Summary
Vi beskriver den agar-pärlor metod för att etablera ihållande långtids kronisk Pseudomonas aeruginosa luftvägsinfektion i musmodell.
Abstract
En musmodell av kronisk luftvägsinfektion är en viktig tillgång i cystisk fibros (CF) forskning, även om det finns ett antal frågor om själva modellen. Tidiga faser av inflammation och infektion har studerats i stor utsträckning med hjälp av Pseudomonas aeruginosa agar-pärlor musmodell, medan endast ett fåtal rapporter har fokuserat på den långsiktiga kronisk infektion in vivo. Den största utmaningen för långsiktig kronisk infektion förblir låga bakteriella bördan av P. aeruginosa och den låga procentandelen av infekterade möss veckor efter utmaning, vilket indikerar att bakterieceller progressivt rensas av värden.
Denna uppsats presenterar en metod för att erhålla en effektiv långsiktig kronisk infektion hos möss. Denna metod är baserad på inbäddning av P. aeruginosa kliniska stammar i agar-kulor in vitro, följt av intratrakeal instillation i C57Bl/6NCrl möss. Bilateral lunginfektion är förknippad med sevmänna mätbara avläsningar inklusive viktminskning, dödlighet, kronisk infektion, och inflammatorisk reaktion. The P. aeruginosa RP73 klinisk stam drogs över PAO1 referenslaboratorium stam eftersom det resulterade i en jämförelsevis lägre dödlighet, mer allvarliga skador, och senare kronisk infektion. P. aeruginosa kolonisering kan kvarstå i lungan i över tre månader. Murina lungpatologi påminner om CF-patienter med avancerad kronisk lungsjukdom.
Denna musmodell efterliknar närmast loppet av sjukdomar hos människan och kan användas både för studier av patogenes och för utvärdering av nya terapier.
Introduction
Cystisk fibros (CF) är en genetisk sjukdom som orsakas av mutationer i cystisk fibros transmembran-(CFTR)-genen. Denna gen kodar för en kloridkanal som uttrycks på membranet hos de flesta epitelceller. Bronkiektasi, slem pluggning och parenkymal förstörelse som orsakas främst av Pseudomonas aeruginosa infektioner successivt leda till allvarlig lungsjukdom och dödlighet i de flesta CF-patienter 1. Förstå CF patogenes och vidareutveckling av nya terapier beroende av djurmodell med karakteristiska dragen i CF. Flera möss, genetiskt modifierade för CFTR-genen, har genererats, men begränsningar i möjligheterna för dessa arter att rekapitulera CF-liknande lungsjukdom och flera andra avvikelser orgel ses i CF-patienter har väldokumenterat 2.
Utveckling av infektion är en av de stora utmaningarna i CF djurmodell. Litteratur cltidigt antyder att en kronisk infektion som varar mer än en månad kan endast uppnås om möss ympas med bakterier inbäddade i ett immobiliseringsmedel såsom agar, agaros, eller tång alginat 3-5. Dessa immobiliseringsmedel ge mikroaerob / anaeroba förhållanden som gör att bakterier att växa i form av mikrokolonier, på samma sätt som tillväxten i slem i CF-patienter 6. Denna modell av kronisk infektion leder till ihållande bakterier i lungorna som orsakar luftvägsinflammation och skada 7. Men beroende på vilken metod som används, den bakteriestam och dosen ympas i lungorna, kan andelen kroniskt infekterade möss och bakteriehalten återfanns i lungorna vid olika tidpunkter varierar avsevärt. I synnerhet den största utmaningen för långsiktig kronisk infektion förblir låga bakteriebördan av P. aeruginosa och den låga procentandelen av infekterade möss veckor efter utmaning, vilket indikerar that bakterieceller successivt rensas av värden. Genom att välja P. aeruginosa RP73 klinisk stam från en samling av CF isolerar 8 vi framgångsrikt fått låg dödlighet, mer allvarliga skador, och hög andel av kronisk infektion med en stabil bakteriehalten upp till en månad i C57Bl/6NCrl möss.
Detta dokument specificerar metoden för inbäddning P. aeruginosa i agar kulor, vi har infekterade möss med intratrakeal instillation, mätt bakteriehalten och cytokiner i lungorna, samlas BAL vätska och utfört histologisk undersökning. Sammantaget kommer detta protokoll hjälpa forskare att ta itu principiellt viktiga frågor om patogenes 8,9 och testa nya terapier mot P. aeruginosa kronisk infektion 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Bakterier för kronisk infektion (Tre och två dagar före Mouse Challenge)
- Välj lämplig P. aeruginosa-stam som skall testas.
- Ympa en ögla med P. aeruginosa från en -80 ° C stamkultur till ett Trypticase Soy Agar (TSA) plattan och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Plocka en enda koloni och ympa in i 5 ml Trypticase sojabuljong (TSB) i en 15 ml snap-capped röret och inkubera vid 37 ° C över natt i ett skakande inkubator vid 200 rpm.
2. Bädda Bakterier i Agar Pärlor för kronisk infektion (en dag före infektion)
- Ta en liten alikvot av bakterie odling över natten, späd 1:50 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och mäta den optiska densiteten (OD) vid 600 nm.
- Späd natten bakteriekultur genom att tillsätta 2 OD i en ny kick-begränsade rör som innehåller 20 ml av färsk TSB.
- Inkubera vid 37 ° C i ungefär 3 -4 h till log-fas i ett skakande inkubator vid 200 rpm, tills totalt 10-15 OD nås.
- Under tiden förbereda TSA, tillverkat av TSB med 1,5% agar, autoklav och jämvikt vid 50 ° C i ett vattenbad. Jämvikta 150 ml preautoclaved tung mineralolja i en Erlenmeyer-kolv vid 50 ° C i ett vattenbad.
- När P. aeruginosa når logfas, samla bakteriecellerna genom centrifugering vid 2700 x g under 15 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Resuspendera bakteriell pelleten i 1 ml steril PBS och skaka ordentligt för att suspendera pelleten helt.
- Blanda 1 ml bakteriesuspension med 9 ml flytande TSA förjämviktad vid 50 ° C.
- Tillsätt 10 ml TSA-P. aeruginosa blandningen till tung mineralolja (förvärmd vid 50 ° C) och omedelbart rör om under 6 minuter vid rumstemperatur. Omröringen måste producera en synlig virvel i oljan.
- Kyl blandningen till 4 ° C, under omröring vid den lägsta spBehov för 35 min (fig 1).
- Vila agar-pärlor-oljablandningen i is under ytterligare 20 min.
- Överför agar-pärlor i 50 ml Falcon-rör och centrifugera vid 2700 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- Noggrant avlägsna mineraloljan och tvätta med steril PBS sex gånger, såsom beskrivs i steg 2,11. Efter tre tvättar, kan pärlorna pelleteras genom gravitation istället för att använda centrifugen. Efter den sista tvättningen, resuspendera agar-pärlor i 20 till 30 ml PBS.
- Tag en alikvot av pärlorna (ungefär 0,5 ml) och aseptiskt homogenisera.
- Ta 100 pl av de homogeniserade pärlor och utspädd i 900 | il av steril PBS. Seriellt utspädd 1:10 ner till 10 -6.
- Plansch serieutspädning på TSA-plattor, inklusive outspätt prov ner till 10 -6 och inkubera plattorna vid 37 ° C.
- Mät pärldiameter med ett inverterat ljusmikroskop inom flera områden. Den pärla diameter ska vara mellan 100-200 nm (
- Förvara pärlorna över natten vid 4 ° C.
Figur 1. Översikt av agar pärlor förberedelse och mus infektion. P. aeruginosa-celler återsuspenderas i 1 ml PBS och sattes till 9 ml flytande TSA (50 ° C). Denna blandning sattes till 150 ml tung mineralolja vid 50 ° C i en kolv och omrördes vid hög hastighet under 6 minuter vid rumstemperatur. När kolven kyles till 4 ° C med långsam omröring under 35 minuter stelnar ägarn skapar pärlor, och bakterier som finns i blandningen är inbäddade i ägarn pärlor. Detalj av en agar pärla innehållande bakteriella celler visas (A). Efter att mineralolja med flera tvättar med steril PBS, är redo f den agar-pärlor fjädringeller ympning i lungorna hos möss med en intratrakeal injektion (B). Klicka här för att visa en större bild .
3. Möss Utmaning med agar-pärlor
Etik uttalande: Detta protokoll och experimenterande följer riktlinjerna från djuromsorg och etiska kommittén i San Raffaele Scientific Institute.
- Räkna antalet kolonibildande enheter (CFU) på TSA-plattor för att bestämma antalet CFU / ml i agar-pärlor suspension. Späd agar-pärlor med steril PBS till 2-4 x 10 7 CFU / ml för att uppnå ett optimalt inokulum av 1-2 x 10 6 i 50 | il.
- Bedöva C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 veckor gamla) möss av hankön med ketamin (50 mg / ml) och xylazin (5 mg / ml) i 0,9% NaCl administrerades i en volym av 0,002 ml / g kroppsvikt av intraperitoneal injektion.
OBSERVERA: Anesthesia anses adeqdera när djuret stannar fortfarande tyst, inte svarar på yttre stimuli, och har konstant hjärta och andningsfrekvens. - Placera musen i ryggläge. Desinficera pälsen av musen med 70% etanol.
- Exponera luftstrupen genom ett vertikalt snitt i huden och utföra intubation i luftstrupen med en steril, flexibel 22 G 0,9 mm x 25 mm-IV-kateter, hålla uppmärksamhet att avlägsna stylette medan den rör sig nedåt in i luftstrupen. In katetern inte alltför djupt in i luftstrupen. Stanna innan carina (bifurkation).
- Omedelbart ta en volym på 50 pl agar pärlsuspension med en 1 ml spruta och fäst den i katetern. Tryck försiktigt in kolven i sprutan, vilket gör att pärlorna som ska implanteras i lungan. Stäng snittet med användning suturklämmor.
- Placera djuret på en värmedyna tills helt vaken.
4. Möss Utvärdering
- Observera mössen dagligen för kliniska tecken inklusive pälskvalitet, kroppshållning,förflyttningar, och vätskestatus. Övervaka dagliga kroppsvikt. Möss som förlorar ≥ 20% av kroppsvikten måste avlivas.
- Följ Point 5 för uppsamling av bronkoalveolär lavage (BAL) och Poäng 6 eller 7 för insamling av lungor och analysen av total CFU, histologisk analys, inflammatoriskt svar i form av total-och differential celler i BAL, cytokin-analys, och myeloperoxidas (MPO) aktivitet.
5. BAL Fluid Insamling och analys
- Euthanize mössen genom CO2 inhalering.
- Placera musen i liggande ställning. Desinficera pälsen av musen med 70% etanol.
- Exponera luftstrupen och bröstkorgen med ett vertikalt snitt i huden. Exponera lungorna genom att skära membranet.
- Sätt i en sutur tråden under luftstrupen med hjälp av pincett och intuberas luftstrupen med en steril, flexibel 22 g 0,9 mm x 25 mm IV kateter. Dra de två ändarna av suturen tråd att binda catheter till luftstrupen och knyt tråden runt luftstrupen.
- Ta en volym på 1 ml RPMI 1640 med hjälp av en 1 ml spruta och fäst den i katetern. Tryck på kolven i sprutan för att tvätta lungorna och omedelbart återställa vätskan, lagra den i ett 15 ml rör.
OBS: Om cytokiner ska analyseras, lägg proteashämmare till RPMI 1640. - Upprepa detta steg tre gånger med totalt 3 ml RPMI. Från och med nu, lagra BAL vätska på is. Gå till steg 6 för insamling och analys av lungor.
OBS: Observera att inte all vätska kommer att hämtas (2,8 ml maximalt). - För kvantifiering av bakterier som finns i BAL-vätskan, prova en liten alikvot (300 | il), seriellt utspädda 1:10 i steril PBS, platta på TSA-plattor och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Räkna totala celler med ett inverterat ljus optiskt mikroskop att späda en alikvot av BAL-vätskan 1:02 med Tuerk lösning i en Burker-cellantal kammaren.
- Centrifugera remaining BAL-vätskan vid 330 xg under 8 minuter vid 4 ° C. Ta supernatanten för ELISA cytokin analys, lagra den vid -80 ° C. Följ stegen 5,10-5,13 för differentialräkning cell genom cytospin.
- Om pelleten är rött, lysera erytrocyter återsuspendering av pelleten i 250-300 pl av lyseringsbuffert späddes 1:10 i ultrarent destillerat vatten under 3 min. Neutralisera med 2 ml PBS och centrifugera vid 330 xg under 8 minuter vid 4 ° C.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i RPMI 10% fetalt bovint serum (FBS). Använd en volym som kommer att ge en x 10 6 celler / ml, baserat på det totala celltalet.
- Placera objektglas och filter i lämpliga springor i cytospin med pappfilter vända mitt på cytospin. Tillsätt 150 l av varje prov i lämpliga brunnar i cytospin och centrifugera i en cytocentrifug vid 300 xg under 5 minuter.
- Färga diabilder från Romanowsky färgning hjälp av ett kommersiellt kit, enligt maverkaren instruktioner och såsom beskrivits tidigare 12. Följ stegen 5,14-5,17 för MPO aktivitetsanalys.
- Centrifugera den återstående volymen av BAL vid 380 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 250 | il av hexadecyltrimetylammonium-klorid 0,5% i ultrarent destillerat vatten för att lysera cellerna. Suspensionen kan frysas vid -20 ° C under flera dagar innan analysen utförs.
- Centrifugera vid 16.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C och använd supernatanten för att utföra MPO-analys i 96-brunnars plattor, tillsätta provet i duplikat till varje brunn och om så behövs, också lämpliga spädningar av provet.
- Lägg till varje prov i brunnarna en lika volym av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB) som substrat för peroxidas. Låt reaktionen äga rum i mörker under åtminstone 5 min och tills ingen ytterligare utveckling av färgen.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 2 MH 2 SO 4 ennd mäta OD vid 450 nm. OD-värdet kommer att vara direkt proportionell mot peroxidasaktivitet.
6. Mätning av bakteriehalten i Lung och cytokinanalys
- Omedelbart efter BAL vätskeansamling, punktskatter lungor från musen, skölj dem i steril PBS, separata lober, lägg dem i en rundbottnad rör med 2 ml steril PBS och förvara på is.
OBS: Om cytokinerna skall analyseras, till proteasinhibitorer till PBS till rören. - Aseptiskt homogenisera lungor, ta en liten alikvot (300 | il) från homogenatet, seriellt utspädd 1:10 i PBS, platta på TSA-plattor och inkubera vid 37 ° C över natten. Observera att den totala luftvägarna bakteriehalten blir summan av CFU som finns i BAL vätska och lunga.
- Centrifugera det återstående homogenatet vid 16000 x g under 30 min vid 4 ° C. Ta supernatanten för ELISA-cytokin-analys, och förvara vid -80 ° C.
7. Histologisk undersökning
<ol>Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När protokollet är gjort på rätt sätt, att P. aeruginosa agar-pärlor kommer att mäta mellan 100-200 nm och kan observeras med ett inverterat ljusmikroskop genom att pipettera en liten volym av agar-pärlor fjädring på en bild. Enstaka bakterieceller är synliga i agarn pärlor, såsom visas i detalj i figur 1.
Valet av P. aeruginosa stam som används i den agar-pärlor förberedelse är viktig figur. 2 och tabell 1 visar de data som erhölls efter infektion av möss med P. aeruginosa PAO1 referenslaboratorium stam jämfört med RP73 kliniska isolat. Dödlighet, observerats inom de första 3 dagarna av infektion, är låg för båda stammarna, men högre för PAO1 (fig. 2A och 2B). Kan konstateras stora skillnader i fråga om andelen kronisk infektion i de överlevande möss mellan PAO1 och RP73 utmanade möss. While vid 3 dagar efter infektion var alla mössen fortfarande infekterade av både P. aeruginosa-stammar, efter denna tid-punkt några möss rensas bakterierna och andra utvecklade en stabil kronisk infektion. Från 7 dagar framåt andelen kroniskt infekterade möss förblev stabilt upp till 28 dagar för båda stammarna. PAO1 leder till kronisk infektion i en procentandel av möss, som varierade mellan 20 till 27,8% (Figur 2A), medan det för RP73 var procenttalet från 75 till 87,1% (figur 2B), vilket indikerar att P. aeruginosa klinisk stam var effektivare i upprättandet av en kronisk infektion jämfört med PAO1 laboratoriestammen. Antalet bakterier vid 3 dagar efter infektion var högre för PAO1 (5 x 10 7 CFU / lunga) (Figur 2C och Tabell 1) jämfört med RP73 (1,3 x 10 6 CFU / lunga) (figur 2D) och sedan från 7 dagar och framåt, då kronisk infektion bildades, stabiliserar bakteriehalten på mellan 10 <sup> 4 och 10 5 CFU / lunga för båda stammarna. När kronisk infektion är etablerad, inte antalet CFU / lunga inte förändras väsentligt under en månad. Dessutom är bakteriehalten i luftvägarna liknande bland möss utmanades med olika bakteriestammar 9,13.
Andra avläsningar, inklusive värdens inflammatoriska svaret och histopatologi, kan mätas vid olika tidpunkter från utmaning figur. 3 visar det inflammatoriska svaret i form av leukocytrekrytering i mus-BAL-vätska 7 dagar från utmaning med P. aeruginosa RP73 klinisk stam inbäddade i agar-pärlor. RP73-infekterade möss jämfört med icke-infekterade möss. Differentiell cellräkning inkluderade neutrofiler, makrofager och lymfocyter. Antalet totala celler är avsevärt högre i RP73-infekterade möss jämfört med icke-infekterade möss. Neutrofiler, i synnerhet, nästan helt frånvarande i BAL vätska av icke-infekterade möss, var de mest represented cellulär typ i RP73-infekterade möss, vilket indikerar en avsevärd reaktion från det medfödda immunförsvaret till kronisk infektion.
Den histopatologiska analysen av lungor från möss, kroniskt infekterade med P. aeruginosa RP73, visar att infektionen är mång fokus. Figurerna 4C och 4F visar en lob som är mer engagerade än andra lober som är opåverkade eller marginellt inblandade (figur 4B och 4E). Pärlor kan observeras i bronkiella lumen och mikrokolonier av bakteriella celler är synliga i pärlorna (fig 4C och 4F). Lung histopatologi i de områden som berörs av infektion visade inflammatoriska skador i bronker och i lungorna parenkymet. De bronker fylldes av en massiv neutrofil inflammation kring kulorna, medan parenkymet infiltrerades av makrofager, lymfocyter och några neutrofiler. Histologi aven icke-infekterade mus användes som en kontroll; både parenkym och bronker var tydliga från inflammatoriska celler (Fig. 4A och 4D).
Figur 2. Tidsförlopp för P. aeruginosa kronisk infektion med PAO1 referensstam och RP73 klinisk stam. C57BL/6NCrl (20-22 g) hanmöss infekterades genom intratrakeal injektion med 1 till 5 x 10 6 CFU av P. aeruginosa-stam PAO1 (A och C) eller RP73 (B och D) som är inbäddade i agar-pärlor. För varje tidspunkt, histogram representerar den procentuella dödligheten inducerad av bakteriemi (röd) och överlevnad (grå) eller andelen djur som rensas infektionen (vit) och de som kan etablera en kronisk infektion (grön) (A och B). Överlevande möss avlivades vid angivna tidpunkter, och lungorna skördades, homogeniserades, och odlades på TSA-plattor för att bestämma bakteriehalten. Tillväxtkurvorna för PAO1 och RP73 stammar i murina lungor visas (C och D). Punkter avser enskilda mätningar och horisontella linjerna representerar medianvärden. Statistisk signifikans av Fishers test indikeras: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Klicka här för att visa en större bild .
Tabell 1. Tidsförlopp för P. aeruginosakronisk infektion med PAO1 referensstam och RP73 klinisk påfrestningar. Procent av dödlighet och av kronisk infektion av PAO1 och RP73 infekterade möss och antalet CFU per lunga (median) visas. Värden väljs 2-4 olika experiment. N, nr. av poolade möss analyseras för varje tillstånd. Statistisk signifikans av Fishers test indikeras: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Utvärdering av inflammation i BAL vätska efter 7 dagar av kronisk infektion med RP73 klinisk stam. (A) Diagrammet visar halten av totalaleukocyter, neutrofiler och monocyter / makrofager återfinns i BAL-vätskan av RP73 kroniskt infekterade möss efter 7 dagar från utmaning jämfört med icke-infekterade möss (kontroll). Medelvärden och SEM är representerade. (B) I rutan nedan pilar anger neutrofiler och makrofager som sett i en plats på en bild efter cytospin. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Hematoxylin och eosin färgning på histologiska snitt av lungorna efter 7 dagar av kronisk infektion med RP73 klinisk stam. Panelen visar hematoxylin och eosin-färgning av lungsektioner av oinfekterade möss (A och D) och möss Challenged med agar-pärlor innehållande RP73 (B, C, E, F). Infektionen är mång focal och generellt medför en eller flera lunglober (C och F), medan de andra är opåverkade eller marginellt involverade (B och E). Pilar indikerar agar pärlor deponeras i bronkerna lumen (b). Linjer (A, B, C) 250 pm,. Linjer (D, E, F) 100 ìm Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska stegen i P. aeruginosa-pärlor förberedelse och mus utmaning redovisas nedan.
The P. aeruginosa-stam som används för möss utmaning är kritisk. Dödlighet, kronisk infektion eller clearance kan skilja sig avsevärt beroende på vilken bakteriestam som används för utmaningen. The P. aeruginosa RP73 klinisk stam drogs över PAO1 referenslaboratorium stam eftersom det resulterade i en jämförelsevis lägre dödlighet, mer allvarliga skador, och senare kronisk infektion. Bör utföras Drogtester i prekliniska studier med P. aeruginosa-stammar utvalda för sin höga effektivitet etablera långsiktiga kronisk infektion. Detta minimerar antalet möss som är förenliga med kraven på vetenskaplig validering och statistisk analys 10,11.
Den individuella P. aeruginosa agar-pärla preparat varierar i storlek och i CFU / ml. En average diameter av 150 ^ m med 2 x 10 7 CFU / ml anses optimal. Bead storlek påverkas av omröringshastigheten under avkylningsfasen (steg 2.9). Pärlor rörs i full fart är små och sfäriska (<50 nm), medan de rörs mycket långsamt stort och amorfa (> 1 mm). Dessutom, när den slutliga utspädningen för utmaningen är beredd, kan pärlor med en låg bakteriehalten vara klibbigt medan de med höga bakteriehalten kan alltför utspädd. Ympning av möss med klibbiga pärlor är förknippad med hög dödlighet på grund av möss kvävning snart efter utmaning, medan alltför utspädda pärlor kan leda till en avsaknad av kronisk infektion. Den optimala volymen av intratrakeal injektion är 50 ^ men högre volymer på upp till 100 l kan ympas. Skillnaderna i dödlighet eller kronisk infektion av möss sällan observerats när det ympade dosen varierar mellan 5 x 10 5 och 5 x 10 6 CFU / mus.
FALLe bakterietillväxtmedium ska användas för agar pärlor bildas. I detta fall, P. aeruginosa var inbäddad i TSA, andra tidningar rapporterade att, Burkholderia cenocepacia ingick i näringsbuljong agar 14,15. Agar pärlor bör ge en microanaerobic miljö med viktiga näringsämnen som bakteriespridning från enstaka celler till mikrokolonier 9.
Andningsansträngnings skiljer sig beroende på anestetisk och dosen som användes, och påverkar dödlighet efter kirurgi. Ketamin i en dos av 0,1 mg / g kroppsvikt andxylazine vid en dos av 0,01 mg / g kroppsvikt är de optimala val. Andning är normalt när möss intuberade med katetern och synligt grundare när möss inokuleras med P. aeruginosa agar-pärlor. Idealt injektionen av P. aeruginosa agar-pärlor bör utföras långsamt med en optimal volym på 50 pl. Högre volymer på upp till 100 l kan leda till högre dödlighetoch större svårigheter att möss återhämtning. Alla möss är tillräckligt infekteras när de utmanas av intratrakeal kirurgi.
The P. aeruginosa RP73 agar pärla-inducerad kronisk lunginflammation visar att i denna modell infektionen är mång fokus och generellt medför en eller flera lunglober utan att äventyra hela lungan. Därför måste utvärderingen av bakteriehalten och inflammatoriskt svar utföras på totala lungan. Analysen av selektiva lober producerar inte giltiga resultat. En oinfekterade grupp möss bör läggas som en kontroll och jämfört med infekterade möss för att upptäcka eventuella avvikelser i cellrekrytering i BAL vätska eller i histologi av lungan på grund av föroreningar eller misstag i förfarandet. Denna modell fastställdes i en BSL-2 laboratorium med all laboratoriepersonal ska utbildas i lämpliga färdigheter för mus observation. Mössen övervakades två gånger per dag för följande parametrar: piloerektion, inställning, Locomotion, andning, nyfikenhet, snuva, grooming och uttorkning. Möss som förlorat ≥ 20% av kroppsvikten och visade tecken på allvarlig klinisk sjukdom, såsom tilltufsad päls, inaktivitet, aptitlöshet, dålig rörelseförmåga, eller smärtsamma arbetsställningar, avlivades före avslutningen av försöket. Möss infekterade med P. aeruginosa RP73 agar-pärlor visade lägre tecken på obehag inom tre dagar från infektion jämfört med PAO1-infekterade möss. Efter denna tidpunkt några möss rensas bakterierna och andra utvecklade en stabil kronisk infektion, som varar upp till 28 dagar.
Vi visade att den modell för kronisk infektion som vi föreslår i denna uppsats kan framkalla en stabil P. aeruginosa kronisk infektion hos möss. Denna metod har optimerats för att studera de molekylära mekanismerna bakom patogenen virulens och värdförsvar 8,9,16 eller för drogtestning av antibakteriella och antiinflammatoriska molekyler 10,11. THan preklinisk validering av dessa föreningar i lämpliga djurmodeller är avgörande för framtida terapeutiska ingripanden för lunginfektioner hos patienter med CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Forskning i Bragonzi laboratorium har finansierats av den italienska Cystisk Fibros Foundation (CFaCore) och EU-F7-2009 till 223.670. En del av detta arbete genomfördes i Alembic, en avancerad mikroskopi laboratorium, och mus histopatologi utfördes i enheten i patologisk anatomi (San Raffaele Scientific Institute).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
- Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).
- Bragonzi, A. Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens. IJMM. 300, 584-593 (2010).
- Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).
- Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia. Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).
- Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres. APMIS. 98, 203-211 (1990).
- Bragonzi, A., et al. Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model. J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).
- van Heeckeren, A. M. Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection. Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM. 180, 138-145 (2009).
- Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).
- Moalli, F., et al. The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.
- Paroni, M. Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment. J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.
- Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators. Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).
- Bragonzi, A., et al. Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence. AJRCCM. In press, (2009).
- Pirone, L., et al. Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains. Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).
- Bragonzi, A., et al. Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response. PLoS One. 7, Forthcoming.
- Bianconi, I., et al. Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection. PLoS Pathog.. 7, (2011).
