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Biology

बर्फ़ीली मानव ES कक्ष

doi: 10.3791/50 Published: October 12, 2006

Summary

यहाँ हम प्रदर्शन कैसे हमारी प्रयोगशाला hues मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइनों जमा देता है.

Abstract

यहाँ हम प्रदर्शन कैसे हमारी प्रयोगशाला hues मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइनों जमा देता है. एक स्वस्थ, तेजी से विस्तार संस्कृति पीबीएस के साथ धोया जाता है अवशिष्ट मीडिया हटायें है कि अन्यथा trypsin प्रतिक्रिया बुझाने सकता. वार्म 0.05% trypsin EDTA तो कोशिकाओं को कवर जोड़ा जाता है, और थाली करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते की अनुमति दी. इस समय के दौरान कोशिकाओं को इकट्ठा मनाया जा सकता है, और कालोनियों बंद थाली सतह उठाने. कोमल दोहराया pipetting थाली की सतह से कोशिकाओं और कालोनियों निकाल देंगे. Trypsinized कोशिकाओं को एक मानक शंक्वाकार शेष trypsin बुझाने के लिए पूर्व गर्म HES सेल मीडिया युक्त ट्यूब में रखा जाता है, और फिर घूमती है. कक्ष मीडिया, जैसे कि एक जमे हुए विभाज्य एक 10cm थाली पर एक संस्कृति को जीवित करने के लिए पर्याप्त है एकाग्रता की एक एमएल में लगभग एक लाख की कोशिकाओं के एक एकाग्रता में वृद्धि मीडिया resuspended हैं. बाद कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से resuspended हैं, बर्फ ठंड ठंड मीडिया बराबर मात्रा में जोड़ा जाता है. सेल निलंबन अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं, ठंड शीशियों में aliquoted, और धीरे धीरे 24 घंटे से अधिक-80C फ्रीज की अनुमति दी. जमे हुए कोशिकाओं तो दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के भाप चरण के लिए चले गए, कर सकते हैं या लगभग छह महीने के लिए -80 में रहते हैं.

Protocol

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  1. एक स्वस्थ, तेजी से विस्तार संस्कृति पीबीएस के साथ धोया जाता है अवशिष्ट मीडिया हटायें है कि अन्यथा trypsin प्रतिक्रिया बुझाने सकता.
  2. वार्म 0.05% trypsin EDTA तो कोशिकाओं को कवर जोड़ा जाता है, और थाली करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते की अनुमति दी. इस समय के दौरान कोशिकाओं को इकट्ठा मनाया जा सकता है, और कालोनियों बंद थाली सतह उठाने.
  3. कोमल दोहराया pipetting थाली की सतह से कोशिकाओं और कालोनियों निकाल देंगे.
  4. Trypsinized कोशिकाओं को एक मानक शंक्वाकार शेष trypsin बुझाने के लिए पूर्व गर्म HES सेल मीडिया युक्त ट्यूब में रखा जाता है, और फिर घूमती है.
  5. कक्ष मीडिया के एक एमएल में लगभग एक लाख की कोशिकाओं के एक एकाग्रता में वृद्धि मीडिया resuspended हैं.
  6. बाद कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से resuspended हैं, बर्फ ठंड बर्फ़ीली मीडिया बराबर मात्रा में जोड़ा जाता है.
  7. सेल निलंबन अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं, ठंड शीशियों में aliquoted, और धीरे धीरे 24 घंटे से अधिक-80C फ्रीज की अनुमति दी.
  8. जमे हुए कोशिकाओं तो दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के भाप चरण के लिए चले गए, कर सकते हैं या लगभग छह महीने के लिए -80 में रहते हैं.

नोट: 106 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में इस तरह के एक जमे हुए विभाज्य एक 10cm थाली पर एक संस्कृति को जीवित करने के लिए पर्याप्त है.

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Discussion

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तकनीक हम ठंड hues सेल लाइनों के लिए का वर्णन कुशलतापूर्वक भंडारण और resurrecting hues सेल और भी हित के किसी भी स्तनधारी सेल लाइनों के लिए अच्छी तरह से काम करता है. प्रत्येक बीतने पर कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात बर्फ़ीली एक महत्वपूर्ण विचार है जब HES सेल लाइनों के साथ काम के रूप में karyotype असामान्यताएं पैदा होती है और असामान्य कोशिकाओं को जल्दी से खत्म लाइन ले जा सकते हैं कर सकते हैं. इस प्रकार, जमी होने के बड़े बैंकों को अतिरिक्त हर बीतने पर कुछ अंश पर विभाजन उच्च वांछनीय है.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HuES Medium medium For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium medium 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.

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References

  1. Forthcoming.
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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).More

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).

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