Summary
Basınç myography basınçlı zaman sürekli daralma geliştirmek küçük arterlerin vazoaktiviteye değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda sıçanların, vazoaktiviteye ve damar çapı intraluminal basıncın etkisi küçük mezenterik arterler izole segmentlerinde değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.
Abstract
Küçük direnç arterlerin daralması ve artan veya intraluminal basınç azalması karşısında sırasıyla dilate; Miyojenik tepki olarak bilinen bu fenomen, yerel kan akımının önemli bir düzenleyicisidir. Izobarik koşullarda küçük direnç arterler sistemik vasküler direnç (SVR) önemli bir belirleyicisi olan Miyojenik tonu (MT) olarak bilinen daralmasını sürekli geliştirirler. Bu nedenle, küçük direnç arterlerde ex vivo basınçlı hazırlıkları yakın fizyolojik devletlerde mikrovasküler fonksiyonunu incelemek için önemli araçlardır. Bunu elde etmek için, küçük bir direnç, arter (çap ~ 260 um) bir taze izole sağlam kademeli bir, iki küçük cam kanüller ve basınçlı üzerine monte edilir. Bu arter hazırlıklar vivo özellikleri ve gerçek zamanlı olarak damar tonusu izin değerlendirmesinde en korur. Burada sıçanlardan basınçlı küçük direnç mezenterik arterlerde vazoaktiviteye değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar; Bu arterler geliştirmeksürekli vazokonstriksiyon - maksimal çapının yaklaşık 25% - 70 mmHg basınçlı. Bu arter preparatları çeşitli hastalıkların hayvan modellerinde mikrovasküler fonksiyonunda değişiklik intra-arteryal basınç ve vazoaktiviteye arasındaki ilişki ile ilgili araştırma bileşiklerin etkisini incelemek ve belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
Küçük direnç arterler SVR önemli belirleyicileri ve birçok hastalığın 1,2 patofizyolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Diyabet 3, gebelik 4, iskemi-reperfüzyon 5, obezite ve hipertansiyonun 6,7 gibi koşullar genellikle değiştirilmiş mikrovasküler işlevi ile ilişkilidir. Vasküler myography çeşitli hastalıklarda mikrovasküler fonksiyonu değişiklikleri önemli bilgiler sağlamak değil, aynı zamanda terapötik hedefleri belirlemek yardımcı ve vazoaktif bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek değil sadece. Vasküler fonksiyon izometrik veya izobarik damar koşulları altında 8 izole küçük arterleri kullanarak çalışılmıştır. Izometrik myography detaylı açıklaması başka yerde 9 sağlanır. Ancak izobarik hazırlıkları 10-12 karşı izometrik elde edilen verilerdeki farklılıklar vardır. Basınçlı arteriyel hazırlıklar yakın fizyolojik koşullarda mikrovasküler fonksiyonunun çalışma izin beri,Elde edilen bulgular, vasküler yatağa 8,13 in vivo davranışları ile iyi korelasyon olabilir.
1902 yılında Bayliss ilk damar çapı 14 transmural basınç etkisi nitelendirdi. O basıncında bir azalma damar genişlemesi takip etti tavşan, kedi ve köpeklerde çeşitli vasküler yataklar küçük direnç arterlerinin gözlenen ve basınçtaki bir artış, vazokonstriksiyon izledi. Bu olgu, miyojenik yanıt olarak bilinir. Bayliss ve sonraki araştırmacılar izobarik koşullarda küçük direnç arterler MT 15,16 olarak bilinen sürekli daralma geliştirmek görülmektedir. Miyojenik yanıt ve MT Her iki basınç myography (PM) tekniği kullanılarak değerlendirilebilir. PM küçük arterler, venler ve diğer gemilerin vazoaktiviteye belirlemek için öncelikle kullanılır. Adından da anlaşılacağı gibi - - vasküler çapına vazoaktif bileşiklerin etkisini değerlendirmek ek olarak, AM intravasküler basıncı aracılı ch değerlendirmek için kullanılırvasküler çapına anges. Son birkaç yıl içinde, video mikroskobu ve cam pipet PM gerçekleştirmek için daha kolay yaptık çekerek gelişmiş bilgisayar yazılımı, gelişmeler. Ancak, küçük kan damarlarının canlı bozulmamış kesimleri diseksiyonu sıkıcı ve bazen zorlayıcı olmaya devam etmektedir. Burada sıçanlardan izole edilen küçük mezenterik direnç arterlerinde miyojenik tepkisini incelemek için ayrıntılı bir protokol özetlemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada gösterilen örnekler Gürcistan Regents University IACUC tarafından onaylanmış deneylerden vardır - Protokol No: # 2011-0408
Reaktifler 1. Hazırlık
- Diseksiyon çözüm stok hazırlayın: stok diseksiyon solüsyonu (5x) 500 ml için, 21.18 g NaCl, 0.875 gr KCI, 0,739 gr MgSO 4, 1.049 gr MOPS ve Milli-Q su 450 ml 0.019 gr EDTA çözülür. 1 N NaOH ile 7.3-7.4 pH ayarlayın. Milli-Q su ile 500 ml hacim hazırlayın. Stok çözelti 7-10 gün kadar saklanabilir. Kimyasallar ve satıcıların bir listesi için Tablo 1'e bakınız. MM konsantrasyon için Tablo 2'ye bakınız.
- Çalışma diseksiyon çözüm hazırlayın: her gün taze çalışma diseksiyon çözüm hazırlayın. 100 ml çalışma çözeltisi için 0.091 g glikoz, Milli-Q su içinde 79.8 ml 0.016 gr NaH 2 PO 4 ve 0.022 g sodyum piruvat çözülür. VOLU getirmek için 0.2 ml 1M CaCl2 ve 20 ml diseksiyon çözüm stok ekle100 ml beni.
- Fizyolojik tuzlu solüsyonu (PSS) hazırlanması: 950 ml, 1.000 mi PSS hazırlamak için 0.365 g KCI, 6,545 gr NaCl, 0.296 gr MgSO 4, 0.163 g KH 2 PO 4 çözülür, 2,072 g glikoz, 2,184 g NaHCO 3. ve 2,383 g HEPES Milli-Q su içinde işlenmiştir. 1 N NaOH ile 7.3-7.4 pH ayarlayın. Milli-Q su ile 1,000 ml sesi olun. 2 ml solüsyon çıkarın ve 1 M CaCI2, 2 ml ile değiştirin. (Taze PSS günlük hazırlıklı olmak gerekiyor)
- Ca 2+ olmadan, 100 ml PSS için 0.036 g KCI, 0.654 gr NaCl, 0.029 gr MgSO 4, 0.016 gr KH 2 PO 4, 0.207 gr glikoz, 0.218 gr NaHCO 3, 0.238 çözülür: kalsiyum (Ca 2+) ücretsiz PSS hazırlayın g HEPES, 0.015 g EGTA ve 0.0026 g sodyum nitroprussid (SNP) Milli-Q su içinde 95 ml. 1 N NaOH ile 7.3-7.4 pH ayarlayın. Milli-Q su ile 100 ml hacim Makyaj.
Cam kanüller 2. Hazırlık
- Cam pipetler çekinüreticinin yönergelerine uygun olarak bir pipet çektirmenin kullanarak 100-150 mikron uçlu kanüller oluşturmak için.
- Konik bir mikroelektrot beveller kullanılarak cam kanül ipuçları, yangın onları parlatmak ve bir ısıtıcı prob kullanılarak ~ 45 ° cam kanül ipuçlarını bükün.
- Mikropipet tutucu içine kanüller yükleyin ve perfüzyon odasına üzerine mikropipet tutucu takın.
Perfüzyon Odası 3. hazırlanması
- 5 dakika her biri için diseksiyon çözeltisi, ardından Milli-Q suyu ile durulayın perfüzyon odasına. Diseksiyon çözeltisinin 2 ml'si ile bölme yerleştirin.
- Kanül içinden emme diseksiyon çözüm 10 ml şırınga kullanarak ve dikkatlice kabarcıkları olmadan tüm kanül ve ekli boru doldurun. Kabarcıklarının oluşmasını önlemek için yavaşça emme uygulayın.
- Her künt forseps kullanarak yarım düğüm ile iki sütür hazırlayın. Oftalmik tek fılamentli naylon dikişlerle yana (10-0, 0.2 mt), sadece knot hazırlamak için kullanılanÇapı, 1-2 mm, diseksiyon mikroskobu gerekli olabilir.
- Diseksiyon mikroskobu altında görselleştirme, biraz uzakta ucundan kısmen kapalı dikiş knot ile her iki kanüller yüklemek için diseksiyon forseps kullanabilir. Daha sonra bu knot kanüllü arter uçları üzerine dikkatlice kaydırdı edilecek ve tamamen kapattı.
Sprague-Dawley Rats gelen Mesenterik Arter Arcade 4. Koleksiyonu
- Bu deneyler önce yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı isteyin. Kontrollü sıcaklık ve aydınlatma ve suya serbest erişime izin ve ticari bir kemirgen yemi ile hayvan barınağında Ev hayvanları.
- Intraperitonal ketamin enjeksiyonu (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) sıçanlarda anestezisi. Ayak-tutam tarafından ve gerektiğinde Administer ek anestezik eğer derin anestezi onaylayın.
- Cerrahi anestezi onayladıktan sonra, dekapitasyon hayvan euthanize. Uti için AAALAC yönergeleri izleyinHayvan ötanazi için uygun yöntemler lizing.
- Sternum için pelvis bir orta hat laparotomi gerçekleştirmek için bir diseksiyon makas ve forseps kullanın. Bu iki adımda yapılır: İlk olarak, deri insizyon ve ikinci olarak, altta yatan tabaka kas insizyon. Bakım karın içi organları kesmemeye dikkat edilmelidir.
- Pilor için bağırsak yakın ve ileo-çekal kavşağına yakın uzak ucuna proksimal ucunu kesin. Hem besin bulamacı ve böylece hücre dışı banyo solüsyonunun kirlenmesini önlemek dışkı sızıntısı önlemek için ayrı ayrı biter kravat. Besleme damar, yani üst mezenterik arter yakınındaki tabanında mezenter İnsizyon ve buz gibi soğuk diseksiyon çözeltisi içeren 50 ml'lik bir behere bütün ince bağırsak mezenterik yatak aktarın.
- Hasat doku 5 dakika boyunca buz gibi soğuk diseksiyon çözeltisi içinde kalmak ve kan kurtulmak taze diseksiyon çözümü ile durulayın izin verin.
5. İzolasyon ve 4 th Kanülasyon
- Bir sylgard kaplı çanak sağ taraftaki bağırsağın proksimal ucunu aşağı pin. (Şekil 1) mezenter yaymak için aşağı kesimi iğneleme ve kan damarlarını açığa bir saat yönünün tersinde yolunda kalan bağırsak uzatın. Not: Oda sıcaklığında arter segmentleri izole. Aksi takdirde buz üzerinde çanak içeren mezenterik çarşı yerleştirin. Bizim kurumda olanlar dahil olmak üzere bazı laboratuvarlar, 4 ° C'de arterleri incelemek için soğutucu üniteleri kullanın.
- Stereo Zoom mikroskobu altında sipariş küçük mezenterik arterler inci 3 rd ve 4 küçük makas kullanarak ince bağırsağa (~ 260 mikron) paralel teşrih. Öncelikle kaplama yağ uzak teşrih. Sonra ven teşrih ve V-şekilli şube noktası ile arteri izole. Seçilen parçayı ponksiyon için dikkatli olun. Bir 2. siparişi şube yakın yağ diseksiyon başlayın ve 3. ya da 4. ord için yol bulmaker gemiler.
- Not: Arterler ve venler kendi duvar kalınlığı dayalı ayırt edilebilir - arteriyel duvar ven yıllardan daha kalındır. Ayrıca, bağ dokusu bitişik zaman arterler yok kolaylıkla iken gemiler, damarlar çöküşüne hafifçe dik çekilir. Lümen çapı arterlerin yana <400 mikron biz (çapı <300 mikron lümen) sipariş sıçan mezenterik arterler inci 4 kullanılan bu protokol için sistemik vasküler direncin önemli siteler vardır.
- Ince bağırsağa arter paralel 4-5 mm'lik bölümü izole edin. Ince bağırsağın içine gömmek tüm 5. sipariş dalları görselleştirmek ve biraz uzakta şube kökenli onları kesip bir kısmını korumak. Şube Bunlar korunmuş kısımları sonradan kanülasyon rehberlik, bir perfüzyon odasına arter segmentleri aktarmak için (diseksiyon forseps ile) siteleri tutan ve olarak hizmet vermektedir.
- Ardından 2 kesi uzak yaparak arter segmentleri kesti5. sipariş arterin her tarafında şube ve perfüzyon odasına transfer (Şekil 1C ve efsane bakınız).
- (: 100-150 mikron çap) diseksiyon forseps ile arteriyel segmentinin ipuçları tutarak diseksiyon forseps kullanarak cam mikropipet biri gemilerin bir ucunu cannulate. Kanüle ucuna önceden yüklenmiş kısmen kapalı dikiş kaydırın ve emniyete alın. Not: arterin yakın ucu in situ ortamda taklit etmek servo kontrollü basınç ayar cihazına bağlı olan bir cam kanül üzerine kanüle edilebilir.
- Bir diseksiyon çözüm kanül ve stopcock bağlayan tüp diseksiyon çözüm şırınga bu birleşir gibi bu kanül bağlı stopcock 10 ml şırınga yüklenen takın. Yavaşça şırınga yükseltmek. çözüm üzerinde yerçekimi kuvveti geminin açık ucundan içi damar kanı kaldıracaktır. Intra-arteriyel kan ayrılmasından sonra, Stopcock kapatın.
Alternatif, basınç denetleyicisi stopcock takın açın ve yavaşça aynı sonucu elde etmek 5-10 mm Hg basıncı artırmak Not:. - Dikkatle arteryel segmentin çözülmüş ucuna mümkün olduğunca yakın, diğer bir kanül getirerek bir ikinci cam kanül üzerine kapların uzak ucunu bağlayın. Kanüle ucuna önceden yüklenmiş kısmen kapalı dikiş kaydırın ve emniyete alın. Bakım römorkör veya arteriyel segmentler çekmeyin alınmalıdır. Her iki kanüller bağlı stopcocks kapalı olduğundan emin olun.
- Canlı video kaydı ile donatılmış inverted mikroskop aşamasına perfüzyon odasına aktarın.
- Bir servo kontrollü basınç düzenleyici cihazı arteryel segmentin yakın ucuna bağlı kanülün Stopcock bağlayın ve stabil lümen içi basıncını korumak için kapalı kalır musluk için diğer kanüle takılı olduğundan emin olun.
- Daha sonra, emiş ağzı a vakum boru eklemeknd perfüzyon odasının perfüzyon portuna tüp.
Not: Eğimli iğne noktası perfüzyon için emme ve künt bir iğne bağlantı noktası için kullanılır. - Tek satır içi çözüm ısıtıcı ile sıcak PSS ile geminin perfüzyon başlatın (37 ° C, gaz karışımı ile dengelenmiş: nötr pH ve yeterli oksijenasyonu 17 korumak için% 5 CO 2,% 5 O 2 ve% 90 N) 2 ml / dak kullanarak bir peristaltik pompası. Da vakumu açın. Sürekli sıcaklığını izlemek için odasında bir termistör yerleştirin.
- Odasında PSS sıcaklığı yaklaştığında ~ 37 ° C (genellikle 5 dakika içinde), yavaş yavaş 20 ila 100 mmHg intraluminal basınç artışı ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin damarları. Bu basınç regülatörü otomatik basınç ayarı kullanılarak yapılır. Sızıntı ile gemiler atın ve başka bir segment ile değiştirin. sızıntıları ile gemiler baskıyı tutmak mümkün olmayacaktır.
- 100 mmHg basıncı korurken virajlı için arteriyel segmenti değerlendirin.Vida kolu kullanarak, arteriyel segmentinde düzeltmek için kanül taşıyın. Üzerinde arter segmentleri germeyin; Gol in vivo arter segmenti uzunluğu taklit etmektir.
- 70 mmHg basıncı azaltmak (mezenterik çarşı 18 in vivo basınç taklit etmek) ve arteriyel segmenti stabilize ve miyojen sesi geliştirmeye olanak sağlar. Arterler (40-70 mmHg), deneysel strateji ve vasküler yatağa göre değişken basınç altında olabilir. Önceden yayınlanmış yorum farklı vasküler yatak 8'den arter segmentlerinde MT değişkenlik mükemmel bir inceleme sağlar.
Arter Çap 6. Ölçümü
- Tek renkli bir görüntü şarj çiftli aygıt kamera ile donatılmış bir mikroskop 10X objektif View at arterler. Video kare kapmak ve gerçek zamanlı kenar algılama sistemi kullanılarak lümen çapı ölçün. Kullanılan ekipman bir listesi, Tablo 3'te verilmektedir.
- Monitör ve kayıt damar dsürekli iameter.
- MT gelişmesi için gözlemleyin. Not: sıçan mezenterik direnç arterlerde, 70 mmHg, MT geliştirme çapında% 20 azalma ~ ile karakterize olduğu görülmektedir. MT damar yatak ve hayvan türlerine göre değişir.
- 1 mcM fenilefrin (Phe) ve 1 uM asetilkolin (ACh) ile vazokonstriktör ve vazodilatör yanıtları değerlendirerek damar canlılığı onaylayın.
- Her bir deneyin sonunda, 20 dakika boyunca -serbest PSS Ca 2 + arterleri inkübe pasif çapı (PD) belirler.
7. andMyogenic Tepki
- 20 mm Hg basıncı azaltmak ve çapı stabilize etmek için izin verir. Artan adımlar (20, 40, 60, 80 ve 100), intraluminal basınç artış ve her basınç basamağında arterler (genellikle 5 dakika içinde) sabit bir çapı elde etmek için izin verir.
- 20 mmHg intraluminal basıncı azaltmak ve 2 + -ücretsiz PSS 0.39 mM içeren Ca arteriyel segmenti kuluçkayaEGTA ve 0.1 mM SNP. Arteriyel çapı (genellikle 15 dk) stabilize etmek için izin verin.
- 0.39 mM EGTA ve 0.1 mM SNP içeren Ca 2 + -ücretsiz PSS basınç adım yanıtı tekrarlayın.
Verilerin Sonuçlarının ve Hesaplama 8. yorumlanması
- Ca 2+ gözlemlenen çapı yüzde fark aşağıdaki hesaplamaya göre her basınçta 2 + -ücretsiz PSS Ca karşı ihtiva-eden olarak MT hesaplayın:
- Çapı vazomosyon geçiren arter için 1 dakika için plato fazı ortalaması alınarak hesaplanabilir. Ilişkiye göre maksimal gevşeme (% PD) yüzde olarak toplanan verileri Express:% PD = 100 x [ΔD / PD]; ΔD önce ve herhangi bir araştırma bileşik (örneğin, Phe) ilave edildikten sonra çapı arasındaki fark; PD ayrıca pasif çapı (birmaksimal çapı).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tipik bir basınç myograph kurulumunun şematik gösterimi, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kabın iki ucu cam mikropipet ile kanüllenmiş ve her iki tarafta da dikiş ile sabitlenir. Boru ve açık valf yardımı ile, tek bir kanül servo kontrollü bir basınç regülatörü bağlanır; Diğer Kanül, bir kapalı vana bağlanır. odacık bir CCD kamera bağlı bir inverted mikroskop ile gözlenir PSS ve damar çapı değişiklikleri ile perfüze.
70 mmHg basınç arteriyel kademeli bir 2-4 ml / dak arteryel hazne akar ve emilmesi taze hazırlanmış sıcak PSS içinde inkübe edilir. Arter çap izlenir ve videomikroskopi ve kenar algılama yazılımını kullanarak kaydedilir. ~ 40 dakika sonra, arter segmentleri başlangıç çapı (Şekil 2A)% 20-40 oranında, kendiliğinden büzülür. Bizim ellerde küçük sıçan direnç arterler% 25-30 (ortalama vari tarafından daraltmakes ayarları operatör ve arter yatağının göre). Daha sonra fonksiyonel canlılığı ACh (1 uM) ve Phe (1 uM), sırasıyla, (Şekil 2A) için damar genişletici ve vazo-büzücüdür yanıtları ile değerlendirilir. Diğer vazodilatörler kullanılabilir olsa da, ACh endotele bağımlı damar genişlemesini uyarıcı ve böylece her iki endotelyal gibi vasküler düz kas canlılığının değerlendirilmesinde yararlıdır. Daha sonra arter kademeli bir PSS yeniden inkübe edildi ve çapı stabilize sonra, deney için hazır hale gelir. Her bir deneyin sonunda, arter segmentleri PD (Şekil 2B) ölçmek üzere Ca2 + serbest PSS içerisinde inkübe edilir. Şekil 2A ve 2B içinde kaydedilen çapları Şekil 2C'de tablolaştırılmıştır. Mutlak MT PD ve 70 mmHg spontan vazokonstriksiyon üzerine elde edilen istikrarlı çapı arasındaki farktır. Bu nedenle, gösterilen izleme gözlenen MT PD% 33'tür. Burada görüldüğü gibi, ACh (1 uM) yanıt ge Ca2 + serbest PSS için gözlenene benzer bir nerally. Damar genişlemesi değerlendiren deneyler, bir vazokonstriktör önceden ilavesi gerekli olabileceğine dikkat edin.
Miyojenik tepkisini belirlemek için, sıçan mezenterik arter segmentleri 20 ve 100 mm Hg arasında lümen içi basıncı adım artan tabi tutulur. Bir örnek, Şekil 3A'da gösterilmiştir. arterler, her aşama (; kesikli çizgiler ~ 5 dakika) sonra sabit bir çapa elde etmek için izin verilmiştir. Daha sonra, aynı arter kademeli 0.39 mM EGTA ve 0.1 mM SNP (Şekil 3A) ile -serbest PSS Ca2 + basınç yanıtı tabi tutulur. Her basınç aşamasının sonunda elde çapı bir çizgi grafiği (Şekil 3B) olarak gösterilebilir. MT olarak hesaplanmıştır Ca çapında yüzde farkı 2+ ihtiva-eden Ca vs her basınçta 2+ -ücretsiz PSS hattı veya çubuk grafik (Şekil 3C) olarak gösterilebilir.
nt "fo: keep-together.within sayfa =" always ">
Şekil 1: Basınç myograph set-up bir örneği (A) anahtar bileşenleri gösterilir.. Tüm ekipman listesi için bakınız Tablo 3. Bir sylgard kaplı çanak tutturulmuş (B) Hasat mezenterik yatak gösterilir. Mezenterik arter çarşı (C) Bir karikatür gösterilir. Siyah noktalar pin pozisyonları temsil etmektedir. kesik bölüm disseke gereken bir arteriyel parçasını temsil eder. Küçük yeşil çubuklar arter üzerinde kesi siteleri göstermektedir. Daha büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
/ftp_upload/50997/50997fig2.jpg "/>
Şekil 2: 70 mmHg basınç altında (a) izleme ile gösterildiği gibi, fareler küçük mezenterik arter çapı, kendiliğinden azalır. ACh (1 uM) ilavesi, (yakın başlangıç çapma) çapı yükselmiştir. Doku banyosuna Phe (1 uM) ilavesi, arter çapını azaltır. Ca 2+ (B) inkübasyon -ücretsiz PSS arteriyel çapı artar. (C) Çeşitli A'da gösterilen Perfüzatlar ve Yatak tek bir basınçlı atardamar segman çapı tablolaştırılmıştır.
Şekil 3: PSS varlığı ve Ca 2 + -ücretsiz içinde aşamalı olarak intraluminal basınç artırırken (A) Arteriyel çapı sürekli kaydedilirPSS. Her basınç adımında elde arter çapı (B) Hat eğrisi. MT (C) Bar grafiği her basınç aşamada elde etti. Daha büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik adımlar, sorun giderme ve modifikasyonları
Tipik bir izobarik damar hazırlık olarak, arter sıcak (37 ° C) PSS ile perfüze iki cam kanüller arasında 70 mmHg basınç altındadır. 30-45 dakika sonra, arterler 20-30 dk stabilize çapında kendiliğinden azalma ile karakterize, MT gelişir. çeşitli vasküler yataklar direnç arterler değişken MT geliştirmek. Cremastric arterler PD MT ~% 40 elde edebilir ise örnek sıçan direnci için mezenterik arterler, ~ PD% 25 MT geliştirmek. 60 dakika içinde MT geliştirmek değil arterler atılmalı; Bu süre vasküler yatağa ve türlere göre farklılık gösterebilir. Yetersiz yanıt veren Arterleri Phe ve ACh da atılmalıdır.
pH ve PSS sıcaklığı MT gelişimi üzerinde önemli bir etkiye sahip. havalandırma olmadan uzun süre oturur PSS, pH artabilir. Buna ek olarak, oda sıcaklığında arterler d olasıevelop MT. Bu nedenle, PSS sürekli olarak izlenir ve bir akış ısıtıcı kullanılarak ~ 37 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir perfüzyon odasına protokol bölümü ve sıcaklık belirtilen gaz karışımı ile mümkün olan en kısa sürede havalandırılmalıdır.
Bu deneyler süresi 3-5 saat olduğundan, perfüzyon odaları ve ilgili boru uzun süre PSS maruz; tuz-çökeltiler sonraki deneylerde engel olabilir odası ve boru hem de kurabilirsiniz. Bu nedenle iyice perfüzyon odasına yıkayın ve her bir deney sonra de-iyonize su ile boru durulanması önemlidir. Benzer şekilde, bakım iyice her diseksiyonu sonrası de-iyonize su ile diseksiyon için kullanılan sylgard kaplı çanak temizlemek için alınmalıdır.
Sınırlamalar
Önemine rağmen, PM çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, kolektif maliyet temin PM ekipman yüksektir (~ 22.000 $) ve la kesin engelleyici olabilirbs; ekipmanın ayrıntılı listesi Tablo 3 'de gösterilmiştir İkinci olarak, taze teneke çok deneyler için ihtiyaç vardır.; dolayısıyla yeni bir hayvan toplam maliyeti ekleyerek, her deney için ötenazi. Küçük mezenterik arterlerin Üçüncüsü, diseksiyon sıkıcı ve böyle hasar eğilimli diseksiyon mikroskop ve mikrodisseksiyonla araçları gibi diğer araçlar gerektirir. Dördüncüsü, bir öğrenme eğrisi vardır; uzmanlık kazanıyor ve bir laboratuarda PM kuran özel personel, zaman ve çaba gerektirir.
Diğer yöntemler ve gelecek uygulamalar ile ilgili önemi
ICD, ve izometrik deney protokolleri vasküler reaktivitesini tespit etmek için kullanılan iki ana yaklaşım vardır. Izobarik preparasyonlarının aksine olarak, izometrik preparasyonlarda vazoaktivitesi tel myograph sistemi kullanılarak, vasküler düz kas gerginliği ölçülerek belirlenir. Bu iki deney protokolleri için gerekli ekipman farklılıklara ek olarak, agonist-ınduced kasılma büyüklüğü, zaman akışı ve damar duvarı gerilim 11,19 yönüne ilişkin bu deneysel yaklaşımlar arasında farklıdır. Çünkü teknik kolaylıklar ve sınırlamaları, her iki hazırlıklar önemli roller hizmet vermektedir. Bu izometrik hazırlıkları mikroskobik odak sağlamak daha kolaydır çünkü Örneğin, genellikle vasküler reaktivite ve damar düz kas Ca 2 + değişiklikleri eş zamanlı ölçümü için kullanılır. Öte yandan, miyojenik aktivitesi en yakın in vivo fizyolojik durumu taklit etmek için kabul edilir basınçlı preparatlar olarak değerlendirilir. Bu hazırlıklar arasında farklılıkların detaylı yorum, daha önce 19 sağlanır.
Sonuç olarak, basınç myography yakın fizyolojik koşullarda küçük direnç damarlarında miyojenik tepkisini incelemek için güvenilir bir tekniktir. Sınırlamalarına karşın PM değişiklikleri anlamada önemli katkılar sağlamıştırnormal ve patolojik koşullarda 3-7,20-23 vasküler fonksiyonu. Sistemik vasküler tonusu Yönetmelik son derece karmaşık ve dolayısıyla in vivo vasküler yatak tonunu düzenleyen özel mekanizmaların rolü izole yerel ve nöro-hormonal faktörler zor içerir. Bu bağlamda, ex vivo basınçlı arteriyel hazırlıkları mükemmel olarak temsilciler hizmet vermektedir. MT içi ve kas yanıtının transdüksiyon mekanizmaları ile ilgilenen olanlar, daha önce yayınlanmış mükemmel değerlendirmeleri 15,19 adlandırılır. Gelecekte biz miyojenik yanıt ve Ca gibi aşağı haberciler değişikliklerin değerlendirilmesi entegre 2+ biz ekipman maliyetlerinde azalma görebilirsiniz olacağını son derece düşüktür olmasına rağmen ekipman gelişmeleri görebilirsiniz. Bu teknik, çeşitli arka plan ile bilim adamları tarafından kabul edilir gibi Ancak, biz büyük olasılıkla böyle siroz, de olduğu gibi hipertansiyon, diyabet ve şok dışındaki hastalıklarda mikrovasküler fonksiyon değişiklikleri değerlendirmek için kendi uygulamasını göreceksinizdemans vs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çatışmalar var.
Acknowledgments
Sandeep Khurana NIH (K08DKO81479) tarafından desteklenmektedir. Vikrant Rachakonda (T32DK067872) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chemical | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MOPS | Sigma Aldrich | M5162 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium nitroprusside | Sigma Aldrich | 13451 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma Aldrich | S9638 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Composition of Experimetnal solutions | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CCD Monochrome Camera | The imaging Source | DMK 21AU04 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thermistor | Warner Instruments | 64-0108 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dual automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fluorescence System Interface | IonOptix | model FSI-700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Forceps and scissors | World Precision Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ion Wizard-Core and Analysis | IonOptix | Ion Wizard 6.0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Laboratory tubing | Silastic | 508-005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Male Sprague Dawley rat | Harlan Laboratories | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Master flex console drive | Cole-parmer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Milli-Q Plus Ultrapure Water System | Millipore | ZD5211584 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Ethicon | 9007G | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Photometry and Dimensioning Microscope | Motic | AE31 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Stereomicroscope | Nikon Instruments Inc | SMZ660 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW120-6 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microforge | Stoelting | 51550 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 3. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Christensen, K. L., Mulvany, M. J.
- Rietzschel, E. R. Oxidized low-density lipoprotein cholesterol is associated with decreases in cardiac function independent of vascular alterations. Hypertension. 52, 535-541 (2008).
- Hill, M. A., Ege, E. A. Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats. Effect of aminoguanidine treatment. Diabetes. 43, 1450-1456 (1994).
- Osol, G., Cipolla, M. Interaction of myogenic and adrenergic mechanisms in isolated, pressurized uterine radial arteries from late-pregnant and nonpregnant rats. Am J Obstet Gynecol. 168, 697-705 (1993).
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28, 176-180 (1997).
- Ren, Y., et al. Enhanced myogenic response in the afferent arteriole of spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1769-H1775 (2010).
- Hayashi, K., Epstein, M., Saruta, T. Altered myogenic responsiveness of the renal microvasculature in experimental hypertension. J Hypertens. 14, 1387-1401 (1996).
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96, 313-326 (1999).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J Vis Exp. , (2011).
- Buus, N. H., Vanbavel, E., Mulvany, M. J. Differences in Sensitivity of Rat Mesenteric Small Arteries to Agonists When Studied as Ring Preparations or as Cannulated Preparations. British Journal of Pharmacology. 112, 579-587 (1994).
- Falloon, B. J., Stephens, N., Tulip, J. R., Heagerty, A. M. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am J Physiol. 268, H670-H678 (1995).
- Schubert, R., Wesselman, J. P. M., Nilsson, H., Mulvany, M. J. Noradrenaline-induced depolarization is smaller in isobaric compared to isometric preparations of rat mesenteric small arteries. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 431, 794-796 (1996).
- Khurana, S., Raina, H., Pappas, V., Raufman, J. P., Pallone, T. L. Effects of deoxycholylglycine, a conjugated secondary bile acid, on myogenic tone and agonist-induced contraction in rat resistance arteries. PLoS One. 7, e32006 (2012).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 28, 220-231 (1902).
- Hughes, J. M., Bund, S. J. Arterial myogenic properties of the spontaneously hypertensive rat. Exp Physiol. 87, 527-534 (2002).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Raina, H., Zacharia, J., Li, M., Wier, W. G. Activation by Ca2+/calmodulin of an exogenous myosin light chain kinase in mouse arteries. J Physiol. 587, 2599-2612 (2009).
- Fenger-Gron, J., Mulvany, M. J., Christensen, K. L. Mesenteric blood pressure profile of conscious, freely moving rats. J Physiol. 488 (Pt 3), 753-760 (1995).
- Davis, M. J., Hill, M. A. Signaling mechanisms underlying the vascular myogenic response). Physiol Rev. 79, 387-423 (1999).
- Osmond, J. M., Mintz, J. D., Dalton, B., Stepp, D. W. Obesity increases blood pressure, cerebral vascular remodeling, and severity of stroke in the Zucker rat. Hypertension. 53, 381-386 (2009).
- Ge, Y., et al. Endogenously produced 20-HETE modulates myogenic and TGF response in microperfused afferent arterioles. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 102-103, 42-48 (2013).
- Ryan, M. J., et al. Placental ischemia impairs middle cerebral artery myogenic responses in the pregnant rat. Hypertension. 58, 1126-1131 (2011).
- Bagi, Z., et al. Type 2 diabetic mice have increased arteriolar tone and blood pressure: enhanced release of COX-2-derived constrictor prostaglandins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 1610-1616 (2005).
