכן פתרון לנתיחה עבודה טרי בכל יום. לפתרון עובד 100 מיליליטר, לפזר .091 גלוקוז גרם, 0.016 Nah גרם פירובט נתרן 4 ו0.022 גרם 2 PO ב79.8 מיליליטר של מים מילי- Q. להוסיף מניית פתרון לנתיחה 0.2 מיליליטר 1M CaCl 2 ו -20 מיליליטר להביא voluלי 100 מיליליטר.
- הכן תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS): כדי להכין 1,000 מיליליטר PSS, לפזר .365 גרם KCl, NaCl 6.545 g, .296 MgSO ז 4, 0.163 גרם KH 2 PO 4, 2.072 גלוקוז גרם, 2.184 NaHCO ז 3 ו2.383 HEPES גרם ב950 מיליליטר מים מילי- Q. התאם ל- pH 7.3-7.4 באמצעות 1 N NaOH. מרכיבים את הנפח 1,000 מיליליטר עם מים מילי- Q. הסר 2 מיליליטר של תמיסה ולהחליף אותו עם 2 מיליליטר של 1 M CaCl 2. (טרי PSS צריך להיות מוכן ביום)
- הכן סידן PSS בחינם (Ca 2 +): 100 מיליליטר לPSS ללא Ca 2 +, לפזר .036 גרם KCl, NaCl .654 גרם, 0.029 MgSO ז 4, 0.016 גרם KH 2 PO 4, .207 גלוקוז גרם, 0.218 גרם NaHCO 3, .238 ז HEPES, 0.015 EGTA גרם ו0.0026 nitroprusside נתרן גרם (SNP) ב -95 מיליליטר מים מילי- Q. התאם ל- pH 7.3-7.4 באמצעות 1 N NaOH. מרכיבים את הנפח 100 מיליליטר עם מים מילי- Q.
2. הכנת זכוכית קנולות
- משוך טפטפות זכוכיתעל מנת ליצור את קנולות הטו 100-150 מיקרומטר באמצעות חולץ פיפטה בהתאם להנחיות יצרן.
- פוע הטיפים צינורית זכוכית באמצעות beveller microelectrode, האש ללטש אותם ולכופף את הטיפים צינורית זכוכית על ידי ~ 45 מעלות באמצעות בדיקה דוד.
- טען את קנולות לבעל micropipette ולצרף את בעל micropipette לתא זלוף.
3. הכנת זלוף הקאמרי
- תא זלוף לשטוף עם מים מילי- Q ואחריו פתרון לנתיחה במשך 5 דקות כל אחד. טען את התא עם 2 מיליליטר של פתרון לנתיחה.
- פתרון יניקה נתיחה דרך צינורית באמצעות מזרק 10 מ"ל ולמלא בקפידה את כל הצינורית וצינורות המחוברים ללא כל בועות. החל יניקה בעדינות כדי למנוע דור של בועות.
- הכן שני תפרים עם חצי קשר כל שימוש במלקחיים בוטים. מאז תפרי ניילון monofilament עיניים (10-0, 0.2 מטרי) משמשים להכנת הקשרים שרק1-2 מ"מ בקוטר, ייתכן שיהיה צורך מיקרוסקופ לנתיחה.
- הדמיה תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש במלקחיים לנתיחה כדי לטעון שני קנולות עם קשרים תפר סגורים חלקית מעט מהקצה. מאוחר יותר קשרים אלה החליקו בזהירות על קצות עורקי cannulated וסגורים לחלוטין.
4. אוסף של עורקי mesenteric ארקייד מSprague-Dawley חולדות
- מחפש אישור הוועדה המקומית המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) לפני ביצוע ניסויים אלה. בעלי חיים בית במתקן החיה עם טמפרטורה מבוקרת ותאורה ולאפשר גישה חופשית למים ואוכל מכרסם מסחרי.
- להרדים חולדות על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין (80 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם). לאשר הרדמה עמוקה על ידי הבוהן קמצוץ ואם הרדמה נוספת ניהול 'דרוש.
- לאחר אישור ההרדמה כירורגית, להרדימו על ידי עריפת ראש. פעל לפי הנחיות AAALAC לדלקת בדרכי שתןLizing שיטות מתאימות להמתת חסד של בעלי חיים.
- השתמש מספריים לנתיחה ומלקחיים לבצע laparotomy קו אמצע מאגן לעצם חזה. הדבר נעשה בשני שלבים: ראשון, לחתוך את העור והשני, לחתוך את שכבת השריר הבסיסית. יש להקפיד שלא לפגוע באיברים תוך-בטני.
- חותך את הקצה הפרוקסימלי של מעי קרוב לשוער ואת הקצה הדיסטלי הקרוב לצומת ileo-cecal. לקשור שני קצוות בנפרד כדי למנוע דליפה של chyme וצואה וכך למנוע זיהום של פתרון רחצה תאי. לחתוך את לפדר בבסיסו ליד כלומר כלי דם האכלה, עורק mesenteric מעולה ולהעביר את מיטת mesenteric מעיים קטנה כל לכוס 50 מיליליטר המכילה פתרון לנתיחה קר כקרח.
- לאפשר רקמה שנקטפו להישאר בפתרון לנתיחה קר קרח למשך 5 דקות ולשטוף עם פתרון לנתיחה טרי להיפטר מדם.
5. בידוד וCannulation של 4 th
- להצמיד את הקצה הפרוקסימלי של המעי בצד ימין בצלחת מצופה sylgard. להאריך את המעי שנותר בנתיב נגד כיוון השעון, מצמיד את הקטע למטה כדי להפיץ את לפדר וחושף את כלי הדם (איור 1). הערה: אנו לבודד מגזרי עורקים בטמפרטורת חדר. אחרת אנו שמים ארקייד mesenteric מכיל מנה על קרח. מעבדות מסוימות, כוללים אלה במוסד שלנו, להשתמש ביחידות ילר לנתח עורקים ב 4 מעלות צלזיוס.
- תחת מיקרוסקופ זום סטריאו לנתח את 3 rd ו-4 עורקי mesenteric קטנים כדי מקביל (~ 260 מיקרומטר) למעי הדק באמצעות מספריים קטנים. לנתח ראשון את כל שומן הכיסוי. לאחר מכן לנתח את הווריד ולבודד את העורק עם נקודת סניף בצורת V. היזהר שלא לנקב את הקטע שנבחר. התחל לנתח את השומן ליד סניף כדי 2 nd ולמצוא את הדרך ל-3 או 4 ORD הכלי אה.
- ניתן להבחין עורקים וורידים המבוססים על עובי הקיר שלהם - קיר העורק הוא עבה יותר מהווריד של: הערה. יתר על כן, כאשר סמוך רקמת חיבור הוא משך בעדינות בניצב לקריסת כלי, ורידים בקלות תוך עורקים לא. מאז עורקים עם קוטר לום <400 מיקרומטר הם אתרים מרכזיים של התנגדות כלי דם מערכתית, לפרוטוקול זה היינו 4 th עורקי mesenteric חולדה כדי (לומן קוטר <300 מיקרומטר).
- לבודד את החלק של 4-5 מ"מ מקביל עורק למעי דק. דמיינו את כל 5 הסניפים כדי ה הטבעה לתוך מעי דק וחותך אותם מעט מהמקור של סניפים ולשמר חלק. חלקים אלה השתמרו סניפים לשמש מחזיקים אתרים (עם מלקחיים נתיחה) להעברת קטעי עורקים לתא זלוף ו, לאחר מכן להדריך את cannulation.
- ואז לחתוך קטעי עורקים על ידי ביצוע חתכים 2 דיסטלי5 סניפים ה סדר בכל צד של העורק ולהעביר אותו לתא זלוף (ראו איור 1 ג ואגדה).
- Cannulate קצה אחד של כלי על אחד micropipette הזכוכית (קוטר: 100-150 מיקרומטר) באמצעות מלקחיים לנתיחה על ידי לחיצה על הטיפים של מגזר העורקים עם מלקחיים לנתיחה. חלק את התפר הסגור באופן חלקי נטען בעבר על סוף cannulated ולאבטח אותו. הערה: קצה הפרוקסימלי של העורק ניתן cannulated על צינורית הזכוכית שמחוברת למכשיר ויסות לחץ שליטת סרוו לחקות בסביבת אתר.
- צרף פתרון לנתיחה עמוס 10 מיליליטר מזרק לברזלים מחוברים לצינורית זו כך שפתרון לנתיחה בצינור המחבר את הצינורית וברזלים מתמזג עם שבמזרק. בעדינות להעלות את המזרק. הכוח הכבידה על הפתרון יסיר את הדם בכלי דם התוך מהקצה הפתוח של כלי השיט. לאחר הסרת הדם תוך-עורקים, לסגור את ברזלים.
הערה: לחלופין, לצרף את ברזלים לבקר הלחץ, להפעיל אותו ולהגביר את הלחץ בעדינות כדי 5-10 מ"מ כספית כדי להשיג את אותה התוצאה. - לקשור את הקצה הדיסטלי של כלי על צינורית זכוכית שנייה על ידי הבאת הצינורית אחרת הקרובה ככל האפשר לסוף התיר של מגזר העורקים בזהירות. חלק את התפר הסגור באופן חלקי נטען בעבר על סוף cannulated ולאבטח אותו. יש להקפיד לא למשוך או למתוח על מגזרי עורקים. ודא כי ברזים למיניהם מצורפים לשתי קנולות סגורות.
- העבר את תא זלוף על הבמה של מיקרוסקופ ההפוך מצוידים בהקלטת וידאו חי.
- חבר את ברזלים של הצינורית קשורה לקצה הפרוקסימלי של קטע העורקי למכשיר ויסות לחץ שליטת סרוו ולוודא שברזלים מחוברים לצינורית אחרת נותר סגור כדי לשמור על לחץ intraluminal יציב.
- בשלב הבא, לצרף את צינורות ואקום ליציאת יניקהND זלוף צינורות ליציאת זלוף של החדר.
הערה: יציאת מחט משופעת משמשת ליניקה ויציאת מחט קהה לזלוף. - התחל זלוף של כלי עם PSS החם באמצעות דוד פתרון מוטבע יחיד (37 מעלות צלזיוס, equilibrated עם תערובת גז: 5% CO 2, 5% O 2 ו- N 90% כדי לשמור על pH ניטראלי וחמצון נאות 17) ב 2 מיליליטר / דקה באמצעות משאבת peristaltic. הפעל הוואקום על גם כן. הנח thermistor בתא לעקוב אחר טמפרטורה ברציפות.
- ככל שהטמפרטורה של PSS בתא מתקרבת ~ 37 ° C (בדרך כלל תוך 5 דקות), להגדיל לאט לחץ intraluminal 20-100 מ"מ כספית ולבדוק כלי דליפות. הדבר נעשה באמצעות ההגדרה האוטומטית של לחץ ווסת לחץ. מחק כלי עם דליפה ולהחליף עם מגזר אחר. כלי עם הדלפות לא יוכלו להחזיק את הלחץ.
- להעריך את קטע עורקים לעיקולים, תוך שמירה על הלחץ על 100 מ"מ כספית.שימוש בבורג-המנוף, להעביר את הצינורית ליישר את קטע העורקים. אל מעל למתוח את מגזרי עורקים; המטרה היא לחקות באורך קטע עורקי vivo.
- להפחית את הלחץ עד 70 מ"מ כספית (לחקות בלחץ vivo בארקייד mesenteric 18) ולאפשר למגזר העורקים לייצב ולפתח טון myogenic. עורקים עשויים להיות בלחץ variably (40-70 מ"מ כספית) על פי אסטרטגיה ניסיונית ומיטת כלי דם. סקירה שפורסמה בעבר מספקת סקירה מצוינת של השתנות בMT במגזרי עורקים מהמיטות כלי דם שונות 8.
6. מדידת קוטר עורקים
- צפה בעורקים במטרת 10X על מיקרוסקופ מצויד במצלמה מכשיר מצמידה מטען וידאו בשחור-לבן. למדוד קוטר luminal באמצעות מערכת קצה-זיהוי בזמן אמת וחוטף מסגרת וידאו. רשימה של ציוד המשמש מסופקת בטבלה 3.
- ד צג וכלי השיאiameter ברציפות.
- שים לב להתפתחות של MT. הערה: הבחנו כי בעורקי התנגדות mesenteric חולדה, על 70 מ"מ כספית, פיתוח של MT מאופיין על ידי ~ ירידה של 20% בקוטר. MT משתנה בהתאם למין מיטה ובעלי החיים וכלי דם.
- לאשר כדאיות של כלי דם על ידי הערכת תגובות מכווץ כלי דם וvasodilator לphenylephrine 1 מיקרומטר (Phe) ואצטילכולין 1 מיקרומטר (ACH).
- בסופו של כל ניסוי, לקבוע קוטר פסיבי (PD) על ידי דוגרים עורקים בCa 2 + PSS -חינם במשך 20 דקות.
7. תגובה myogenic
- להפחית את הלחץ עד 20 מ"מ כספית ולאפשר הקוטר לייצב. להגביר את לחץ intraluminal בצעדים הדרגתיים (20, 40, 60, 80 ו -100) ובכל שלב לחץ לאפשר עורקים להשיג קוטר יציב (בדרך כלל תוך 5 דקות).
- להפחית את לחץ intraluminal עד 20 מ"מ כספית ודגירת מגזר העורקים בCa 2 + PSS -חינם מכיל 0.39 מ"מEGTA ו0.1 מ"מ SNP. לאפשר הקוטר העורק לייצב (בדרך כלל 15 דקות).
- חזור על תגובת לחץ-צעד בPSS 2 + -חינם Ca מכיל 0.39 מ"מ EGTA ו0.1 מ"מ SNP.
8. פרשנות של תוצאות וחישוב נתונים
- לחשב את MT כהפרש אחוזים בקוטר נצפה עבור Ca 2 + המכיל לעומת Ca 2 + PSS -חינם בכל לחץ על פי החישוב הבא:
- לעורקים עוברים vasomotion הקוטר עשוי להיות מחושב על ידי ממוצע שלב הרמה 1 דקות. להביע את הנתונים שנאספו כאחוז מהרפיה המקסימלי (PD%) על פי מערכת היחסים: PD% = 100 x [ΔD / PD]; ΔD ההבדל בין הקוטר לפני ואחרי תוספת של כל מתחם מחקרי (למשל Phe); PD הוא קוטר פסיבי (גםקוטר מקסימאלי).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצוג סכמטי של הגדרת myograph לחץ אופייני מוצג באיור 1. שני קצוות של כלי השיט הם cannulated עם micropipette זכוכית ומאובטח עם תפרים בשני הצדדים. דרך צינורות וברזלים פתוחים, צינורית אחד מחוברת ללחץ-רגולטור בשליטת סרוו; הצינורית אחרת מחוברת לברזלים סגורים. הקאמרית הוא perfused עם שינויי PSS וקוטר כלי דם הם נצפו על ידי מיקרוסקופ הפוך מחובר למצלמת CCD.
קטע העורקים בלחץ על 70 מ"מ כספית הוא מודגרות בPSS החם מוכן טרי, שזורם דרך תא העורקים בגיל 2-4 מיליליטר / דקה ונשאב החוצה. קוטר העורק הוא פיקוח ונרשם באמצעות תוכנת videomicroscopy וגילוי קצה. לאחר ~ 40 דקות, מגזרי עורקים להצר באופן ספונטני על ידי 20-40% מקוטר המוצא שלהם (איור 2 א). בידיים שלנו עורקי התנגדות עכברוש קטן להצר על ידי 25-30% (ממוצע ואריes בהתאם להגדרות, מפעיל, ומיטת עורקים). לאחר מכן, כדאיות פונקציונלית מוערכת על ידי תגובות vasodilator ומכווץ כלי דם לACH (1 מיקרומטר) וPhe (1 מיקרומטר), בהתאמה (איור 2 א). בעוד ניתן להשתמש מרחיבי כלי דם אחרים, ACH גורם התרחבות האנדותל תלוי ובכך הוא מועיל בהערכת שני אנדותל, כמו גם כדאיות שריר חלק בכלי דם. בהמשך קטע העורקים מחדש מודגרות בPSS ופעם אחת בקוטר יתייצב, שהוא מוכן לניסוי. בסופו של כל ניסוי, מגזרי עורקים מודגרת בCa 2 + PSS בחינם למדוד PD (איור 2). הקטרים נרשמו באיור 2 א ו -2 הם נספר באיור 2 ג. המוחלט MT הוא ההבדל בין PD וקוטר יציב הושג על התכווצות כלי דם ספונטני ב 70 מ"מ כספית. לפיכך, MT נצפה מהמעקב שמוצג הוא 33% מPD. כפי שניתן לראות כאן, תגובה לACH (1 מיקרומטר) הוא ge nerally דומה לזה שנצפה עבור Ca 2 + PSS בחינם. שים לב כי בניסויי הערכת התרחבות, בנוסף מוקדם של מכווץ כלי דם עשוי להיות נחוץ.
כדי לקבוע תגובת myogenic, מגזרי עורקי mesenteric חולדה נתונים להגדלת צעדי לחץ intraluminal בין 20 ל 100 מ"מ כספית. דוגמא מוצגת באיור 3 א. העורקים מותר להשיג קוטר יציב לאחר כל שלב (~ 5 דקות; קווים מקווקווים). בהמשך לכך, באותו הקטע העורקים הוא נתון ללחץ-תגובה בCa 2 + PSS -חינם עם 0.39 מ"מ EGTA ו0.1 מ"מ SNP (איור 3 א). הקוטר הושג בסוף כל שלב לחץ עשוי להיות מוצג כגרף קו (איור 3). MT מחושב כ הבדל אחוזים בקוטר לCa 2 + המכיל לעומת Ca PSS -חינם 2 + בכל לחץ עשוי להיות מוצג כקו או גרף עמודות (איור 3 ג).
NT "FO: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 1: איור של הגדרת myograph לחץ () רכיבי מפתח מצוינים.. ראה טבלה 3 לרשימה של כל הציוד. מיטה (ב ') שנקטפו mesenteric תלתה על צלחת מצופה sylgard מוצגת. (ג) קריקטורה של ארקייד עורקי mesenteric מוצגת. נקודות שחורות מייצגות עמדות סיכה. הסעיף המקווקו מייצג מקטע העורק להיות גזור. פסים ירוקים קטנים מצביעים על אתרי חתך בעורק. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
/ftp_upload/50997/50997fig2.jpg "/>
איור 2: (א) כפי שצוין על ידי המעקב, קוטר של עורקי mesenteric קטנים מחולדות, כאשר לחץ על 70 מ"מ כספית, יורד באופן ספונטני. תוספת של ACH (1 מיקרומטר) הגדילה את הקוטר (לקוטר הפעלה-ליד). תוספת של Phe (1 מיקרומטר) לאמבטית רקמות יורדת קוטר העורק. דגירה (ב ') בCa 2 + -חינם PSS מגדיל קוטר העורק. (ג) בקוטר של קטע עורקים בלחץ יחיד בperfusates השונים מוצג בA ו- B הוא נספר.
איור 3: קוטר עורקים () נרשם ברציפות תוך הגדלת לחץ intraluminal הדרגתית בנוכחות PSS וCa 2 + -חינםPSS. עקומה (ב) קו בקוטר העורק הושג בשלב כל לחץ. (ג) גרף בר של MT השיג בכל שלב לחץ. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים, פתרון בעיות ושינויים קריטיים
בהכנת כלי isobaric טיפוסית, העורק בלחץ על 70 מ"מ כספית בין שתי קנולות זכוכית perfused עם PSS החם (37 מעלות צלזיוס). לאחר 30-45 דקות, עורקים לפתח MT, מאופיינים בירידה ספונטנית בקוטר שמייצבת ב20-30 דקות. עורקי ההתנגדות מהמיטות כלי דם שונים לפתח MT משתנה. להתנגדות עכברוש דוגמא עורקי mesenteric לפתח MT ~ 25% מPD, תוך עורקי cremastric יכולים להשיג MT ~ 40% מPD. עורקים שלא לפתח MT תוך 60 דקות אמורים להיות מושלכים; משך עשוי להשתנות בהתאם למיטה ומינים של כלי דם. עורקים עם תגובה לא-מספקת לPhe וצריך גם להיות מושלך ACH.
pH וטמפרטורה של PSS יש השפעה משמעותית על ההתפתחות של MT. pH של PSS, שיושב לתקופות ארוכות ללא אוורור, עלול להגביר. בנוסף, בחדר עורקי טמפרטורה צפויים דevelop MT. מכאן צריך להיות מוגזים PSS בהקדם האפשרי באמצעות תערובת הגז שצוינה בסעיף הפרוטוקול והטמפרטורה של חדר זלוף צריך להיות במעקב רציף ונשמר ב~ 37 מעלות צלזיוס באמצעות זרימת מחמם.
מאז ניסויים אלה 3-5 שעות בזמן, תאי זלוף והצינורות כלולים חשופים לPSS לתקופות ארוכות; מלח-משקעים יכולים להצטבר בשני הקאמרית וצינורות שעלולים להפריע לניסויים הבאים. לכן זה קריטי כדי לשטוף ביסודיות את תא זלוף ולשטוף את צינורות עם מים מיוננים לאחר כל ניסוי. כמו כן, יש להקפיד לנקות את הצלחת מצופה sylgard משמשת לנתיחה עם מים מיוננים לאחר כל נתיחה ביסודיות.
מגבלות
למרות חשיבותה, יש PM מגבלות שונות. ציוד PM הראשון, העלות הקולקטיבית כדי להשיג הוא גבוה (22,000 $ ~) ויכול להיות מונע על מסוים להBS; רשימה מפורטת של ציוד מוצגת בטבלה 3 שני, כלי טריים יש צורך ברוב הניסויים.; מכאן חיה חדשה היא מורדמות לכל ניסוי, והוסיף לעלות הכוללת. שלישית, דיסקציה של עורקי mesenteric הקטנים היא מייגע ודורשת מכשירים אחרים כגון כלים מיקרוסקופ לנתיחה וmicrodissection, שנוטים לנזק. רביעית, יש עקומה למידה; צובר מומחיות ובהקמת הממשלה במעבדה דורשת צוות מסור, זמן ומאמץ.
משמעות ביחס לשיטות אחרות ויישומים עתידיים
פרוטוקולי ניסוי Isobaric ואיזומטרי שתי גישות עיקריות המשמשות לקביעת תגובתיות כלי דם. בניגוד לתכשירי isobaric, vasoactivity בהכנות איזומטרי נקבע על ידי מדידת מתח שריר חלק של כלי דם באמצעות מערכת myograph חוט. בנוסף להבדלים בציוד הנדרשים לשני פרוטוקולי הניסוי הבאים, אגוניסט-iהתכווצות nduced היא שונה בין גישות הניסיוניות אלה בכל הקשור לגודל, בזמן קורס וכיוון של קיר כלי דם מתח 11,19. בגלל נוחות ומגבלות טכניות, שני התכשירים משמשים תפקידים חשובים. לדוגמא, כי זה קל יותר לשמור על פוקוס מיקרוסקופי על הכנות איזומטרי, הם משמשים לעתים קרובות למדידה בו זמנית של תגובתיות ושינויים בשריר חלק בכלי דם Ca 2 + כלי דם. מצד השני, פעילות myogenic מוערכת ביותר בהכנות בלחץ שנחשבים לחקות in vivo מצב פיסיולוגי הדוק. סקירה מפורטת של הבדלים בין הכנות אלה סיפקו בעבר 19.
לסיכום, myography לחץ הוא טכניקה אמינה ללמוד תגובת myogenic בכלי התנגדות קטנות בתנאים קרובים-פיסיולוגיים. למרות מגבלותיו, ראש הממשלה סיפקה תרומה משמעותית להבנת שינויים בתפקוד כלי דם בתנאים נורמלים ופתולוגיים 3-7,20-23. תקנה של טון של כלי דם מערכתי היא מורכבת ביותר וכרוכה בגורמים נוירו-הורמונליים ומקומיים ומכאן בידוד התפקיד של מנגנונים ספציפיים המסדירים את הטון של מיטות כלי דם in vivo הוא קשה. בהקשר זה, vivo לשעבר הכנות עורקי לחץ לשמש תחליפים מצוינים כ. מי שמתעניייין במנגנוני התמרה של MT ותגובת myogenic מכונים ביקורות מצוינות שפורסמו בעבר 15,19. בעתיד אנו עשויים לראות התקדמות בציוד המשלבת הערכה של תגובה ושינויים בשליחים במורד כגון Ca 2 + myogenic למרות שזה מאוד לא סביר שהיינו רואה ירידה בעלויות ציוד. עם זאת, כטכניקה זו אומצה על ידי מדענים עם רקע מגוון, אנו צפויים לראות היישום שלה כדי להעריך את השינויים בתפקוד כלי דם במחלות אחרים מאשר יתר לחץ דם, סוכרת והלם כגון שחמת הכבד, דהmentia וכו '
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש סופרים לא סכסוכים כספיים.
Acknowledgments
Sandeep Khurana נתמכת על ידי NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda נתמך על ידי (T32DK067872).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chemical | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MOPS | Sigma Aldrich | M5162 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium nitroprusside | Sigma Aldrich | 13451 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma Aldrich | S9638 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Composition of Experimetnal solutions | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CCD Monochrome Camera | The imaging Source | DMK 21AU04 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thermistor | Warner Instruments | 64-0108 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dual automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fluorescence System Interface | IonOptix | model FSI-700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Forceps and scissors | World Precision Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ion Wizard-Core and Analysis | IonOptix | Ion Wizard 6.0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Laboratory tubing | Silastic | 508-005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Male Sprague Dawley rat | Harlan Laboratories | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Master flex console drive | Cole-parmer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Milli-Q Plus Ultrapure Water System | Millipore | ZD5211584 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Ethicon | 9007G | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Photometry and Dimensioning Microscope | Motic | AE31 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Stereomicroscope | Nikon Instruments Inc | SMZ660 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW120-6 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microforge | Stoelting | 51550 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 3. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Christensen, K. L., Mulvany, M. J. Location of resistance arteries. J Vasc Res. 38, 1-12 (2001).
- Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
- Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
- Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
- Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
- Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. , (2011).
- Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
- Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
- Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
- Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
- Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
- Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488 (Pt 3), 753-760 (1995).
- Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
- Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
- Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
- Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
- Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).
